여기에서는 연구 동물이 최소한의 스트레스와 불편함으로 치료제를 쉽게 섭취하도록 장려하는 구강 배당의 대체 방법으로 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)를 설명합니다.
이 논문에서
요약
초록
주사기에 부착된 캐뉼라를 사용하는 구강 위(OG)는 연구 동물의 위에 화합물을 정밀하게 투여하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 불행히도 이 방법은 작업자와 연구 동물 모두에게 어려움을 안겨줍니다. 연구에 따르면 OG는 식도염, 식도 천공, 부주의한 기관 약물 투여 등의 합병증을 유발할 수 있습니다. 또한 OG는 혈장 및 분변 코르티코스테론 수치 증가(스트레스로 인한), 혈압 변화 및 심박수 증가와 관련이 있으며, 이는 연구 결과에 부정적인 영향을 미치거나 편향될 수 있습니다. 이전에 개발된 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)라는 대체 방법은 동물이 최소 침습적 방식으로 치료제를 즉시 섭취하도록 장려합니다. 본 명세서에서는 서로 다른 비히클에서 재구성한 처리와 함께 MDA 기법을 사용하는 예를 제시하고 여러 다른 마우스 균주에 다양한 처리물을 효과적으로 전달하는 것을 보여줍니다. 또한 MDA가 약물 투여의 시기와 침습성을 감소시키고 핵심 장내 미생물 종의 정량적 분석으로 평가된 장내 마이크로바이옴 구성에 영향을 미치지 않는 기술임을 입증합니다. 전반적으로 MDA는 OG에 대한 스트레스가 적고 효과적인 대안을 제공할 수 있습니다.
서론
설치류 모델에 대한 약물 투여는 일반적으로 구강 위(OG)를 통해 이루어지며, 이는 용액이 들어 있는 주사기에 부착된 캐뉼라를 사용하여 위에 액체 제제를 직접 투여하는 것으로 구성됩니다. 이 기술은 동물에게 일관되고 정확한 투여량을 제공하지만 여러 가지 단점도 있습니다. OG는 인간의 식이 노출을 적절하게 모델링하지 않은 것에 대해 면밀히 조사되었습니다 1,2. 또한, OG는 상부 소화계의 의도하지 않은 손상(식도와 위의 천공), 투여 치료의 흡인, 호흡기 병변의 위험을 증가시킨다3. OG는 또한 불편함4, 혈압 및 심박수 증가5, 스트레스6,7,때로는 동물의 배설에 대한 내성 감소로 인한 사망8과 관련이 있다. 이러한 생리학적 변화는 실험 결과를 방해하거나 혼란스럽게 할 수 있습니다. 따라서 이러한 부작용을 피하기 위해 새로운 절차가 연구되었습니다. 연구에서는 젤라틴을약물 매개체9로 사용, 구강 용해 스트립(ODS)10, 자당으로 코팅된 가비지 바늘(gavage needles)11, 유연한 공급 튜브, 밀 쿠키(wheat cookies)12, 꿀(honey)13, 땅콩버터 펠릿(peanut butter pellets)14과 같은 OG의 대체 절차를 활용했다. 불행히도, OG 기법에 대한 이러한 수정에는 수불용성 약물과의 비호환성, 처리를 위한 긴 준비 시간15, 약물 기호성 및 안정성15, 동물이 식품에 익숙해지는 등의 한계가 있습니다. 또한, 동물이 즉석에서 먹이를 줄 때 덜 정확한 투여가 발생할 가능성이 있습니다.
Scarborough 등7 은 이전에 생쥐를 대상으로 한 대체 경구 치료 방법을 개발했는데, 이를 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)라고 명명했습니다. 이 투여 방법은 약리학적 물질의 매개체로서 가당 연유 용액을 기반으로 하며, 연구 동물이 단일 채널 피펫 및 피펫 팁으로 용액을 분주하여 준비된 비히클 및/또는 약물 용액을 즉시 소비하도록 동기를 부여합니다. 이 기술을 소개하기 위해 설치류는 취급 시간을 단축하고 연구 동물이 피펫 팁4에서 마시는 것에 익숙해질 수 있도록 교육 세션(최소 2일)을 받습니다. Scarborough 등7 및 Schalbetter 등16 의 초기 검증 연구는 MDA 절차가 기존의 경구 위장 방법보다 구현하기 쉽고, 비용 효율적이며, 최소 침습적이고, 동물에게 스트레스가 적다는 것을 시사합니다. Scarborough 등은 신경 발달 장애의 모계 면역 활성화(MIA)에 대한 마우스 모델에서 MDA 기술의 사용을 소개했습니다7. 이 연구는 MDA를 사용하여 항정신병 약물 리스페리돈으로 치료받은 마우스의 약동학 프로파일이 OG의 사용과 유사하다는 것을 입증했습니다. 또한, MDA는 생쥐의 코르티코스테론(스트레스 호르몬) 수치 증가를 유도하지 않았으며, MDA 기법을 사용한 리스페리돈 만성 치료는 MIA로 인한 사회적 상호작용 결핍 및 암페타민 과민증의 용량 의존적 감소로 이어졌다7. 추가 연구에서는 마우스17 및 랫트18 모델 모두에서 MDA와 OG의 효능을 조사했습니다. MDA는 또한 복강내 주사와 비교되었으며 클로자핀-N-옥사이드를 마우스에 전달하는 데 효과적인 것으로 나타났습니다16. MDA가 동물 스트레스를 줄이고 치료 효능을 성공적으로 보인 것으로 보고됨에 따라, 이제 추가 쥐 모델을 사용하여 효과적인 약물 전달 방법으로서 MDA 기술을 더 자세히 탐구하는 것을 목표로 합니다. 여기에서는 살아있는 박테리아, 불용성 용액(옥수수 기름)으로 전달되는 실험 화합물 및 차량 대조군을 포함한 다양한 경구 치료제로 면역 기능이 저하된 FVB/NJ 및 C57BL/6J 균주와 면역 저하 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 균주를 포함한 다양한 마우스 균주를 치료하기 위한 MDA 방법의 구현에 대해 설명합니다. 혈청과 대변에서 다양한 치료법의 활성과 존재를 평가하고, MDA 방법과 관련하여 핵심 장내 미생물총(core gut microbiota)에 대한 변화를 평가했습니다.
프로토콜
모든 동물 연구는 기관 지침에 따라 존스 홉킨스 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜 M021M197 및 M023M195에 따라 수행되었습니다. 사용 된 마우스 균주 (수컷 마우스, 7 주령)는 재료 표에 설명되어 있습니다. 수컷 마우스의 사용은 전립선 암의 진행중인 연구에 사용되었기 때문입니다. MDA 방법은 이전에 암컷 마우스에서도 효과적인 것으로 나타났습니다 7,17. 마우스는 각각의 케이지/치료 그룹에 무작위 배정되었습니다. 쥐는 케이지에서 특별한 순서 없이 처리되었습니다. 치료를 시행한 실험자는 치료 그룹에 대해 눈이 멀었습니다. 쥐에게 할당된 숫자는 치료된 순서가 아니라 ID를 나타냅니다. 데이터는 연구 타임라인 전반에 걸쳐 수집되었으며 편향을 피하기 위해 마지막에 분석되었습니다. 실험적 분석은 모든 데이터가 수집될 때까지 치료 그룹에 대해 맹검되었습니다.
참고: 이 프로토콜은 Scarborough et al.7에서 수정되었습니다.
1. 트리트먼트 준비
- 가당 연유(성분: 우유와 설탕)와 분자생물학 등급의 물을 우유와 물의 3:10 비율로 준비합니다. 우유의 점도로 인해 15mL 원뿔형 튜브를 사용하여 가당 연유를 측정합니다.
- 50mL 원뿔형 튜브를 사용하여 한 번에 5mL의 물을 우유와 천천히 혼합하여 분자 생물학 등급의 물과 가당 연유를 혼합합니다.
참고: 이 단계는 생물 안전 작업대를 사용하여 멸균 상태에서 수행됩니다. - 우유 용액의 부분 표본(500μL 분취액으로 보관)을 준비하고 관심 처리와 결합될 때까지 부분 표본을 4°C에서 보관합니다.
- 가당 연유/물 용액과 결합하기 전에 동물의 체중에 따라 올바른 농도로 각각의 차량에 트리트먼트를 다시 부유시킵니다.
2. MDA 교육 세션
참고: 이 섹션에서는 마우스 모델에 대해 설명합니다. 그러나 MDA 기법은 더 큰 설치류 모델의 경우 더 큰 부피/피펫 팁을 사용하여 필요에 따라 확장할 수 있습니다.
- 선택 사항: 한 손으로 목덜미를 잡고 연구 동물을 부드럽게 제지합니다.
- 단일 채널 피펫과 입으로 안내되는 200μL 피펫 팁을 사용하여 100μL의 가당 연유/물 용액만(실험적 처리를 추가하지 않음) 연구 동물에게 제공합니다.
- 동물의 입을 놓치지 않도록 우유/물 용액을 천천히 분배하십시오. 동물이 5-15초 사이에 우유 용액을 쉽게 섭취하도록 합니다.
참고: 이 교육은 최소 연속 2일(하루에 한 번의 교육 세션) 동안 진행되며 관리되는 볼륨에는 변화가 없습니다. MDA 훈련 세션을 위해 목덜미를 통한 부드러운 제지가 필요했습니다. Scarborough et al.7 은 MDA 훈련 첫날에는 동물을 완전히 제지하고 두 번째 날에는 꼬리로 제지할 것을 권장한다. 억제 방법은 더 큰 설치류 모델에 따라 다를 수 있습니다. 대조적으로, Vanhecke 등[17 ]은 훈련 중에 쥐의 꼬리를 약간만 잡고 있었다.
3. MDA 공법을 이용한 마우스 치료
- 연구 처리를 가당 연유/물 용액과 결합합니다(아래 검증 실험[섹션 4 및 섹션 5]의 예 참조).
- 선택 사항: 한 손으로 목덜미를 잡고 연구 동물을 부드럽게 제지합니다.
참고: Scarborough et al.7 은 생쥐가 훈련 기간 이후에는 더 이상 제지가 필요하지 않으며 피펫 팁으로 쉽게 마실 수 있다고 보고합니다. 이와는 대조적으로, Vanhecke 등[17 ]은 가벼운 미각 혐오감을 유발할 수 있는 일부 치료법(예: 타목시펜)의 경우, 모든 치료 중에 목덜미를 통해 마우스를 부드럽게 제지하는 것이 가장 좋다고 보고했다. 이 연구는 또한 동물을 부드럽게 목덜미로 등에 눕히는 것이 치료 소비의 시간과 효능을 향상시킨다는 것을 확인했습니다. - 훈련 세션 중에 수행된 것처럼 단일 채널 피펫과 동물의 입으로 안내되는 200μL 피펫 팁을 사용하여 100μL의 치료를 시행합니다.
- 한 번에 한 마리의 동물을 치료하십시오.
- 치료 후 각 동물을 각각의 우리에 다시 넣으십시오.
참고: MDA 방법을 사용한 치료는 매일 또는 반복적으로 투여할 수 있다 7,17.
4. 검증 실험 #1 - MDA를 이용한 장내 세균을 마우스에 경구 투여
참고: 이 섹션에서는 마우스의 장내 집락화 연구를 위해 살아있는 박테리아를 경구로 전달하기 위한 MDA 방법의 사용에 대해 설명합니다. 이 대표적인 파일럿 실험에서는 그람 양성 박테리아인 클로스트리듐 신든스(Clostridium scindens) 를 C57BL/6J 마우스에 전달합니다. 마우스는 MDA로 박테리아를 접종하기 전에 식수에서 이틀 연속 항생제(세폭시틴)를 투여했습니다.
- 박테리아 배양
- 배양 C. scindens는 냉동 글리세롤 스톡을 사용하여 강화 클로스트리듐 브로스(RCB)에서 ATCC 35704 균주를 균주하여 500μL의 박테리아를 7mL RCB 튜브에 접종합니다. 37 °C에서 밤새 혐기성으로 자랍니다.
- 500μL의 야간 박테리아 배양을 사용하여 새로운 RCB 튜브를 접종하고 24시간 동안 혐기성으로 배양합니다. 혐기성 챔버에서 이 튜브를 제거하고 MDA에 대한 박테리아 처리를 준비하는 데 사용합니다. 이 동일한 튜브를 사용하여 밀리리터당 집락 형성 단위(CFU/mL)를 계산합니다.
- C. scindens CFU/mL 계산
- 7mL의 RCB 배지에 접종된 3.5mL의 배양물을 사용하여 C. scindens 배양액을 1:3 희석합니다. 이 희석액의 샘플을 사용하여 -80°C에서 보관되는 20% 1mL 글리세롤 스톡(1:1)을 만듭니다.
- 100 μL의 1:3 희석액을 강화 클로스트리디알 한천(RCA) 플레이트에 플레이트합니다. 첫 번째 희석액을 사용하여 후속 연속 희석을 만들고 총 3회 더 플레이트를 만듭니다.
- RCA 플레이트를 배양한 후 콜로니를 세고 CFU를 계산합니다. 다음 방정식을 사용하여 희석된 샘플과 원본 샘플의 박테리아 세포 농도를 계산합니다.
희석된 샘플의 CFU(cells/mL) = (RCA 플레이트에 계산된 콜로니 수)/(RCA 플레이트에 첨가된 희석된 샘플의 양(mL))
원본 샘플의 CFU(cells/mL) = (희석된 샘플의 CFU)/(RCA 플레이트의 희석량)
- MDA에 대한 C. scindens 치료 준비
- 50 μL(이 예에서는 1.265 x 106 CFU/mL) + 50 μL의 C. scindens + 50 μL의 가당 연유/물 용액을 결합합니다.
참고: 특정 CFU가 필요한 경우 600nm에서 광학 밀도(OD) 측정으로 표준 곡선을 생성하는 것과 같은 박테리아 세포 정량화의 대체 방법을 사용할 수 있습니다.
- 50 μL(이 예에서는 1.265 x 106 CFU/mL) + 50 μL의 C. scindens + 50 μL의 가당 연유/물 용액을 결합합니다.
- MDA를 이용한 C. scindens를 이용한 마우스의 경구치료
- 1-3일째에는 섹션 2(MDA 교육 세션)에 설명된 대로 마우스가 우유 용액에 익숙해지도록 합니다.
- 4일차에 MDA를 통해 C. scindens + 우유 용액 또는 PBS(대조군) + 우유 용액 100μL를 C57BL/6J 마우스에 투여합니다. 연구 기간 동안 생쥐를 한 번 치료하십시오.
- 배설물 샘플 수집
- 쥐를 부드럽게 목덜미로 잡고 배설물 알갱이가 배출될 때까지 기다립니다. 직장에서 직접 대변 펠릿을 멸균 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 수집합니다. 샘플을 사용할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.
- C. scindens 정량적 PCR(qPCR)
- 이전에 발표된 프로토콜19,20을 사용하여 대변 DNA 추출을 수행합니다.
- 고감도 검출을 위해 DNA 형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. DNA 샘플을 10ng/μL로 정규화하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
- qPCR을 사용하여 (i) C. scindens 균주 ATCC 35704의 desA 유전자에 대해 보존된 프라이머를 사용하는 C. scindens 박테리아, (ii) 앞서 설명한 바와 같이 박테리아 16S rRNA 유전자의 V6 초가변 영역에 대해 설계된 프라이머를 사용하는 총 박테리아20,21.
참고: 사용된 qPCR 조건 및 프라이머는 표 1에 나열되어 있습니다. C. scindens 균주 ATCC 35704 DNA를 사용하는 표준 곡선을 사용하여 desA+ 박테리아의 사본을 추정했습니다.
5. 검증 실험 #2 - MDA를 이용한 실험용 약물 투여
참고: 이 섹션에서는 MDA 방법을 사용하여 실험용 화합물을 마우스에 전달하는 방법에 대해 설명합니다. 이 대표적인 파일럿 실험에서는 대두 대사산물 에퀄(S-equol)을 NSG 및 FVB/NJ 마우스에 전달합니다.
- S-equol 치료제의 준비
참고: S-equol과 dimethyl sulfoxide(DMSO)는 모두 분주되어 사용할 때까지 -20°C에서 보관됩니다.- 옥수수 기름과 결합된 DMSO에서 S-equol을 재구성합니다(90%). 옥수수 기름(220 μL)에 분주된 S-equol을 480 μL의 가당 연유/물 용액과 혼합합니다. 우유에서 기름이 분리되는 것을 피하기 위해 동물실에서 이 용액을 결합하고 혼합하십시오.
알림: 용액의 분리가 관찰되면 처리 전에 용액을 혼합하십시오. 투여되는 S-equol의 용량은 25mg/kg/day입니다. 이 연구에 사용된 쥐는 모두 체중이 비슷했기 때문에 동일한 용량을 투여받았습니다. 치료 용량을 조정하고 연구 동물 체중에 따라 여러 제제로 만들어야 할 수도 있습니다. - DMSO 차량과 옥수수 기름(90%)을 결합하십시오. 옥수수 기름(220μL)에 분주된 DMSO를 480μL의 가당 연유/물 용액과 혼합합니다. 우유에서 기름이 분리되는 것을 피하기 위해 동물실에서 이 용액을 결합하고 혼합하십시오.
알림: 용액의 분리가 관찰되면 처리 전에 용액을 혼합하십시오.
- 옥수수 기름과 결합된 DMSO에서 S-equol을 재구성합니다(90%). 옥수수 기름(220 μL)에 분주된 S-equol을 480 μL의 가당 연유/물 용액과 혼합합니다. 우유에서 기름이 분리되는 것을 피하기 위해 동물실에서 이 용액을 결합하고 혼합하십시오.
- MDA를 이용한 S-equol을 이용한 마우스의 경구투여
- 1일차와 2일차에는 섹션 2(MDA 교육 세션)에 설명된 대로 마우스가 우유 용액에 익숙해지도록 합니다.
참고: 검증 실험 #1의 경우, Scarborough et al.에 기술된 훈련 시간을 따랐으며, 이는 3일의 적응 시간을 제안했습니다. 이 실험에서는 더 짧은 훈련 시간(2일)을 테스트한 결과 관심 있는 치료법의 투여를 변경하지 않는 것으로 나타났습니다. - 3-43일째에 (i) PBS 대조군, (ii) DMSO 비히클 또는 (iii) S-equol을 모두 가당 연유/물 용액과 결합하여 마우스에 투여합니다. 용액의 마스터 믹스를 만들어 모든 연구 동물에게 균질한 처리 용액을 제공합니다. 각 마우스에 하루에 한 번, 일주일에 5일, 총 43일 동안 총 100μL씩 투여합니다.
- 1일차와 2일차에는 섹션 2(MDA 교육 세션)에 설명된 대로 마우스가 우유 용액에 익숙해지도록 합니다.
- 혈액 채취
- 안락사(이산화탄소 과다 복용) 후 심장 천자를 통해 혈액을 채취합니다. 혈액을 마이크로테이너 혈청 분리기 튜브로 옮기고 혼합한 후 추가 처리가 있을 때까지 실온(RT)에서 보관합니다.
- 254 x g 에서 5분 동안 완전 분리를 위한 원심분리기 혈액 샘플. 혈청(분리의 최상층)을 모아 사용할 때까지 -20°C에서 보관하십시오.
- 탠덤 질량분석법을 사용한 S-equol 액체 크로마토그래피(LC/MS/MS) 분석
- 이 실험에 사용된 화학 물질 및 시약에 대해서는 재료 표 파일을 참조하십시오.
- 교정 표준 및 품질 관리: S-equol 및 내부 표준(racemic equol-d4)의 원액을 1 mg/mL 농도로 DMSO에 준비하고 -20 °C에서 보관합니다.
- 스톡 표준 용액을 아세토니트릴:물(50:50)로 희석하여 농도가 다른 혼합 작업 용액을 준비합니다. 추출 용액으로 에틸 아세테이트의 내부 표준물을 100ng/mL 농도로 준비합니다. 재고 및 작업 용액을 4 °C에서 보관하고 매일, 희석 또는 직접 사용하십시오.
- 시료 추출
- 추출 용액(에틸 아세테이트 및 내부 표준물질, 섹션 5.4.3 참조)에 의한 단백질 침전을 사용하여 샘플을 준비한 다음 건조 질소(50°C) 하에서 상층액을 원심분리 및 증발합니다.
- 100μL의 50% 아세토니트릴로 시료를 재구성하고 LC/MS/MS 분석을 위해 오토샘플러 바이알로 옮깁니다.
- 시료 분리
- C18 컬럼, 2.1x50mm, 1.7μm로 분리를 달성합니다. 0.1% 포름산을 이동상 A로 사용하고 아세토니트릴 이동상 B에서 0.1% 포름산을 사용합니다.
- 그래디언트를 사용하고 0.5분 동안 0.3mL/분의 유속으로 이동상 B를 40%로 유지합니다. 그런 다음 1분 동안 유속을 100%로 높이고 2분 동안 유지한 다음 40분 동안 1% B로 돌아갑니다.
- 네거티브 모드에서 작동하는 전기 분무 이온화를 사용하는 질량 분광 검출기를 사용하여 컬럼 유출물을 모니터링합니다. 다음 다중 반응 모니터링(MRM) 전이를 모니터링하도록 분광계를 프로그래밍합니다: S-equol의 경우 241 → 119.1, 내부 표준물질인 equol-d4의 경우 245 → 123.
- 5-500ng/mL의 검량 범위를 사용하여 1/x2 가중치 기능이 있는 2차 방정식을 사용하여 내부 표준물질에 대한 분석의 면적 비율 피크를 사용하여 S-equol에 대한 검량선을 계산합니다.
6. MDA 치료가 핵심 장내 미생물총(Core Gut microbiota)에 미치는 영향 측정
참고: 이 섹션에서는 qPCR을 사용하여 MDA 처리 후 핵심 장내 미생물군 수준을 측정하는 방법에 대해 설명합니다.
- 4.5.1 및 4.6.1 단계에 설명된 대로 대변 샘플 수집 및 DNA 추출을 수행합니다.
- 고감도 검출을 위해 DNA 형광측정기를 사용하여 DNA 농도를 측정합니다. DNA 샘플을 10ng/μL로 정규화하고 사용할 때까지 -20°C에서 보관합니다.
- qPCR을 사용하여 장내 미생물총((microbiota)의 구성원의 풍부함을 조사합니다: (i) Akkermansia muciniphila, (ii) Bifidobacterium spp., (iii) Streptococcus salivarius, (iv) Lactobacillus spp. 및 (v) 앞서 설명한 바와 같이 박테리아 16S rRNA 유전자의 V6 초가변 영역에 대해 설계된 프라이머를 사용하여 총 박테리아 20,21,22.
참고: 사용된 qPCR 조건 및 프라이머는 표 2에 나열되어 있습니다.
결과
MDA는 마우스 모델에서 박테리아 균주의 경구 전달에 사용할 수 있습니다. C57BL/6J 마우스는 MDA 교육 세션을 시작하기 전에 공생 미생물 군집을 제거하기 위해 2일 동안 항생제(음용수 내 세폭시틴)를 투여했습니다. 가당 연유/물 용액을 처리 투여 전 3일 동안 매일 1회 연속으로 투여하였다. 마우스는 MDA 치료 투여 중 부드러운 목덜미에 의해 잠시 제지되었습니다. 4일째에, 마우스에게 PBS(음성 대조군, n=4) 또는 이전에 가당 연유/물 용액에 재현탁한 C. scindens (desA+ 박테리아, n=4)의 혐기성 배양물을 한 번 처리했습니다. 모든 마우스는 일반적으로 몇 초 이내에 치료를 받고 전체 용량(100μL)을 마셨습니다. 혐기성 세균의 전달과 존재를 검증하기 위해 항생제 처리 후 채취한 대변 샘플과 PBS 또는 C. scindens 처리 후 24시간 후에 채취한 대변 샘플을 비교했습니다(그림 1). 대변 DNA를 분리, 정량화 및 10ng/μL로 정규화하여 C. scindens ATCC 35704 desA 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 qPCR을 수행했습니다(표 1). 항생제를 투여한 마우스는 desA+ 박테리아가 거의 또는 전혀 없는 것을 관찰했습니다. 예상대로, C. scindens를 투여한 마우스에서 상당히 더 많은 양의 desA+ 박테리아가 관찰되었으며, 이는 PBS 대조군의 박테리아와 유의하게 달랐습니다(p = 0.0286, 그림 1).
MDA 방법을 사용한 실험 화합물(S-equol)의 전달. NSG(n=15) 및 FVB/NJ(n=18) 마우스는 처리 투여 2일 전에 가당 연유/물 용액으로 훈련을 받았습니다. NSG 마우스는 항생제 처리(식수 내 세폭시틴)를 통해 에퀴올 생성 장내 세균을 제거하고, 이에 따라 내인성 에퀴올 생산을 제거했습니다. FVB/NJ 마우스는 내인성 에쿠올 생산을 제거하기 위해 콩이 없는 식단을 먹였습니다. 모든 쥐는 치료를 시행하기 위해 부드러운 목덜미로 잠시 제지되었습니다. 대조군은 옥수수유와 함께 가당 연유/물 용액을, DMSO 그룹(S-equol의 차량 제어)은 옥수수 기름에 가당 연유/물 용액 및 DMSO를, 에쿠올 그룹은 옥수수 기름에 가당 연유/물 용액 및 에쿠올을 투여받았습니다. 생쥐는 총 43일 동안 MDA 기술로 일주일에 5일 동안 치료를 받았습니다. 생쥐는 일반적으로 몇 초 이내에 치료를 받고 전체 용량(100μL)을 마셨습니다. 전반적으로, 모든 마우스는 특정 날짜에 용량의 절반 이상을 소비했습니다 (특정 날짜에 부분 용량, 그러나 전날 또는 다음 날 전체 용량). 연구 기간 동안 치료를 완전히 거부한 쥐는 없었습니다. 우리는 스크러핑 후 생쥐를 등에 눕히면 치료 소비 시간이 단축되고 동물이 전체 복용량을 복용하도록 하는 것을 관찰했습니다.
순환하는 에쿠올 수치는 효과적인 MDA 약물 전달을 보여줍니다. 연구가 끝날 때 안락사 후 NSG 마우스에서 혈액 샘플을 채취하여 MDA의 이퀄 전달이 연구 동물의 순환 에쿠올 수치로 이어졌는지 확인했습니다. 적도를 투여한 마우스 중 하나에서 LC/MS/MS 분석을 수행하기에 충분한 혈액을 회수하지 못했습니다. 혈청 적혈구 수치는 존스 홉킨스 의과대학의 분석 약리학 공유 리소스(Analytical Pharmacology Shared Resource)에서 LC/MS/MS로 측정했습니다. 대조군과 DMSO(equol vehicle) 그룹에서는 순환 이퀄이 관찰되지 않은 반면, 이퀄 처리한 마우스에서는 검출 가능한 순환 이퀄이 관찰되었습니다(그림 2). 중요한 것은, 이 실험에서 동물 희생 날짜와 시간이 다르기 때문에 에퀴올 처리한 쥐의 순환 에퀴올 수치에 약간의 변화가 있을 것으로 예상된다는 것입니다.
장내 미생물 군집은 MDA 처리 후에도 변하지 않습니다. MDA 우유 용액(에쿠올 유무)이 장내 미생물총(microbiota)에 미치는 영향은 FVB/NJ 마우스를 사용하여 평가했습니다. 기준선에서 채취한 샘플(처리 없음/MDA 없음)과 치료 시작 후 7일(MDA 시작 후 9일, 교육일 포함)에서 채취한 샘플의 미생물 조성을 정량화했습니다. 앞서 설명한 바와 같이 종 특이적 qPCR 분석(그림 3)으로 평가한 바와 같이 핵심 장내 미생물군(Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium spp., Streptococcus salivarius, Lactobacillus spp.)의 총 박테리아 부하 또는 전체 미생물 구성에서 유의한 변화는 관찰되지 않았습니다21,22. 한 케이지는 기준선과 MDA 처리 후 사이에 락토바실러스에서 상당한 차이를 보였습니다. 그러나 이 발견은 DMSO 차량 제어에서 관찰되었으며 모든 케이지에서 일관되지 않았습니다.
그림 1: MDA는 분변 qPCR을 통해 정량화할 수 있는 혐기성 박테리아를 쥐의 장에 전달합니다. C57BL/6J 마우스는 식수에서 이틀 연속 항생제를 투여했습니다. 그런 다음 MDA 방법을 사용하여 혐기성 박테리아 C. scindens 로 마우스에 처리했습니다. 분변 C. scindens (desA+) 박테리아 부하를 항생제 처리 후 및 MDA 처리(PBS 또는 C. scindens) 후 24시간 후에 desA 유전자에 대해 qPCR로 측정했습니다. (A) C. scindens-specific desA 유전자 정량화는 항생제 처리 후 및 MDA 처리 후 24시간 후 PBS- 및 C. scindens-투여된 마우스 사이에서 나타납니다. (B) (A)에서 MDA 후 24시간 동안 표시된 것과 동일한 데이터가 열 그래프로 표시됩니다. 통계적 유의성은 비모수 Mann-Whitney 검정을 사용하여 결정되었습니다. (*) p = 0.0286, 오차 막대 = SD. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: MDA 기법을 통해 equol을 투여한 NSG 마우스의 순환 equol 수치 분석. 혈청 이퀄 수치는 대조군(n=5), DMSO(비히클, n=5) 및 이퀄(n=4) 처리한 마우스의 LC/MS/MS(MS)를 통해 정량화되었습니다. 에콰올을 투여한 쥐 중 하나에서 LC/MS/MS를 수행하기에 충분한 혈액이 회수되지 않았습니다. 이러한 치료법은 MDA 방법을 사용하여 전달되었습니다. 혈청 에쿠올은 에쿠올 투여군에서만 검출될 수 있었다. 정량화 한계< 5ng/mL입니다. 통계적 유의성은 다중 비교를 통한 비모수 일원 분산 분석(Non-Parametric One-Way ANOVA)을 사용하여 결정되었습니다(Dunn의 수정). (**) p = 0.0053, 오차 막대 = SD. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: MDA 처리 후 FVB/NJ 마우스에서 핵심 장내 세균 및 총 세균 부하 수준은 변하지 않았습니다. MDA 방법을 사용한 치료 투여 전후에 표적 미생물 군집에 대한 qPCR Cq 값에서 유의미한 변화는 관찰되지 않았습니다. 락토바실러스는 베이스라인과 MDA 처리 사이의 케이지 3에서만 유의한 차이(*, p = 0.0321)를 보였습니다. 이 발견은 케이지 간에 일관되지 않았습니다. 케이지 번호는 C1-C4로 표시됩니다. 통계적 유의성은 다중 비교를 통한 일원 분산 분석(Tukey correction)을 사용하여 결정되었습니다. 오차 막대 = SD. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 이름 | 프라이머 염기서열 | PCR 조건 |
| DesA_CS_F | 5'-GGACAGGGTGTCGGCTTTATG-3' | 93°C 3분, 34사이클(95°C 30초, 54°C 30초) |
| DesA_CS_R | 5'-TTACTTCACCTTCGCCAGTTTCTG-3' |
표 1: desA+ 박테리아(C. scindens)에 대한 프라이머 및 qPCR 조건.
| 프라이머 이름 | 프라이머 염기서열 | PCR 조건 |
| V6_F V6_R | 5'-CAACGCGWRGAACCTTACC-3' 5'-CRACACGAGCTGACGAC-3' | 95 °C, 3분 36 사이클 95 °C, 30 초 53 °C, 30 초 |
| A.muc_F A.muc_R | 5'-CAGCACGTGAAGGTGGGGAC-3' 5'-CCTTGCGGTTGGCTTCAGAT-3' | 50 °C, 5분 95 °C, 10 분 40 사이클 95 °C, 15 초 60 °C, 1분 |
| Bifido_F Bifido_R | 5'-CGGGTGAGTAATGCGTGACC-3' 5'-TGATAGGACGCGACCCCA-3' | 95 °C, 3분 36 사이클 95 °C, 30 초 53 °C, 30 초 |
| S. salivarius_F S. salivarius_R | 5'-CACGCCATGCTGGAAGTG-3' 5'-GCGATGAGCCAAGCTGAAG-3' | 95 °C, 10 분 44 사이클 95 °C, 15 초 60 °C, 1분 |
| Lacto_F Lacto_R | 5'-TGGAAACAGRTGCTAATACCG-3' 5'-GTCCATTGTGGAAGATTCCC-3' | 50 °C, 2 분 95 °C, 10 분 40 사이클 95 °C, 15 초 62 °C, 1분 |
표 2: 핵심 장내 미생물총(core gut microbiota)에 대한 MDA의 효과를 측정하기 위해 사용된 프라이머 및 qPCR 조건.
토론
OG는 이전에 여러 연구에서 평가된 바와 같이 혼란스러운 변수를 생성할 수 있는 연구 동물의 중요한 스트레스 원인이 될 수 있습니다 7,9,11,12,13,14,15,23. OG의 침입성으로 인해 OG 9,10,12,13,14,15와 관련된 문제를 최소화하기 위해 대체 기술이 사용되었습니다. 마이크로피펫 유도 약물 투여(MDA)는 단일 채널 피펫 및 관심 약물과 가당 연유 용액의 혼합물을 사용하여 덜 침습적인 방식으로 약물을 전달할 수 있는 새로운 기술입니다7. 이 기술의 중요한 단계는 동물이 피펫 팁과 가당 연유 맛에 더 익숙해질 수 있도록 하는 교육 세션(최소 2일)이며, 전반적으로 취급 시간과 고통을 줄여줍니다. 이 교육 세션은 또한 생쥐가 가당 연유 용액에 포함된 약물을 다른 기술보다 훨씬 빠르고 정확한 용량으로 즉시 섭취할 수 있도록 합니다.
우리의 연구는 Scarborough et al.7에 제시된 가당 연유/물 용액의 준비 및 전달을 면밀히 추적했습니다. 연구 기간 동안 쥐는 투여 전에 물이나 음식을 박탈당하지 않았습니다. 그들은 각자의 사육장에 보관되었으며 치료 시간은 1분 미만이었습니다. 본 연구의 주요 차이점 중 하나는, 우리가 사용한 알비노 마우스 균주의 시각 장애 가능성과 약물 치료로 인한 약간의 미각 혐오 가능성 때문에 모든 마우스는 훈련 및 치료 프로토콜의 일환으로 부드럽게 목을 긁는 짧은 억제가 필요했다는 것입니다. MDA 처리에 대한 이러한 수정은 Vanhecke et al.16에 의해 권장됩니다. 부드러운 목덜미는 쥐를 등에 눕히는 것과 함께 쥐가 우유 용액을 열심히 섭취하도록 격려했습니다. 우리는 훈련 및 치료 단계의 일환으로 부드럽게 목을 긁어야 하는 필요성은 선택 사항이며 연구에 따라 달라질 것이라고 결론지었습니다. 치료제의 투여(해당되는 경우 동물의 체중에 맞게 보정됨)는 표준화된 부피로 제공되었으며 마우스는 행동의 변화를 보이지 않았습니다. 초기 연구7에 대한 다른 약간의 수정에는 훈련 세션의 수와 각 세션에서 시행되는 양의 감소가 포함되었다. 이 연구에서 직면한 한계 중 일부는 일부 마우스가 훈련 첫날과 연구 중 시점에서 우유 용액의 전체 용량(100μL)을 마시는 데 저항하는 것을 포함합니다. 이것은 제지된 상태에서 쥐를 등에 눕히는 것으로 극복되었습니다. 이 연구는 약물과 가당 연유 용액의 상호 작용, 마우스 성별 간의 소비 차이 (MDA는 이전에 암컷 마우스에서도 효과적인 것으로 나타남 7,17) 또는 OG와 관련된 코르티코 스테론 수치 7,11,14와 같은 스트레스 마커의 상승을 평가하지 않았습니다.
이 연구에서는 MDA 기법이 실험적 치료의 정확한 용량을 전달하는 능력에 초점을 맞춘 다음 연구 동물에서 관심 치료의 대변 및/또는 순환 수준을 평가했습니다. 마찬가지로 MDA 처리로 장내 미생물총(microbiota)이 변화하는지 여부를 평가했으며, 연구 동물의 핵심 분변 미생물군 또는 총 분변 세균 부하에서 최소한의 변화가 관찰되거나 전혀 발생하지 않았습니다. 마찬가지로 MDA 처리로 인한 동물의 부상은 관찰되지 않았습니다. 결론적으로, MDA는 설치류 모델에서 단기 및 장기 치료 전달의 대체 방법으로 작용할 수 있습니다. 전반적으로 MDA는 OG 관련 부상의 위험을 줄임으로써 동물 복지에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. MDA는 다른 기술의 한계 중 일부를 극복하고 다양한 설치류 모델에서 중개 연구에 광범위하게 사용될 수 있다고 제안합니다24.
감사의 글
미국 국방부 전립선암 연구 프로그램상(Department of Defense Prostate Cancer Research Program Award W81XWH-20-1-0274) 및 전립선암 재단 챌린지상(Prostate Cancer Foundation Challenge Award) 16CHAL13의 연구 지원에 감사드립니다. 존스 홉킨스(Johns Hopkins)의 분석 약리학 공유 리소스(Analytical Pharmacology Shared Resource)의 Michelle Rudek 박사, Noushin Rastkari 박사, Nicole Anders 박사, Linping Xu에게 equol LC/MS/MS에 대한 도움을 주신 것에 대해 감사의 말씀을 전합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 200 &마이크로; L 피펫 팁 | Mettler Toledo | 17005860 | |
| AB SCIEX Triple QTRAP 5500 질량 분광 검출기 | Sciex | N/A | |
| Akkermansia muciniphila strain muc genomic DNA | American Type Culture Collection | BAA-835D-5 | |
| Ammonium acetate | Sigma– Aldrich | 5.43834 | |
| C57BL/6J 마우스 | Jackson Laboratories | Strain# 000664 | |
| C. scindens strain 35704 | American Type Culture Collection | 35704 | |
| Cefoxitin | Sagent | NDC25021-109-10 | |
| 옥수수 기름 | MedChemExpress | HY-Y1888 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 에탄올 | Fisher Scientific | AC611050040 | |
| 포름산 | Sigma– Aldrich | 5.33002 | |
| FVB/NJ 마우스 | Jackson Laboratories | Strain# 001800 | |
| 글리세롤 | 시그마– Aldrich | G5516 | |
| Hexane | Fisher Scientific | 02-002-996 | |
| LC-MS 등급 물 | Fisher Scientific | 14-650-357 | |
| 메탄올 | Fisher Scientific | 02-003-340 | |
| Microtainer 혈청 분리기 튜브 | Becton Dickinson | 02-675-185 | |
| 분자 생물학 등급 물 | Corning | 46-000-CI | |
| NSG 마우스 | Jackson Laboratories | Strain# 005557 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| Qubit DNA HS kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Racemic equol-d4 | 산타크루즈 생명공학 | sc-219827 | |
| 강화 클로스트리듐 한천 | 혐기압 시스템 | AS-6061 | |
| 강화 클로스트리듐 육수 | 혐기압 시스템 | AS-606 | |
| S-equol | MedChemExpress | HY-100583 | |
| LC-MS | 케이맨 화학 | 10010173 | |
| 단일 참조 표준 채널 피펫 | Rainin | 17008652 | |
| Streptococcus salivarius genomic DNA | American Type Culture Collection | BAA-1024D-5 | |
| Sweetened condensed milk | California Farms | B09TGQ7WV8 | |
| VSL#3 VSL#3 | B07WX1LVHL | ||
| β-glucuronidase from Helix pomatia | Sigma– 알드리치 | G7017 |
참고문헌
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