방법 논문

대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환에서 지방 침착의 시험관 내 모델링

DOI:

10.3791/66810

⸱

2024년 7월 19일

 ,  ,  ,  , 
1Inner Mongolia Medical University, 2Xilin Gol League Mongolian Medical Hospital, 3National and local Joint Mongolian Medicine R & D Engineering Center, 4Inner Mongolia Minzu University, 5Affiliated Hospital of Inner Mongolia Minzu University, 6Traditional Chinese & Mongolian Medical Research Institute of Inner Mongolia

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문에서는 대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환의 모델로 올레산 유도 HepG2 세포를 사용하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대사 기능 장애 관련 지방성 간 질환(MASLD)의 유병률은 경제 및 생활 패턴의 변화로 인해 급증하여 심각한 건강 문제로 이어지고 있습니다. 이전 보고서에서는 MASLD에 대한 동물 및 세포 모델의 확립을 연구하여 이들 간의 차이점을 강조했습니다. 이 연구에서는 MASLD에서 지방 축적을 유도하여 세포 모델을 만들었습니다. HepG2 세포를 다양한 농도(0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM)의 불포화 지방산 올레산으로 자극하여 MASLD를 모방했습니다. 모델의 효능은 세포 계수 키트-8 분석, Oil Red O 염색 및 지질 함량 분석을 사용하여 평가되었습니다. 이 연구는 MASLD 세포에 대한 작동이 간편한 세포 모델을 만드는 것을 목표로 했습니다. 세포 계수 키트-8 분석 결과에 따르면 HepG2 세포의 생존은 GI50 이 1.875mM인 올레산 농도에 따라 달라지는 것으로 나타났습니다. 0.5mM 및 1mM 그룹의 세포 생존율은 대조군보다 유의하게 낮았습니다(P < 0.05). 또한 Oil Red O 염색 및 지질 함량 분석은 HepG2 세포에서 다양한 올레산 농도(0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM)에서 지방 침착을 검사했습니다. 0.25mM, 0.5mM, 1mM군의 지질 함량은 대조군보다 유의하게 높았다(P < 0.05). 또한, OA 그룹의 트리글리세라이드 수치는 대조군보다 유의하게 높았습니다(P < 0.05).

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

대사기능 장애 관련 지방성 간 질환(metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD)은 단순 지방증, 비알코올성 지방간염(NASH), 간경변증, 간세포 암종 1,2,3,4,5,6 등 다양한 질환을 포함하며, 모두 알코올 섭취 이외의 요인에 기인한다 7 . MASLD는 대사성 간 손상으로 인해 발생하는 가장 흔한 간 질환으로, 전 세계 인구의 거의 4분의 1이 영향을 받습니다 8,9,10,11,12. MASLD의 정확한 발병 기전은 아직 밝혀지지 않았지만 다양한 이론이 그 발병을 설명하려고 시도합니다. 한 가지 지배적인 개념은 고전적인 "2 히트" 이론에서 "다중 히트" 모델1로 출발할 것을 제안합니다. 이러한 가설의 핵심은 인슐린 저항성의 역할이며, 이는 MASLD 발병기전에서 중추적인 역할을 하는 것으로 여겨진다13. 연구에 따르면 간세포의 인슐린 저항성은 유리 지방산 수치를 증가시켜 간 내에 저장된 트리글리세라이드를 형성합니다14,15.

연구원들은 MASLD에서 지방 침착을 시뮬레이션하기 위해 in vivo 및 in vitro 모델을 모두 사용했습니다. 그러나 그 병리기전을 완전히 복제하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. 이러한 한계에도 불구하고 이러한 모델은 MASLD에 대한 잠재적인 치료 표적을 연구하는 데 중요한 역할을 했습니다. 그러나 MASLD의 안정적인 모델을 개발하는 것이 중요합니다. 동물 모델은 효과적이지만 시간과 비용이 많이 들기 때문에 체외 세포 모델에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 이러한 모델은 종종 올레산(OA) 및 팔미트산과 같은 단일 또는 다중 유리 지방산을 사용하여 식이 유발 MASLD를 재현합니다. 이 중 인간 간모세포종 세포주인 HepG2는 MASLD의 시험관 내 세포 모델을 확립하는 데 자주 사용됩니다.

OA 유도는 HepG2 세포를 자극하여 역사가 잘 확립된 방법인 MASLD와 유사한 지방 침착을 복제합니다. 이 연구의 목적은 0.25mM OA로 처리된 HepG2 세포의 생존율, ORO(Oil Red O) 염색, 지질 함량 및 트리글리세리드(TG) 수준을 입증하는 것이었습니다. 이 실험의 목적은 MAFLD 모델링 연구의 개발을 위한 추가 증거를 제공하는 것이었습니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 이 프로토콜에 사용된 모든 재료, 기기 및 시약과 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 세포 배양

  1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)(10% 소 태아 혈청[FBS], 100단위/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신 포함)을 함유한 배양 플라스크에서 HepG2 세포 배양. 배양 플라스크를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C로 유지합니다.

2. cell counting kit-8로 측정한 올레산이 세포 생존율에 미치는 영향

  1. 특정 부피의 OA를 디메틸 설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 200mM의 농도를 달성합니다. 나중에 사용할 수 있도록 용액을 -20 °C에서 보관하십시오.
  2. 웰당 6 × 103 개의 세포 밀도로 96웰 플레이트에 HepG2 세포를 파종합니다. 각 웰에 100μL의 DMEM을 추가합니다. 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 세포를 배양하고 배양합니다. HepG2 세포를 두 그룹으로 나눕니다.
    1. 대조군: 세포 배양 배지를 추가합니다.
    2. OA 그룹: 세포 배양 배지에 OA를 첨가하여 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM 및 1mM의 최종 농도를 얻습니다.
  3. 초기 배양 24시간 후 각 웰에서 상층액을 버리고 지정된 그룹화에 따라 OA를 추가하여 웰당 100μL를 추가합니다. 대조군의 경우 각 웰에 100μL의 세포 배양 배지를 추가합니다. 24시간 동안 세포를 계속 배양합니다.
    참고: 각 그룹에 6개의 반복 웰이 있는지 확인합니다. 증발을 방지하려면 100μL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 96웰 플레이트에 있는 웰의 외부 링에 추가합니다.
  4. 24시간 배양 후 각 웰에 10μL의 세포 계수 키트-8(CCK-8)을 추가하고 부드럽게 혼합한 다음 어두운 곳에서 2시간 동안 배양합니다. 인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 마이크로플레이트 리더에 넣고 450nm(A450)에서 흡광도 값을 측정합니다. GI50 값은 OD에 따라 계산되었습니다.

3. 세포 내 지질 방울 형성을 관찰하기 위한 Oil Red O 염색

  1. 웰당 5 × 105 개의 세포 밀도로 6웰 세포 배양 플레이트에 HepG2 세포를 파종하고 플레이트를 항온 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 설명된 단계의 시각적 표현은 그림 1 을 참조하십시오.
  2. 세포 배양 24시간 후 OA가 포함된 세포 배양 배지 2mL를 각 웰에 추가하여 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM 및 1mM의 최종 농도를 달성합니다. 추가 24시간 후 각 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다. 각 웰에 ORO 고정제 1mL를 추가하고 30분 동안 배양합니다.
  3. 염색 용액 A와 염색 용액 B를 3:2의 비율로 혼합하여 ORO 염색 용액을 준비합니다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 방치한 다음 0.45μm 필터를 통해 한 번 여과합니다. 여과된 용액을 사용할 때까지 빛으로부터 보호되는 원심분리기 튜브에 보관하십시오.
  4. 정착제를 버리고 증류수로 두 번 씻으십시오. 각 웰에 60% 이소프로판올 1mL를 추가하고 30초 동안 배양합니다. 이소프로판올 용액의 60%를 버리고 20분 동안 배양하기 전에 갓 준비한 ORO 염색 용액 1mL를 각 웰에 추가합니다. ORO 염색 용액을 버리고 각 웰에 60% 이소프로판올 1mL를 넣고 30초 동안 배양합니다. 과도한 염료를 제거하기 위해 물로 5번 씻습니다.
  5. 세포를 증류수로 덮고 현미경으로 관찰합니다. 이미지가 수집되면 접시에 있는 액체를 버리고 건조시킵니다. 그런 다음 각 웰에 2mL의 이소프로판올을 추가하고 오비탈 셰이커에 플레이트를 10분 동안 흔듭니다. 액체를 각 그룹에 16개의 웰이 있는 새로운 96웰 플레이트로 옮기고 웰당 100μL를 추가합니다. 510nm(A510)에서 마이크로플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 광학 밀도(OD)를 측정하여 지질 함량을 계산합니다.

4. HepG2 세포 상층액의 총 트리글리세라이드에 대한 다양한 농도의 올레산의 효과

  1. 키트를 실온에서 20분 동안 평형화하고 실험에 필요한 플레이트를 준비합니다.
  2. 세포 상층액과 원심분리기를 1,570× g 에서 10분 동안 수집합니다. 표준 웰을 설정하고 샘플 웰을 테스트합니다. 50 μL의 표준물질([S0 → S5] 농도 후 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol/L)을 표준 웰에 추가합니다. 블랭크 웰 및 표준 웰 외에도 10μL의 다양한 시료를 시료 웰에 추가한 다음 각 웰에 40μL의 시료 희석제를 추가합니다. 각 웰에 100μL의 검출 항체-양 고추냉이 과산화효소를 추가하고 플레이트 멤브레인으로 밀봉한 다음 37°C에서 항온 오븐에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 상층액을 버리고 먼지가 없는 종이에 물기를 닦아낸 다음 각각 1x 세척액으로 잘 세척합니다. 실온에서 1분 동안 그대로 두십시오. 세탁 과정을 5번 반복합니다.
  4. 각 웰에 50μL의 기판 A와 50μL의 기판 B를 추가합니다. 부드럽게 섞고 37 °C에서 15분 동안 배양합니다. 각 웰에 50μL의 터미네이션 용액을 추가하고 15분 이내에 450nm(A450)에서 각 웰의 OD 값을 측정합니다.
  5. x축을 따라 표준물질의 농도를 플로팅하고 y축을 따라 해당 흡광도(OD) 값을 플로팅하여 선형 회귀를 수행하고 곡선 방정식을 도출하여 각 샘플의 농도 값을 계산합니다.

5. 통계 분석

  1. 정량적 데이터에서 유의미한 차이를 확인할 수 있습니다.
  2. 평균± 표준 편차(SD)를 계산하고 데이터를 그래픽으로 표현합니다. P < 0.05가 통계적으로 유의하다고 가정합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

세포 생존율에 대한 올레산의 효과
HepG2 세포는 다양한 농도의 OA(0mM, 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM)에 노출되어 0mM에 비해 0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM에서 세포 생존율이 감소했습니다. 통계적 유의성은 0.5mM(P < 0.05) 및 1mM(P < 0.05)에서 관찰되었습니다. CCK-8 키트로 평가한 OA가 세포 생존율에 미치는 영향은 그림 2에 나와 있습니다. OA-처리된 HepG2 세포에 대한 GI50 값은 1.875mM로 계산하였다.

세포 내 지질 방울 형성을 관찰하기 위한 Oil Red O 염색
ORO 염색은 지질 시각화에 일반적으로 사용되는 방법입니다16,17. 결과적으로, OA로 24시간 동안 배양한 HepG2 세포의 지질 방울 형성을 ORO 염색 후 현미경으로 관찰했습니다. 그림 3 및 그림 4에서 볼 수 있듯이 OA 처리된 세포의 적색 염색 강도는 처리되지 않은 세포보다 높았습니다. 적색 지질 방울은 OA 처리 후 HepG2 세포의 혈장에 존재했으며, OA 농도가 증가함에 따라 지질 방울과 지질의 양이 증가했습니다(그림 5).

HepG2 세포 상층액의 총 트리글리세리드에 대한 다양한 농도의 올레산의 효과
그림 6에서 볼 수 있듯이 실험 결과는 대조군에 비해 다양한 농도의 OA(0.125mM, 0.25mM, 0.5mM, 1mM)로 HepG2 세포를 처리한 결과 OA 그룹에서 세포 상층액의 TG 함량이 유의하게 증가했음을 보여주었습니다(P < 0.05).

figure-results-1
그림 1: Oil Red O 염색을 위한 순서도. 약어 : OA = 올레산; OD = 광학 밀도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 세포 생존율에 대한 올레산의 효과, 세포 계수 키트-8 분석을 사용하여 평가. 각 막대는 평균± SD(n = 6)를 나타냅니다. *P < 0.05. 약어: OA = 올레산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 여러 시점(3, 6, 9, 12시 방향)의 Oil Red O 염색 이미지. 지질 방울 형성은 세포 배양을 위해 도립 현미경을 사용하여 40x 배율로 검출되었습니다. 스케일 바 = 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: 세포 내 지질 방울에 대한 올레산의 효과, Oil Red O 염색을 통해 평가 . 지질 방울 형성은 세포 배양을 위해 도립 현미경을 사용하여 40x 배율로 검출되었습니다. 스케일 바 = 250 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 올레산이 세포의 지질 함량에 미치는 영향, optical density 값으로 평가 . 상대적인 fold 변화는 서로 다른 그룹의 optical density 값으로 표시됩니다. 각 열은 평균± SD(n = 16)를 나타냅니다. *P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: HepG2 세포 상층액의 총 트리글리세라이드 수치에 대한 다양한 농도의 올레산의 효과. 상대적인 접힘 변화는 다른 그룹의 트리글리세라이드 수준 값으로 표시됩니다. 각 열은 평균± SD(n = 3)를 나타냅니다. *P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MASLD는 알코올 및 기타 확립된 간 손상 물질 이외의 요인으로 인해 간세포에 과도한 세포 내 지방 침착을 특징으로 하는 임상병리학적 증후군이다18. MASLD는 후천성 대사 스트레스 간 손상과 복잡하게 연결되어 있으며, 특히 인슐린 저항성 및 유전적 감수성과 관련이 있습니다. MASLD에 대한 약물을 효과적으로 연구하고 스크리닝하려면 적절한 실험 모델을 선택하는 것이 중요합니다. 세포 모델을 확립하는 것은 MASLD 연구에서 특히 중요하며, 병리학적 메커니즘에 대한 심층적인 이해와 새로운 약물 효과의 평가를 용이하게 합니다.

이 프로토콜은 OA 유도 HepG2 세포를 통해 확립된 MASLD의 시험관 내 모델을 설명합니다. ORO 염색 및 지질 함량 분석은 이 모델을 생성하기 위한 중요한 방법입니다. 또한 세포 상층액의 세포 생존율과 총 TG 함량을 평가하는 것은 적절한 OA 농도를 평가하는 데 필수적입니다. MASLD의 진단 기준은 간 세포에 저장된 5% 이상의 TG의 존재를 포함합니다19,20. MASLD 세포 모델은 주로 HepG2 세포 21,22,23,24,25,26,27,28에 의존하며, 이는 다양한 국내 및 국제 연구에서 지방간 변성 모델을 구축하는 데 성공적으로 활용되는 것으로 알려져 있습니다. 간종 세포에서 유래했음에도 불구하고 HepG2 세포는 간세포와 많은 표현형 특성을 공유하며 쉽게 배양 및 증식됩니다29,30. CCK-8 키트, ORO 염색, 지질 함량 및 총 TG 측정과 같은 검사는 연구 대상자의 세포 생존율, 지방 축적 및 지질 함량을 평가하기 위한 간단하고 객관적이며 합리적인 접근 방식을 제공합니다. 이러한 맥락에서 OA는 에너지 섭취량이 소비를 초과할 때 초과 에너지가 지질 형태로 저장되는 MASLD31의 발병기전과 일치합니다.

연구원들은 MASLD 모델을 복제하기 위해 OA 23,28,31,32,33, 팔미트산 34,35 및 올레산/팔미트산26,36의 조합을 활용했습니다. 팔미트산과 OA는 모두 간의 지방 변성과 중성콩토의 축적에 기여합니다. 인체에서 가장 풍부한 포화 지방산인 팔미트산은 상당한 지방 독성을 나타내어 간세포에 지질 축적, 세포 내 활성 산소 라디칼 증가, 세포 사멸 또는 괴사를 유발합니다37. 반대로, OA는 세포 내 TG 침착이 더 뚜렷하고(그림 6) 세포 조절이 적습니다38. 따라서 연구자들은 종종 OA 유도 HepG2 세포를 사용하여 in vitro MASLD 모델을 확립합니다. 프로토콜 단계 2.2.2에서 설명한 대로 OA 용액을 추가할 때 가열하는 것이 중요합니다. 이 연구에서 ORO 염색 및 지질 함량 분석은 HepG2 세포의 지질 침착을 기반으로 하여 복잡한 메커니즘을 가진 MASLD의 시험관 내 모델 탐색을 효과적으로 지원하고 연구에 필요한 시간과 비용을 절감했습니다.

ORO는 물방울 형태로 TG에 쉽게 결합하여 지방을 나타내는 주황색에서 빨간색 염색을 생성하며 지질 농도에 따라 색상 강도가 달라집니다. 그러나 ORO 염색액은 불안정하고 침전이 발생하기 쉽기 때문에 사전 조제에는 적합하지 않습니다. 따라서, ORO 염색 용액은 프로토콜 단계 3.2 후에 제조되었으며, 준비 및 배양 중 빛 노출을 피하기 위해 예방 조치를 취했습니다(프로토콜 단계 3.2, 3.3). 프로토콜 단계 3.5에서 여러 시점(3, 6, 9 및 12시 방향)에서 이미지를 선택하는 것은 결과의 정확도를 향상시키는 데 필수적인 실험의 주요 수정을 나타냅니다. OA 농도 상승이 세포 생존에 영향을 미치므로 이 방법의 한계가 있지만, 적절한 OA 농도가 세포 생존력을 보장한다는 것이 입증되었습니다.

이 연구는 CCK-8 키트, ORO 염색, 지질 함량 분석 및 총 TG 측정을 사용하여 MASLD 모델을 설정하고 검증하는 포괄적인 접근 방식을 사용했습니다. CCK-8 키트는 약물이 세포 생존율에 미치는 영향을 평가하는 데 사용되었으며, 이는 중요한 검증 단계 역할을 했습니다. 앞으로 이 모델은 MASLD 발병 기전을 이해하고 잠재적인 치료 표적을 식별하기 위한 약물 스크리닝 및 메커니즘 연구에 대한 약속을 가지고 있습니다. 검증의 신뢰성을 더욱 보장하기 위해 모델에 관련된 표적 단백질의 발현 수준은 웨스턴 블로팅 및 정량적 중합효소 연쇄 반응 분석을 사용하여 분석됩니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이번 연구는 2018년 내몽골 자치구 과학기술부 과학기술사업 지원사업의 '몽골 의학의 지역질병에 대한 쿠미스의 치료효과 핵심과제 연구'에 의해 부여되었다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.22 & 마이크로; m 필터Millex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTAGibco25200-056
0.45 µ m 필터Millex
2 mL 극저온 바이알CORNING430659
25 cm2 세포 배양 플라스크CORNING430639
6웰 세포 배양 플레이트CORNING3516
96웰 세포 배양 플레이트CORNING3599
혈구 계수 플레이트Shanghai Jing Jing 생화학 시약 & 악기 (주)
세포 계수 키트-8 분석Beijing Solarbio Science & 테크놀로지 주식회사 CA1210-1000T
CO2 인큐베이터NUAIRENU-5710E
  DMSO 디메틸 설폭사이드 베이징 솔라바이오 사이언스 & 테크놀로지 주식회사 D8371
Dulbecco의 변형 독수리 매체Gibco8122691
효소 라벨링 장비TecanSpark
Fetal Bovine Serum, 적격Gibco10099141
HepG2 세포 라인베이징 중국 북부 Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)221031
인간 트리글리세리드(TG) ELISA 지시 :Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute20170301
세포 배양을 위한 도립 현미경LeicaDMi1 
이소프로판올Tianjin Zhiyuan 화학 시약 Co.
오일 레드 스테인 키트, 배양 세포용 BeijingSolarbio Science & 테크놀로지 주식회사 G1262
올레산 Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (상하이)
페니실린 스트렙토마이신Gibco15140122
SPSS 24.0통계 소프트웨어
022701132021030141A502071

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