방법 논문

Less-Invasive Technique for Non-stabilized Mandibular Fracture in Mouse Models

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DOI:

10.3791/66824

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2024년 9월 27일

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular and Physiopathological Bases of Osteochondrodysplasia, Imagine Institute, Université de Paris Cité, 2SFR Necker INSERM, LEAT antenne Imagine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 하악골 복구를 분석하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 생쥐 모델에서 비안정화 하악골 골절에 대한 재현 가능한 기술을 설명하여 조직 손상 및 뼈 손실을 최소화하면서 내연골 뼈 복구 과정을 분석할 수 있습니다.

초록

마우스의 하악 부위에서 비안정화 골절을 만들 수 있으므로 내연골 골화 모드를 사용하여 뼈 복구를 분석할 수 있습니다. 이 과정을 in vivo에서 가장 정확하게 반영하기 위해서는 과도한 뼈 손실과 연조직 손상을 방지하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요하며, 특히 최소한의 접근을 특징으로 하는 해부학적 부위인 하악 부위에서 그렇습니다. 우리가 아는 한, 우리는 처음으로 생쥐에서 불안정한 하악 골절의 덜 침습적인 프로토콜을 설명합니다. 다 자란 쥐는 이소플루란으로 마취되고 피하 주사에 의해 부프레노르핀의 수술 전 투여량을 받는다. 하악골의 하악 경계를 따라 피부를 절개하는 턱밑 접근법이 수행됩니다. 교근은 하악골막(mandibular ramus)을 따라 골막하부(subperiosteal) 평면에서 융기되며, 골막층(periosteal elevator)이 있습니다. 하악 라무스의 골절을 완료하기 위해 기저 경계에서 관상 노치(과두와 관상돌기 사이)까지 압전 뼈 수술 장치를 사용하여 기저 가장자리의 식염수 혈청 세척 하에 압전 뼈 수술 장치를 사용하고 가위를 사용하여 라무스의 수직적이고 완전한 골절을 수행합니다. 피부 접근법은 실크 봉합사로 봉합됩니다. 불안정한 하악 골절에 대한 이 상세한 절차는 뼈 손실과 연조직 손상을 최소화할 수 있는 효율적인 절차를 제공합니다. 이 기술은 마우스 모델에서 내연골 복구 과정을 정확하게 반영하는 성공적이고 일관된 결과를 보장합니다.

서론

뼈 복원은 골절 또는 절골술 안정화에 따라 막과 연골 내막 골화 과정을 모두 의미합니다. 안정화된 뼈 절골술 또는 골절에 따른 뼈 복원은 막골 골화에 의존하는 반면, 불안정한 골절 또는 잘 안정화되지 않은 절골술은 내연골 골화(endochondral ossification) 방식에 따라 통합된다1. 막골 복구는 중간엽 세포를 조골세포로 직접 분화하여 뼈를 형성하는 것이 특징인 반면, 내연골 복구는 조골세포로 분화하여 뼈 굳은살을 형성하는 일시적인 연골 주형의 형성을 포함한다2.

뼈 복구는 여러 조직과 세포의 상호 작용에 달려 있습니다. 또한 부위별 요인과 굳은살3에 가해지는 힘에 의해 영향을 받는다. 하악골(mandibular bone)은 저작력을 지탱하는 움직이는 뼈로, 대부분 피질골에 의해 형성됩니다. 하악골 복구 과정은 골절 부위와 골절 방향에 의해 영향을 받습니다. 근육 및 골막 손상이 골절 부위 4,5,6의 중요한 뼈 손실뿐만 아니라 뼈 통합에도 영향을 미칠 수 있다는 것은 잘 알려져 있습니다.

내연골 하악골 복구를 분석한다는 것은 가치 있고 편향되지 않은 비교를 위한 표준화되고 재현 가능한 프로토콜을 의미합니다. 문헌과 관련하여, 소수의 저자만이 마우스 모델 3,7에서 불안정한 하악 골절에 대한 프로토콜을 보고하며, 대부분 어금니 수준8에서 전방 방향으로 보고합니다. 이 기술을 개발함으로써 우리는 근육 및 골막 부상을 피하고 골절 부위의 골 손실을 제한하여 교란 요인 없이 내연골 복구 과정을 가장 잘 분석하는 것을 목표로 합니다. 또한, 마우스의 하악골 골절에 대한 새로운 기술을 개발하는 목적은 작은 동물에서 이러한 수술에서 빈번한 수술 후 통증 및 동물의 죽음을 최소화하는 데 있습니다. 처음으로, 우리는 마우스의 라무스 수준에서 불안정한 하악 골절에 대한 덜 침습적인 프로토콜을 설명합니다. 이 in vivo 프로토콜은 골절 부위의 과도한 근육 및 골막 손상 또는 뼈 손실을 방지하고 수술 후 통증 수준과 동물의 사망 위험을 줄이는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Imagine Institute의 동물 보호 지침을 따르며 윤리 위원회와 프랑스 부처(APAFIS 26995)의 검증을 받았습니다.

1. 동물

  1. 그룹당 동물의 수를 결정합니다. 그룹당 12마리의 동물을 동반하는 것이 좋습니다. 쥐의 성별과 나이를 결정합니다. 이 프로토콜은 6주 된 C57BL/6J 마우스(수컷 또는 암컷)에 적합합니다.
  2. 시술 최소 1주일 전에 동물에게 적응을 위한 영양 보충제 젤을 주십시오.

2. 수술 절차

  1. 필요한 재료를 준비합니다. 기구를 오토클레이브: 가위, 바늘 드라이버, 집게, 압전 뼈 수술 장치의 삽입 및 핸드피스, 엘리베이터. 멸균 장갑, 실크 봉합사(4/0), 면도기, 면봉, 10% 포비돈-요오드 용액, 가열 테이블, 이소플루란 및 이소플루란 흡입용 마스크를 준비합니다.
  2. 부프레노르핀을 0.1mg/kg으로 제제하고 멸균 주사 가능한 생리학적 혈청에 희석합니다. 수술 30분 전에 25G 바늘로 부프레노르핀을 피하 주사하여 투여합니다.
  3. 가열판(37°C)을 준비하고 그 위에 폼 지지대를 놓고 작은 바늘이나 접착 테이프로 마스크를 고정합니다.
  4. 유도를 위해 마우스를 이소플루란 탱크에 넣고 이소플루란 확산(4%)합니다. 발가락 꼬집기를 수행하여 마취 깊이를 테스트합니다. 충분한 유도의 경우 페달 반사의 부족이 관찰됩니다.
  5. 전체 절차 동안 37°C로 유지되는 멸균 필드로 덮인 가열판에 마취된 쥐를 등을 대고 놓습니다. 지속적인 이소플루란 흡입을 위해 마스크를 주둥이에 위치시킵니다(2.5%로 유지). 접착 테이프로 쥐 사지를 고정합니다.
  6. 전신 마취로 인한 눈 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 양측으로 바르십시오. 턱밑 털을 면도하고, 멸균 장갑을 끼고, 10% 포비돈 요오드 용액과 알코올을 여러 번 문질러 피부를 소독합니다.
  7. 아래 설명과 같이 턱밑 피부 접근법을 수행합니다.
    1. 하악 각도에서 하악 수평 가지의 1/3 후방 - 2/3 전방 접합부까지 마이크로 가위로 피부 절개를 수행합니다.
    2. 피하 조직을 절개하여 교근을 노출시킵니다.
  8. 하악골의 하악 경계에서 골막 엘리베이터를 사용하여 부착된 교근을 제거합니다.
  9. 엘리베이터와 함께 하악골벽을 따라 복근을 들어 올립니다.
  10. 식염수 혈청 세척(최대 10mL/분) 하에 압전 뼈 수술 장치를 사용하여 하악의 아래쪽 경계, 하악 각도 전방, 오목한 부분의 뒤쪽 부분에서 하악골 가장자리에 작은 절골술(3mm 길이)을 만듭니다(그림 1, 그림 2).
  11. 하악골과 관상동맥의 후방 경계(마이크로 가위 또는 겸자 사용)를 찾고 하악골 라무스를 따라 삽입된 작은 직선 가위를 사용하여 골절을 완료하여 추가 교근 구멍 및 부상을 방지합니다. 골절의 올바른 방향을 허용하려면 하악골의 아래쪽 경계에 수직으로 가위를 놓습니다.
  12. 골절이 완전히 완전한지 확인: 겸자로 2개의 골절을 부드럽게 움직이는 동안 두 뼈 분절 사이의 전체 이동성을 관찰해야 합니다.
  13. 분리된 봉합사가 있는 실크 봉합사(4/0)로 피부 접근을 닫습니다. 골막에는 봉합사가 필요하지 않습니다.
    주의: 대안적으로, 피부 접근법은 다른 비흡착성 봉합사(예: 폴리프로필렌 봉합사)로 봉합할 수 있습니다.
  14. 골절 방향을 확인하기 위해 두부 측방 X-ray를 수행합니다(그림 3).
    1. X-ray를 수행하기 전에 짧은 재유도를 위해 마우스를 이소플루란 탱크에 다시 넣으십시오. 그런 다음 X선 분석을 위해 머리를 약간 과신전한 상태로 하여 마우스를 측면의 확장에 놓습니다.
    2. 골절이 하악 어금니 높이에서 너무 앞쪽에 위치하거나 골절이 하악 각도를 분리한 경우(그림 4), 뼈 굳은살의 부피가 비정상적으로 증가하는 것을 관찰하십시오. 이러한 경우 분석의 편향을 피하기 위해 동물을 연구에서 제외하십시오.
  15. 쥐를 새장에 다시 넣기 전에 의식을 회복할 때까지 확인하십시오.

3. 수술 후 관리

  1. 저작력을 피하기 위해 사료와 하드 농축이 없는 마우스 케이지를 준비하십시오.
  2. 피부가 완전히 치유될 때까지 수술한 마우스를 1주일 동안 단일 케이지에 격리합니다. 수술 후 1주일에, 그룹은 같은 케이지에서 암컷 쥐를 함께 운영했습니다.
  3. 시술 후 4시간, 24시간, 48시간, 72시간에 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 피하주사로 투여합니다.
  4. 통증과 골절의 2차 변위를 피하기 위해 0일째부터 통합 기간이 끝날 때까지(즉, 28일) 모든 수술 후 기간 동안 마우스에 부드러운 다이어트 젤을 먹이십시오.
  5. 골절 후 0일째부터 4일째까지, 아침, 부프레노르핀 주사 전, 그리고 동물 희생(골절 후 14일)까지 일주일에 3번 마우스의 체중을 매일 잰다.
  6. 수술 후 동물 관리를 최적화하기 위해 수술 후 동물 복지를 평가합니다. 표 1 의 점수 척도를 사용하여 동물의 수술 후 상태를 평가하고 후속 조치를 조정합니다. 점수가 1> 경우 부프레노르핀 주사를 투여하고, 점수가 3> 및/또는 음식물 보충에도 불구하고 수술 전 체중> 20% 체중 감소가 있는 경우에는 안락사를 논의해야 한다(표 1).

결과

in vivo 수술 절차의 경우, 마우스 모델에서 비안정화 하악 골절의 이러한 절차를 최적으로 수행하기 위해서는 구체적인 학습과 훈련이 필요합니다.

비안정화 하악골 골절에 대한 이 기술을 통해 내연골 복원 과정을 연구할 수 있습니다. 안락사 후, 하악 샘플을 4% 파라포름알데히드(24시간)에서 수집했습니다. EDTA pH 8로 전체 석회질 제거 후, 절편을 파라핀에 매립시켰다. 시상 연속 절편을 수행하고, 탈파라핀화 용액에서 탈파라핀화한 다음, 표준 프로토콜을 사용하여 Sirus Red/Alcian Blue 염색 전에 재수화했습니다. 조직학적 영상은 연골 주형이 있는 부드러운 굳은살의 형성을 확인했습니다(그림 5). 뼈 치유는 micro-CT 분석에서 볼 수 있듯이 골절 후 4주에 완료됩니다. 굳은살 형성의 시작(예: 연구 목적에 따라 7일마다(7일, 14일, 21일) 또는 그 이상)부터 뼈 치유가 끝날 때까지(즉, 28일) 다양한 핵심 지점에서 조직 형태학적 및 마이크로 CT 형태 분석을 통해 뼈 복구 과정을 연구하는 것이 좋습니다.

58마리의 야생형 마우스(C57BL/6J 배경)를 대상으로 수행된 이 절차의 후향적 분석을 기반으로 프로토콜의 성공률은 86.3%이고 배제율은 13.7%입니다. 수술 후 초기 조기 자연사(3%), 임계점(1%; 점수 > 3 및/또는 체중 감소 > 20%)을 보인 마우스에 대한 안락사 결정, 또는 절골술의 비정상적인 위치, 하악각의 비정상적인 분할(5%) 또는 골절이 어금니 수준(n=1/58)인 경우에 대한 안락사 결정이 원인이었다. 후자의 경우 어금니 수준에서 골절의 비정상적인 분열과 함께 감염이 관찰되었습니다(n= 1/58; 표 2).

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그림 1: 하악 상행 분지의 턱밑 피부 접근 이미지. 하악골의 아래쪽 경계는 피에조톰 삽입물로 골절되어 뼈 손실(화살표)을 최소화할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 마우스 하악의 염색. 6주 된 야생형 마우스 하악골의 측면도(alizarin red / alcian blue 염색으로 염색): 1. 과두, 2. 코로나 노이드 프로세스, 3. 코로나 노이드 노치, 4. 각도 프로세스, 5. 라무스의 후방 경계, 6. 하악의 기저(또는 하악) 경계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 쥐 두개골의 X선. 야생형 6주 된 쥐의 두개골 측면 X선(시상 보기)은 골절되지 않은 쥐의 하악골 측면(왼쪽)과 골절된 쥐의 하악골 측면 및 불안정한 하악 골절의 방향(화살표)을 보여주며, 하악 경계에서 과두 전방에 위치한 관상동맥 노치(오른쪽)까지 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4. 최적이 아닌 조건에서 쥐 두개골의 X선. 생후 6주 된 야생형 쥐의 두개골의 측면 X선(시상도)은 하악각(화살표)의 비정상적인 골절을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 대표 결과. 야생형 마우스(C57BL/6J)에서 골절 후 14일째 결과. 하악 골절 부위의 재건된 μCT 스캔의 대표적인 3D 관상도, 뼈 굳은살(흰색 화살표). 내연골 복구 과정의 존재를 확인하는 굳은살 연골(Sirus Red/Alcian Blue 염색)의 대표 이미지. 약어: B = 뼈, C = 연골. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

012
동물적 측면보통화장실 축소주름진 머리, 아치형 등
행동보통저운동성운동성 저하, 음식 섭취 감소, 체중 감소 > 10 %
임상 징후보통흉터 염증열린 흉터, 감염

표 1. 수술 후 웰빙 점수 척도.

n = 58 마우스
성공률86.3 %
제외율 :13.7 %
조기 자연사3%
크리티컬 점수 3< 및/또는 체중 감량 > 20%1%
하악각으로 분할된 비정상 골절5%
비정상적인 골절 분할, 어금니 수준에서1.7 %

표 2. 프로토콜의 성공률과 배제율.

토론

이 기술을 사용하면 짧은 절차 시간(약 10분 이하)에 최소한의 개방 접근 방식으로 마우스 모델에서 불안정한 하악 골절을 실현할 수 있습니다. 이 짧은 시간 절차는 특히 생쥐와 같은 작은 동물에서 동물의 이환율 및 사망 위험을 제한합니다. 내연골 복구 과정의 분석에서 유사한 결과를 얻기 위해, 하악 각도의 비정상적인 분할 없이 동일한 방향으로 하악 골절을 수행하는 데 특별한 주의를 기울여야 하는데, 이러한 바람직하지 않은 효과는 뼈 굳은살의 부피를 비정상적으로 증가시키고 유착 기간을 지연시킬 수 있기 때문입니다. 하악 골절에 대한 이 프로토콜은 수술 후 하악 앞니 성장에 영향을 미치지 않습니다. 이 프로토콜의 효과를 높이기 위해 실험자는 먼저 비슷한 연령의 안락사 동물에게 운동을 하고 하악골 골절 직후 절개하여 필요한 경우 파괴 방향을 직접 시각화할 것을 권장합니다.

중간엽 전구세포(mesenchymal progenitor)는 인접한 근육에서 굳은살로 이동하면서 뼈 복구에 기여한다6. 골막과 근육 손상이 뼈 통합에 영향을 미친다는 것이 입증되었습니다 5,6. 또한 근육 절편이 넓으면 출혈 위험이 높아지고 수술 후 감염으로 이어질 수 있습니다. Piezosurgery는 주로 두개안면 뼈 수술 분야에서 개발되었습니다. 기존 절골술과 비교할 때 연조직 손상 및 수술 후 통증의 비율이 낮은 것으로 보고되었습니다 7,9. 교근 및 골막 손상을 최소화하기 위해 압접합술을 사용하여 하악골 하악 경계에서 골절을 시작하고, 교근 부분이 광범위하게 확장되지 않도록 라무스 상부에서 가위로 골절을 완료했습니다. 이것은 하악골의 후방 경계와 관상동맥 노치의 위치를 제어한 후 가위로 상악골의 상부를 골절하는 것을 의미합니다. 우리는 하악골 아래쪽 가장자리에서 압압 수술을 시작한 후 작은 직선 가위를 사용하여 골절을 완료하는 데 어려움이 없었습니다. 우리는 서로 다른 유전적 배경(C57BL/6J, CD1(결과는 표시되지 않음))과 골밀도 및 하악 크기(예후, 미세그나티아)가 다른 성체 마우스에서 이 절차를 경험했습니다. 그러나 비정상적인 골절 분할을 피하기 위해 가위의 길이가 상부 라무스를 한 번만 골절하는 데 적합한지 확인하는 것이 좋습니다.

이 절차에서는 이러한 최소 개방 접근 방식으로 인해 출혈 위험이 최소화됩니다. 근육 상승 시 과다 출혈이 발생할 수 있는 경우 거즈로 수술 부위를 짧게 압박하면 출혈이 멈춥니다. 하악 골절이 너무 앞쪽에 위치할 때 어금니 골절의 경우 수술 부위 감염의 잠재적 위험이 발생할 수 있습니다. 이러한 부작용은 수술 후 측면 X선에서 감지할 수 있습니다. 이 경우 해당 동물은 연구에서 제외되어야 합니다. 수술 부위의 수술 후 감염은 혈종으로 인한 것일 수도 있습니다. 이는 분리된 피부 봉합사를 수행하여 수술 전에 비정상적인 출혈이 발생할 때 자발적인 배출을 가능하게 함으로써 예방할 수 있습니다. 이소플루란을 사용한 전신 마취와 복강 내 주사는 복강 내 주사의 부작용과 관련된 과도한 사망률을 피할 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면, 이소플루란을 사용한 전신 마취와 직접적으로 관련된 동물의 죽음은 관찰되지 않았습니다.

생쥐는 수술 후 음식 섭취량이 감소할 수 있습니다. 음식 섭취가 충분하지 않거나 체중 증가가 충분하지 않은 경우 체로 쳐진 사료 가루를 젤에 추가할 수 있습니다. 수술 후 음식 섭취를 늘리기 위해서는 수술 최소 1주일 전에 사료가 함유된 영양 보충제 젤을 투여하는 것이 좋습니다. 추적 관찰 중에(매주, 후속 조치 중) 및 희생 시간에 잠재적인 골절 변위를 평가하기 위해 추가 X-ray를 수행하는 것이 좋습니다. 비병리학적 상태에서는 골절 후 4주 후에 뼈 유착이 완료됩니다.

몇몇 저자들은 마우스 3,10,11에서 하악골의 불안정한 골절에 대한 다양한 프로토콜을 설명했습니다. 절골술을 수행하는 데 사용되는 기구는 드릴, 수술용 핀셋 등 다양할 수 있습니다. 그러나 드릴을 사용하면 더 큰 뼈 손실과 연조직 손상이 발생할 수 있습니다. 우리가 아는 한, 이 불안정한 하악 골절 절차는 절골술을 완성하기 위해 압접합과 가위를 연결하는 첫 번째 절차입니다. 이 기술은 뼈 손실을 최소화하면서 정밀한 절골술을 허용하면서 연조직을 보존하는 장점이 있습니다.

모든 기술과 마찬가지로 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 우리는 압전 수술 삽입물로 골절을 시작한 후 가위를 사용하여 골절을 수행하는 것을 선호하여 잠재적인 통합 지연 및/또는 건막증의 형성을 악화시킬 수 있는 확장된 교근 섹션 및 골막 손상을 방지했습니다. 그러나 이 기술은 하악골의 전체 시각화 없이 관상동맥 노치의 위치를 제어하여 동일한 방향 내에서 파괴를 수행하는 것을 의미합니다. 따라서 수술 경험에 따라 학습 곡선이 예상됩니다. 또한, X-ray에서 하악 골절의 방향은 X-ray 장치에 따라 시각화가 어려울 수 있습니다. 골절 방향을 확인하기 위해 in vivo micro-CT를 사용하지 않았는데, 이는 전신 마취 시간이 길어지기 때문에 마우스의 회복을 방해할 수 있기 때문입니다.

내연골 뼈 복구 과정을 연구하는 것은 불안정한 골절의 실현을 의미하므로 뼈 복구 과정을 더 잘 이해할 수 있습니다. 이 단계는 유전 질환 또는 외상 후 또는 종양 후 후유증의 맥락에서 환자의 결함 있는 뼈 복구 및 pseudarthrosis를 치료하기 위한 새로운 임상 응용 프로그램을 개발하기 위해 뼈 복구 결함이 있는 마우스 모델에 대한 전임상 시험을 고려하려는 경우에 필요합니다.

공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 Head and Heart Chair와 ANR BonyBrain을 통해 Mutuelles AXA의 자선 부서에서 부분적으로 지원합니다. 우리는 절차 실현에 기여한 플랫폼 SFR Necker INSERM US24, LEAT Imagine, Paris, France의 모든 구성원을 인정합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
부프레노르핀 : Buprecare 0.3 mg/kg동물보호
엘리베이터 OBWEGESER 폭 6mm 길이 17.5cm Collin MedicalHA 5905
집게 : 패드 플레이트 MORIA 11cm N° 5MORIA9906
난방 테이블 Bioseblab 55 cm x 33 cmBioseblab707
바늘 홀더 : 마이크로 Halsey 바늘 홀더 - 금속 라보덤21,100
네오 클리어 Merck Millipore, 독일 다름슈타트109843 
Ocry 젤 튜브 10g (눈 윤활제)tvm lab   3.70045E+12
피에조토메 2 ASS FINALACTEONX57402
피에조토메 삽입 Piezocision PZ3ACTEONF87574
가위 마이크로 MORIAMC52
실크 봉합사 PERMA HAND SEIDE  / MERSILKETHICONREF 18501G 
스트레이트 가위MORIA4877A
Vetflurane (이소 플루 란) 250mlVIRBACVET066 (Centravet)

참고문헌

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