중개 마우스 스트로크 연구를 위한 표준화된 신경학적 점수를 사용한 마우스 스트로크 단위 프로토콜

요약

이 글은 대형 스트로크 마우스에서 고도로 번역되고 독립적으로 입증된 마우스 mSU(Stroke Unit) 개념을 실행하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 또한 생쥐에서 초점 실험 뇌졸중 척도를 실행하기 위한 표준화된 프로토콜을 제공하며, 이는 장기간 감지된 뇌졸중 국소 결손을 평가합니다.

초록

중동맥 폐색의 필라멘트 모델(fMCAo)은 아마도 가장 병진 마우스 스트로크 모델일 것이며, 혈관 내 재관류/재개통으로 제어된 허혈을 허용합니다. 그러나 뇌졸중 치료에 대한 현재의 임상 발전(예: 뇌졸중 단위)과 일치하지 않고, 일반적으로 실험실에서 주관적이거나 모호한 신경학적 점수를 사용하며, 높은 급성기 사망률을 나타냅니다. 여기에서는 검증된 비디오 가이드 프로토콜로 이러한 제한 사항을 해결합니다. 교육용 비디오와 의사 결정 알고리즘(위험 계층화 점수)이 포함된 마우스 스트로크 단위(mSU) 프로토콜을 제시하여 임상 스트로크 모델링과 마우스 스트로크 모델링 간의 격차를 해소합니다. 뇌졸중 신경학적 점수의 정확성과 민감도를 높이기 위해 우리는 처음으로 focal Experimental Stroke Scale(fESS)의 비디오 표준화 형식을 제시하고 뇌졸중 후 최대 6개월까지 그 가치를 입증합니다. 또한 사지의 운동 기능에 대한 편견 없는 정량적 평가를 위한 알려진 실린더 테스트와 함께 마우스 사다리 가로대 테스트에 대한 프로토콜이 제시됩니다. 결과는 mSU의 중개 효능을 강조합니다. Focal ESS(fESS)는 국소 뇌졸중 결손을 감지하고, 회복을 포착하고, 뇌졸중 후 최대 6개월 동안 민감도를 유지하는 데 있어 알려진 다른 척도보다 뛰어납니다. Ladder-rung 및 Cylinder 테스트는 전지 및 후방지 운동 결함을 장기적으로 객관적으로 정량화하고 모니터링합니다. 요약하자면, mSU, fESS 및 운동 기능 검사를 통합하면 임상적으로 관련된 뇌졸중 연구를 위한 강력한 프레임워크를 제공합니다. 당사의 프로토콜은 마우스 스트로크 연구에서 중개 가치를 향상시킵니다.

서론

거대 허혈성 뇌졸중은 전 세계적으로 이환율과 장애의 주요 원인 중 하나입니다¹. 그러나 마우스 스트로크 연구는 지금까지 거의 모든 전임상 테스트 치료법에서 중개 차단에 직면해 있다². 이 문제에 대한 여러 가지 이유와 이를 극복하기 위한 노력은 이전 간행물²에서 자세히 검토되었습니다. 이러한 문제는 임상적 발전이 관련 동물 모델에 제한적으로 통합되고² 뇌졸중 후 결손을 정확하고 민감하게 감지하는 데 있어 행동 및 신경학적 점수 체계의 약점에서 비롯된다².

최근의 발견³은 마우스의 중동맥 폐색의 필라멘트 모델(fMCAo)이 개방성 두개골 손상 및 외상을 가진 다른 모델에 비해 상당한 번역 이점이 있음을 뒷받침합니다 ^2,4. 무엇보다도, 이것은 임상 뇌졸중 설정 ^5,6,7의 재관류 및 기계적 혈전제거술을 모델링하는 유일한 것입니다. 그러나 이 모델은 뇌졸중 후 3-7일 사이에 높은 아급성 사망률에 직면해 있으며, 이는 큰 뇌졸중에 대한 장기 연구를 금지하고 최근까지 모델의 고유하고 극복할 수 없는 인공물로 간주되었습니다. 또한, 뇌졸중 후 신경학적 결손의 검출은 마우스의 크기가 작기 때문에 상대적으로 어렵고 편향되어 있으며, 특히 비임상의나 경험이 부족한 연구자들 사이에서 그러하다 ^8,9. 이 문제를 해결하기 위해 여러 그룹에서 결함을 감지하기 위한 다양한 척도를 개발했습니다. 가장 많이 사용되고 알려진 척도에는 3점 베더슨 척도(BS)¹⁰, 5점 수정된 베더슨 척도(mBS)¹¹, 5점 롱가 점수(LS)(mBS와 유사)⁶, 수정된 신경학적 뇌졸중 척도(mNSS)^12,13, 18점 가르시아 척도(GS)⁹ 및 보다 상세한 DeSimoni¹⁴ 또는 "Neuroscore"(NS)⁹로 알려져 있습니다^{. 15} 스케일. 불행히도, 이러한 척도 중 일부는 너무 조잡하여 뇌졸중 후 몇 일(BS, mBS 및 ^LS)8,9 후 몇 일의 급성기에만 국한되거나 일반적인 결손(NS)으로 인해 해석이 모호합니다.

이러한 배경에서 우리는 이전에 마우스¹³에 대한 실험적 스트로크 척도(ESS)와 함께 마우스 스트로크 단위(mSU) 지원 프로토콜을 개발하고 검증했습니다. mSU의 이론적 근거는 임상 루틴(즉, 인간 뇌졸중 단위)의 지식을 뇌졸중의 전임상 연구에 적용하는 것이었고, ESS는 이전에 존재했지만 "둔감"하거나 중복된 뇌졸중 척도를 실용적이고 정교하며 민감하고 시간 효율적인 척도로 비판적으로 통합했습니다. mSU는 생존율을 향상시키기 위해 동물 지원을 적절하게 적용하여 마우스의 기본 임상 매개변수에 대한 빈번하고 조정된 모니터링으로 구성됩니다¹³.

실제로, 우리 실험실과 다른 실험실의 데이터는 두 가지 방법의 가치를 입증합니다. mSU는 임상적 기본 지원 척도를 번역하고⁷을 인간에서 마우스로 발전시키며, 마우스에서 fMCAo의 사망률을 60-70%에서 10-15%¹³로 크게 줄여 더 큰 뇌졸중에 대한 연구를 가능하게 하며, 그 이후로 독립적인 실험실에서 효과적으로 적용될 수 있습니다 16,17,18,19. 또한, ESS는 뇌졸중 후 결핍 및 증상을 구별할 수 있고, 인간 임상 점수(인간의 국소 및 일반 징후 및 증상 간의 구별)를 모델링할 수 있으며, 뇌졸중 병변 크기와 선형 관련되어 있고, 장기적으로 결손에 민감하다^13,20. 그러나 mSU와 ESS의 입증된 가치와 효능에도 불구하고 경험이 부족한 연구자조차도 명확하고 시각화되고 표준화된 지침이 없기 때문에 mSU 적용에 대한 몇 가지 미해결 질문과 fESS의 초점 결함 점수에 대한 상당한 주관성이 남아 있습니다.

따라서 본 기사는 mSU 및 fESS 프로토콜에 대한 비디오 지원 및 명확한 지침을 제공하는 것을 목표로 합니다. 우리는 뇌졸중 연구자들이 뇌졸중 연구의 중개 효율성을 높이고, 뇌졸중 후 첫 3-10일 동안 동물의 손실을 크게 줄이고, 실험 비용을 줄이고, 궁극적으로 뇌졸중 후 몇 달 동안 신경학적 결손을 재현성 있게 평가하는 데 도움이 될 것이라고 굳게 믿습니다¹³. 또한 Ladder-rung 테스트와 실린더 테스트의 추가 조합은 fMCAo로 인한 초점지 마비(앞다리 및 뒷다리)를 쉽게 정량화할 수 있습니다.

mSU 및 fESS 효율성을 보여주기 위해 fMCAo 이후 마우스에 대한 중기(14일) 및 장기(6개월) 데이터를 제공합니다. 12주 된 수컷 C57Bl/6J 마우스(n= 31)를 사용하여 제어된 온도(22 ± 2°C)에서 12시간의 연암주기 주기와 펠릿 식품 및 물에 대한 접근을 통해 수용했습니다. 마우스를 두 개의 코호트로 나누어 각각 14일(n=10, 코호트 1) 및 6개월(n=15, 코호트 2) 동안 추적했습니다. 이 마우스는 이소플루란 마취 하에 fMCAo 13,20,21의 잘 설명된 모델을 사용하여 60분 뇌 허혈을 받았습니다. 가짜 운영 동물(n=6, 위의 두 코호트로 운영되었으나 허혈이 유발되지 않음)을 대조군으로 6개월 동안 추적했습니다. 부프레노르핀은 수술 전 및 수술 후 3일 진통제로 사용되었습니다. Ladder rung 및 cylinder 테스트는 신경학적 점수의 일부로 6개월 코호트에 대해서도 수행되었습니다.

모든 동물은 스토크 후 첫 14일 동안 다음과 같이 정의되는 인도적 평가변수에 대해 매일 검사되었습니다: 1) "마우스 스트로크 유닛" 처리(즉, 수동적 가열 및 능동적 섭식, 1.4 참조)로 개선되지 않은 심한 저체온증(<33°C) 및/또는 부동성(예: fESS 테스트 6 또는 gESS의 "자발적 활동" 테스트에서 점수 4). 1.6, 1.8) 1시간 이내, 2) 프로토콜에 따라 수술 후 진통 후에도 통증 또는 불안 행동의 징후(예: gESS의 "불안/자동 행동" 테스트에서 점수 >2).

이 프로토콜에서, mSU 형태의 마우스의 스트로크 후 지원은 fMCAo 작동에서 마우스가 회복된 직후에 시작됩니다. 이것은 3 단계로 나뉩니다 : A 단계 (재관류 후 0-48 시간), B 단계 (>48 시간 및 "필요한 적극적인 지원의 끝까지"까지, 일반적으로 개별 동물의 B 단계에 따라 10-14 일째) 및 C 단계 (14 일 이후). 각 단계(A, B 또는 C) 및 위험 계층화 점수(RSS)에 의해 평가된 일일 실제 임상 상태에 따라 각 동물에 맞춤화된 5가지 중요한 중재(방문/위험 계층화 점수, 수유, 수분, 온도 및 국소 소독, 아래 1.1.에서 1.8. 참조)가 있습니다(세 가지 전형적인 예와 함께 보충 그림 1 및 표 1 참조). mSU에 필요한 재료 및 도구는 그림 1a 에 나와 있으며 재료 표에 설명되어 있습니다. 또한 mSU 기간 동안 동물 모니터링을 위한 템플릿을 제공합니다( 보충 파일 1 참조).

프로토콜

이 기사에 보고된 실험은 실험 동물 사용에 대한 국내 및 유럽 지침에 따라 수행되었으며 그리스 정부 위원회(Athens, License No "843895_06-09-2022")의 승인을 받았습니다.

1. "마우스 스트로크 단위"(mSU)

1. 동물의 임상 상태를 매일("방문") 평가하고 RSS 점수를 계산합니다.
   1. 데이터 기록 및 모니터링을 위해 가급적이면 동물의 수술 전에 보충 파일 1을 인쇄하십시오.
   2. 이른 아침(약 08:00), 정오(14:00에서 16:00 사이) 및 늦은 밤(약 22:00 - 23:00)의 표준 시점(방문)에 각 동물을 임상적으로 평가합니다.
      참고: 동물의 후속 조치 단계에 따라 이러한 표준 방문을 조정하십시오: A단계의 경우 2회/일(아침-밤), B단계의 경우 3회/일, C단계의 경우 하루에 한 번 동물의 상태를 확인합니다. RSS 점수에 따라 방문 빈도를 추가로 조정합니다(1.1.6 참조). 작업량 감소를 위해 >2명으로 구성된 팀에서 일하는 것이 좋습니다. 아침과 밤의 방문은 성공적인 지원, 모니터링 및 사망률 감소에 매우 중요한데, 이는 생쥐의 야행성(활동적) 단계가 신진대사 및 에너지 요구량을 증가시키고 13,22,23 뇌졸중 후 야간 사망률 증가와 관련이 있기 때문입니다.
   3. 아침 방문 중에 민감한 표준 체중계를 사용하여 마우스의 무게를 잰다.
   4. 아침 방문 중에 복부 체추에 놓인 비접촉식 체온계로 온도를 측정하십시오. 등을 대고 마우스를 잡고 고정시킵니다. 고정 후 처음 몇 초 이내에 판독값을 취하십시오( 그림 1f 참조).
      알림: 동반 복막염으로 반복 측정 후 장 파열 가능성이 있으므로 직장 체온계를 사용하지 마십시오.
   5. 14일까지 매일 모든 단계에 대해 아침 방문에서 쥐의 일반적인 임상 상태(이동성, 상처, 요도 뚜껑, 반응성, 털, 수분 상태 등)를 평가하고 기록합니다.
   6. 보충 그림 1에 설명된 대로 동물의 체중, 온도 및 fESS 점수에 따라 점수를 합산하여 아침 방문에서 RSS 점수를 계산합니다. 스프레드시트 테이블에서 RSS를 자동으로 계산하려면 표 1에 있는 공식을 사용하고 조정합니다. 인도적 종점이 있는 경우 기관에서 승인된 방법으로 동물을 안락사시킵니다(위 참조).
   7. 방문 빈도와 지원 강도를 RSS 점수와 뇌졸중 후 동물의 단계에 따라 매일 조정합니다.
      참고: B 단계는 사망률에 가장 중요합니다. RSS ≥3에 대한 방문 빈도와 지원 강도를 높입니다(정의 및 지침은 표 1 참조). 동물이 C단계에서 RSS >3 계속 보이면 B단계에서와 같이 방문하여 지원하십시오. RSS와 일반적인 설명(예: 회복 중, 안정, 낮음/중간 병, 중증)을 사용하여 지원 팀 내에서 동물의 임상 상태를 설명하십시오. 14일째 이후에는 실험 프로토콜에서 요구하는 경우(예: 행동/신경학적 평가)로 동물 방문을 줄입니다.
2. 영양 지원을 위한 젤 식품 준비
   1. 블렌더를 사용하여 일반적인 식품 펠릿을 분쇄합니다(그림 1a).
   2. 식품의 칼로리 함량을 높이기 위해 5-10%의 상업용 설탕을 첨가하십시오.
   3. 물을 첨가하여 젤 같은 액체 질감을 만듭니다(그림 1b).
   4. 수동적 및 능동적 영양 지원을 위해 이 젤 식품을 사용하십시오.
      알림: 선택적으로 바로 사용할 수 있는 상업용 젤 식품을 사용하십시오. 준비된 음식은 냉장고에 2-3일 동안 보관할 수 있습니다.
3. 생쥐의 수동적 영양 지원
   1. 페트리 접시에 젤 음식을 채우고 케이지 바닥에 놓습니다(마우스에 쉽게 접근할 수 있도록 젤 음식을 제공하여 수동적 영양 지원). 페트리 접시 옆에 2-3개의 음식 펠릿을 남겨 둡니다.
   2. 매일 젤 음식으로 페트리 접시를 새로 고치십시오. 처음 며칠 동안 쥐는 페트리 접시를 케이지 침구로 채우거나 덮을 수 있습니다. 일부는 그것을 먹기 시작할 것입니다(그림 1c).
4. 적극적인 영양 섭취 지원(적극적인 수유)
   알림: 활성 공급은 B 단계에서 발생합니다. 표준 수유 빈도는 하루 3회이며 RSS 점수에 따라 더 많은 횟수(예: 하루 4-5회)로 조정됩니다. 때때로, RSS 점수가 지속적으로 0-1(즉, 작은 뇌졸중)이고 스스로 적극적으로 먹는 쥐의 경우 빈도를 1-2/일로 낮춥니다.
   1. 1mL 주사기에 젤 식품을 미리 채웁니다.
   2. 그림 1d(빨간색 화살촉)와 같이 마우스의 목 털을 부드럽지만 단단히 잡고 잡습니다.
   3. 그림 1d의 빨간색 화살표와 같이 가운데 손가락으로 쥐의 뺨을 안정시킵니다. 마우스를 단단히 잡은 상태에서 손가락을 마우스의 뺨에 대고 마우스의 코 쪽으로 옆으로 밉니다. 위치를 유지합니다.
   4. 주사기 끝을 쥐의 이빨 사이에 넣고 주사기 끝을 뺨의 안쪽으로 향하게 합니다(빨간색 화살표, 그림 1e).
   5. 매번 약 40-50 μL의 젤 음식을 주십시오 (한 입 분).
   6. 마우스를 케이지 창살에 부드럽게 되돌립니다. 씹을 시간을 허용하십시오.
   7. 각 쥐가 1-1.5mL의 겔 음식을 먹을 때까지 1-2분 후에 공급을 반복합니다.
      알림: 실행당 5-10마리의 마우스를 먹이십시오(1-2개의 케이지). 다른 쥐들은 각 쥐에게 한 입 먹을 것을 주면서 젤 음식을 먹고 삼킵니다. 이 과정은 쥐에게 스트레스를 주지 않습니다. 또한 일부 동물들은 결국 움켜쥐고 먹이를 먹기 위해 자리를 잡는 것으로 관찰되었습니다.
5. 생리식염수 보충제
   1. 아침 방문 중에 마우스의 무게를 잰다(1.1.2 및 1.1.3 참조).
   2. 값을 빼서 이전 측정과 비교한 체중 감소/증가를 계산합니다.
   3. 체중 부족 (그램)을 생리 식염수 (피하)의 mL로 보충하십시오.
      알림: 어떤 대가를 치르더라도 유체 과부하와 부종을 피하십시오. 복용량당 1-2 mL 및 하루 3-4 mL의 수분을 초과하지 마십시오. fMCAo 복용 후 36시간 후에 복용하십시오.
6. 포도당 보충
   1. 마우스의 계산된 RSS 점수와 전반적인 움직임을 확인합니다.
   2. RSS >3 및 마우스가 저체온증(<34°C) 또는 고정화/서동증의 동반 징후를 보이는 경우 0.5 - 1 mL의 5% 포도당을 피하로 주입합니다. 가급적이면 야간 방문 중에만 주사하십시오.
      참고: 뇌졸중 후에는 어떤 대가를 치르더라도 고혈당증을 피하십시오. 뇌졸중 후 고혈당증은 독성이 있다⁷. 따라서 적극적인 수유 후와 심각한 임상 상태의 경우 또는 야간 활동 중 저혈당을 예방하기 위해 포도당을 보충하십시오. 적극적인 수유(1.4 참조)는 더 부드럽고 오래 지속되는 에너지 지원을 제공하고 임상 지침 ⁷을 번역하기 때문에 주요 지원 측정이 되어야 합니다. 3일째 이전에는 포도당을 보충하지 마십시오.
7. 온도 관리(패시브)
   1. 기준선에서 수술 전과 수술 후 방문할 때마다 동물의 표면 체온을 측정합니다(그림 1a). 그림 1f 와 같고 1.1.4에 설명된 대로 측정합니다. 값을 기록해 둡니다.
      알림: 마우스의 저체온증은 체온 <35 °C ^24,25로 정의됩니다. 이전 데이터¹³은 34°C 미만의 모든 온도가 뇌졸중 후 지지에 대한 경고 신호임을 나타냅니다(아래 참조).
   2. 33°C에서 34°C 사이의 저체온증이 관찰되면 체온>34°C)에 도달할 때까지 가열판(또는 기타 수동 온난화 장치)의 케이지에서 마우스를 수동적으로 예열합니다. 동물이 활발한 열 생산을 할 수 있도록 에너지를 제공하기 위해 쥐에게 적극적으로 먹이를 공급합니다(더 오래 지속되는 에너지 공급).
      알림: 동물을 1-몇 시간 동안 수동 가열로 유지하십시오. 어떤 대가를 치르더라도 수동적 온열요법을 피하십시오.
   3. 저체온증이 관찰되면 <33 °C, 추가 포도당 투여로 지원을 확대합니다(빠르지만 짧은 에너지 공급, 위의 1.6 참조).
8. 생식기 및/또는 목 상처 청소(국소 "소독")
   알림: 때때로 상처 열구 또는 요도 플러그가 관찰될 수 있습니다. 상처 제거는 드뭅니다. 요도 플러그는 쥐 생식기 끝에 있는 단단한 플러그이며(그림 1g) 특히 뇌졸중 중증도가 높은 동물에서 더 흔하게 관찰됩니다. 마개가 요도를 막으면 요폐색증후군이 발생할 수 있으며 이환율과 사망에 이를 수 있다²⁶. 따라서 잘 청소해야 합니다.
   1. 요도 플러그가 있는 경우 생리식염수를 적셔 쉽게 제거할 수 있습니다.
   2. 각 동물 검사/방문 시 작은 면봉이나 간단한 핀셋을 통해 요도 플러그를 부드럽게 제거하십시오. 방부액에 적신 게이지나 면봉을 사용하여 요도를 소독합니다.
   3. 상처 부위가 찢어진 경우 일반적인 외과용 소독액(예: Octanisept)으로 국소적으로 소독하고 가급적이면 5/0 실크 봉합사를 사용하여 상처 부위를 정기적으로 봉합합니다.

2. 실험적 뇌졸중 척도(fESS)의 초점 구성 요소

1. 테스트 필드 준비
   1. 그림 70a와 같이 외부 자극(광학 또는 냄새)을 제거하기 위해 벤치를 청소하고 테스트 재료를 준비합니다.
   2. 보충 파일 2로 제공된 ESS 채점표를 인쇄하고 테스트를 하나씩 수행합니다.
2. 앞다리 마비(테스트 1)
   1. 마우스의 꼬리 부분에서 부드럽게 들어 올립니다.
   2. 마우스가 움직일 때 앞다리의 대칭적인 전방 확장과 대칭 이동성을 육안으로 확인하고 평가합니다(그림 2c).
   3. 다음과 같은 시각적 소견에 따른 점수: 앞다리의 정상, 대칭 확장 및 움직임에 대해 0; 1: 경미한 비대칭"의 경우, 경미한 굴곡 및/또는 반대쪽 사지의 움직임 감소 또는 사지 경직도로 정의됩니다. 2 반대측 사지의 "현저한 굴곡"에 대해; 3 몸통에 대한 반대 사지의 부착을 위해; 몸이나 팔다리가 움직이지 않는 경우 4점을 얻습니다.
      참고: 이 검사는 반대쪽 앞다리의 마비를 감지합니다. 또한 BS, LS, mNSS 및 NS 척도의 일부입니다. 점수 1은 동물의 탈출 기동으로 인해 정의하기 어려울 수 있습니다.
3. 뒷다리 마비(테스트 2)
   1. 테스트 1에 설명된 대로 마우스의 꼬리 부분을 계속 잡습니다.
   2. 뒷다리와 발가락의 대칭적인 신전과 움직임을 육안으로 확인합니다(그림 2c).
   3. 다음과 같이 결과에 따른 점수: 뒷다리와 발가락의 정상, 대칭 위치/확장 및 움직임에 대해 0; 1 반대쪽(오른쪽) 뒷다리의 움직임과 비대칭 위치/확장이 현저히 감소한 경우 명확한 비대칭을 나타냅니다(그림 2d).
      참고: 이 검사는 반대측 뒷다리의 마비를 감지합니다. 또한 mNSS 척도의 일부이기도 합니다. 이 테스트는 정확한 점수를 매기기 까다로울 수 있습니다.
4. 트렁크 대칭(테스트 3)
   1. 마우스의 꼬리 베이스를 계속 잡고 (2.3에 따라) 몸통의 움직임을 평가합니다.
   2. 결과에 따라 다음과 같이 점수: 정상의 경우 0, 몸통 굴곡 없음 또는 대칭적인 가벼운 몸통 굴곡/양쪽으로의 움직임("탈출" 동작으로); 표시된(>30°) 머리/몸통 굴곡의 경우 1, 주로 반대(오른쪽), 유지로부터 처음 10초 이내.
      참고: 이 검사는 편측 운동 병변에 의한 비대칭을 감지합니다. 또한 mNSS 점수 매기기의 일부이기도 합니다.
5. 선회 동작(테스트 4)
   1. 마우스를 평평한 표면에 부드럽게 놓고 최소 1분 동안 자유롭게 움직이도록 두십시오. 그것의 움직임 패턴을 관찰하십시오.
   2. 다음과 같이 결과에 따라 점수: 순환 동작이 없는 탐색적이고 생생하며 직선적인 움직임에 대해 0; 1 한쪽으로 돌아 가지만 닫힌 원에서는 그렇지 않은 경향; 2 닫힌 원에서 한쪽으로 불규칙한 움직임; 3, 닫힌 원에서 한쪽으로 일정한 움직임; 4는 회전, 흔들림 또는 전혀 움직이지 않습니다.
      참고: 이 테스트는 감각 운동 및 공간 탐색 결함을 감지합니다. 또한 NS의 일부입니다.
6. 신체 대칭(테스트 5)
   1. 테스트 4에서 계속 진행하여 마우스가 평평한 표면에서 자유롭게 움직이도록 합니다. 코에서 꼬리까지의 축을 관찰하십시오.
   2. 결과에 따른 점수는 다음과 같습니다 : 벤치에서 몸통을 올리고 꼬리를 곧게 펴는 정상 자세의 경우 0; 1 "약간의 비대칭"의 경우 몸이 한쪽으로 구부러지고 꼬리가 원위부로 구부러진 경우; 2: "중등도의 비대칭"의 경우, 몸이 근위부로 구부러진 꼬리 및/또는 팔다리가 몸 밖으로 뻗어 있는 반대 방향으로 몸을 구부리거나 기대는 경우; 3 "두드러진 비대칭"의 경우, 몸이 구부러진 것으로 표시된 경우 한쪽이 계속 벤치에 누워 있고 꼬리가 명확하게 근위부로 구부러져 있습니다(점수 2 이상). 4 "극도의 비대칭"의 경우 몸이 구부러져 있고 한쪽이 계속 벤치에 누워 있고 꼬리가 심하게 구부러져 있습니다.
      알림: 감각 운동 편측 절단 및 꼬리 결손을 감지합니다. 또한 NS 척도의 일부입니다.
7. 보행 평가(테스트 6)
   1. 테스트 5에서 계속 진행하여 마우스가 평평한 표면에서 자유롭게 움직이도록 합니다. 이제 걸음걸이를 관찰하고 마비, 사지 경직, 경련 보행, 사지와 같은 보행 운동 결함을 확인하십시오.
   2. 다음과 같이 결과에 따라 점수: 탐색적이고 대칭적이며 빠른 경우 신체 아래에 "숨겨진" 유연한 팔다리를 가진 정상적인 보행의 경우 0; 1 절뚝거리지 않고 자유롭게 움직이는 마우스의 뻣뻣하고 유연하지 않으며 느린 걸음걸이; 2 비대칭(좌-우) 움직임으로 명확한 절뚝거림; 3 부드럽게 밀 후 떨리거나 표류하거나 떨어지는 경우; 4 자발적인 걷기 없음(부드럽게 밀기로 자극을 받았을 때 3걸음 이상 걷지 않음).
      알림: 결합된 보행 결손을 감지합니다. 또한 NS의 일부입니다.
8. 강제 순환(테스트 7)
   1. 쥐의 꼬리 부분을 잡고 표면에서 들어 올리고 앞다리로만 걸을 수 있도록 합니다. 그것의 움직임을 관찰하십시오.
   2. 다음과 같이 결과에 따른 점수: 정상적인 선형 운동의 경우 0; 1은 한쪽으로 돌아가는 경향입니다. 닫힌 원에서 한쪽으로 회전하기 위한 2; 3 서투른 움직임으로 한쪽으로 회전하거나 느리게 원을 완성하지 못하는 경우; 4 전진하지 않고 트렁크의 앞 부분이 벤치에 놓여 있는 경우.
      참고: 이 테스트는 선회 동작 테스트(테스트 4, 2.5 참조)를 보완합니다. 아마도 감각 운동 및 공간 결함을 감지할 수 있습니다. 또한 NS 채점 시스템의 일부이기도 합니다.
9. 횡력에 대한 자세(테스트 8)
   1. 꼬리 코 축(세로)이 시상 손바닥 축과 평행한 손바닥에 마우스를 놓습니다.
   2. 마우스를 일정한 속도로 앞뒤로 스윙하여 세로 축에 수직인 힘을 유도합니다.
      알림: 이렇게 하면 마우스가 수직 위치를 유지하고 스윙하는 동안 횡력에 대해 균형을 이루게 됩니다. 몸은 일반적으로 손바닥이나 손가락에 닿지 않습니다.
   3. 시각을 관찰하고 스윙에 맞서 균형을 잡을 때 마우스의 왼쪽과 오른쪽의 손바닥 접촉을 느껴보십시오. 비대칭 넘어짐이 있는지 확인하고, 손바닥을 만지거나 측면 약화의 징후가 있는지 확인하십시오.
   4. 다음과 같은 결과에 따라 점수: 마우스가 등을 손바닥과 평행하게 하고 정상적인 직립 위치에 서 있고 손바닥을 많이 건드리지 않고 스윙에 대해 균형을 잡을 수 있는 경우 0; 안정성을 얻기 위해 스윙 중에 마우스가 몸을 평평하게 만드는 경우 1; 2 스윙 중 마우스의 일부가 누워있거나 손바닥에 잠시 닿은 경우; 3 마우스가 한쪽에 누워 있으면 직립 위치를 간신히 회복 할 수 있습니다. 4 마우스가 엎드린 위치에 있으면 수직 자세를 회복할 수 없습니다.
      알림: 이 테스트는 측면 가속도에 대한 자세 결함을 감지하지만 점수는 주관적일 수 있습니다. 또한 mNSS, NS의 일부입니다.
10. 앞다리 대상 배치(테스트 9)
    1. 마우스의 등 또는 꼬리 부분에서 마우스를 잡습니다. "도달해야 할 목표"로 기능하는 빔을 향해 수직으로 향하게 합니다. 대칭적인 "뻗기"와 잡기를 관찰하십시오.
    2. 빔을 꾸준히 잡으면 부드럽게 당겨서 앞다리가 대칭적으로 "방출"되는지 관찰합니다.
    3. 다음과 같이 결과에 따라 점수: 대칭 "뻗기", 잡기 및 "놓기"의 경우 0; 1 "손을 뻗다" 및/또는 "풀어주다"의 비대칭에 대해, 이는 반대 병변성 앞다리 약화를 나타냅니다.
11. 앞다리의 감각 운동 결손(테스트 10)
    1. 마우스의 등을 단단히 잡고 복부 방향으로 향하게 합니다(비디오 또는 그림 1e 참조).
    2. 블라인드 각도에서 가는 팁(예: 나무 이쑤시개)으로 앞발을 연속적으로 자극합니다. 앞발의 반응을 관찰하십시오.
    3. 다음과 같이 결과에 따라 점수: 정상, 신속한 파악 움직임 양측을 위해 0; 1 반대적으로 파악이 없거나 명확하게 지연된 경우.
       참고: 2.10 및 2.11 모두 앞다리 미세 감각 운동 결손 검사입니다. 또한 mNSS의 일부이기도 합니다.
12. 빔 보행(테스트 11)
    1. 1m 길이의 나무 기둥(재료 표)을 배치하여 지면에서 1-1.5m 높이에 두 개의 높은 표면(예: 벤치, 테이블)을 연결합니다. 진동이나 불안정을 피하기 위해 빔의 가장자리를 안정화합니다.
    2. 노즈-테일 축이 빔과 평행을 이루도록 빔 중앙에 마우스를 놓습니다(그림 2e). 빔 위에서 균형을 잡거나 자유롭게 걸을 수 있습니다. 균형 또는 사지 마비 및 낙상을 관찰하십시오.
       알림: 마우스는 점수를 매기기 전에 빔에서 균형을 잡아야 합니다. 동물이 떨어질 경우 보호하기 위해 동물 아래에 두꺼운 장갑(약 15-20cm 거리)을 잡으십시오.
    3. 다음과 같이 결과에 따라 점수: 마우스가 균형을 잡고 빔의 한쪽을 향해 안정된 자세로 걷는 경우 0; 1 빔의 측면을 잡고 걷지 않는 경우; 2 한쪽 팔다리가 빔에서 떨어지는 경우; 3 두 개의 팔다리가 빔에서 떨어지면; 4 마우스가 빔에서 균형을 잡으려고 시도하지만 떨어지는 경우(40초 후); 5-20초 사이에 떨어지면 40; 균형을 잡거나 빔에 매달리려는 시도 없이 떨어지면 6점을 얻습니다(<20초).
       알림: 이 테스트는 앞다리, 뒷다리 및 몸통의 결합된 운동 결손을 감지합니다. 또한 mNSS 척도의 일부이기도 합니다.
13. 수염의 감각 (테스트 12)
    1. 열린 벤치 탑에 마우스를 놓습니다(테스트 4 및 5에서와 같이). 적응할 시간을 얼마간 허용하십시오.
    2. 왼쪽과 오른쪽 수염을 "블라인드 각도"에서 얇고 긴 면봉으로 연속적으로 자극합니다. 자극을 향해 머리가 즉각적으로 회전하는 반응을 관찰하십시오.
    3. 다음과 같이 결과에 따른 점수: 자극 시 정상적이고 빠른 머리 회전, 양측성의 경우 0; 1 자극에 대한 더 느린 contralesional 반응; 반대 반응 부재(회전 없음)의 경우 2; 3 결핍 contralesional 및 느린 ipsilesional 반응에 대해; 4 양측 부재 응답의 경우.
       알림: 면의 시각적 감지를 피하십시오. 이것은 동측 머리 회전을 잘못 유발할 수 있습니다. 이 테스트는 쥐가 수염 자극에 "놀랄" 때만 기술적으로 정확합니다. 이 검사는 또한 NS의 일부이며 수염(배럴 피질)의 감각 운동 결함을 감지합니다.
14. 클라이밍 (테스트 13)
    1. 고무 코팅된 45° 각도의 경사진 표면(그림 2a)을 사용하고 마우스를 중앙에 놓습니다. 기어오르려는 쥐의 노력을 관찰하십시오.
    2. 다음과 같이 결과에 따라 점수: 마우스가 빠르고 힘들이지 않고 표면 위로 올라가는 경우 0(정상); 1 긴장으로 오르면 사지 약화로 올라갑니다. 2 미끄러지거나 오르지 않고 경사면을 유지하는 경우; 3 낙상을 방지하기 위한 노력에도 불구하고 경사면에서 미끄러진 경우; 4 넘어지지 않도록 노력하지 않고 미끄러지는 경우.
       알림: 이 테스트는 NS의 일부이기도 하며 일반적인 모터 강도를 감지합니다.
15. 테스트 1에서 13까지의 모든 점수를 합산하여 fESS 점수를 계산합니다.
    알림: fESS 점수 0은 일반 마우스를 나타내고 최대 점수는 42입니다. 선조체 및 피질 병변이 있는 큰 경색은 일반적으로 점수 >7-9를 유발합니다. 스트로크가 있는 마우스를 평가하기 전에 여러 정상 마우스를 검사하고 점수를 매겨 정상 동작의 변형을 수용하고 위양성 fESS 점수를 줄입니다. 전체 실험에 걸쳐 점수 표준화를 위해 제공된 비디오 프로토콜을 지속적으로 사용합니다.

3. ESS(gESS)의 일반구성 요소

참고: gESS를 평가하여 일반적으로 fMCAo 후 처음 1-2주 동안 나타나는 염증 또는 감염과 같은 "일반 마우스 질병"의 징후를 감지합니다. 보충 파일 2의 채점표를 사용합니다. 가급적이면 fESS를 완료한 후 gESS를 평가하십시오.

1. 마우스를 평평한 표면(벤치)에 놓고 2.5와 같이 자유롭게 움직이도록 둡니다. 다음 점수를 순차적으로 평가합니다.
2. 그것의 털을 관찰하십시오. gESS 점수표에 따른 점수(점수 0-2, 보충 파일 2 참조).
3. 쥐의 깜짝 놀람 반응 확인: 쥐가 편안해질 때 맹목적인 각도에서 갑자기 박수를 쳐서 쥐를 놀라게 합니다. gESS 점수표에 따라 쥐 귀의 반응을 확인하고 점수를 매깁니다(점수 0-2, 보충 파일 2 참조).
4. 이완된 쥐의 눈을 시각적으로 평가: 뜨거나 감긴 눈 또는 점액의 존재를 확인합니다. gESS 점수표에 따른 점수(점수 0-4, 보충 파일 2 참조).
5. 쥐의 일반적인 자발적인 활동과 주의력을 관찰하십시오. gESS 점수표에 따른 점수(점수 0-4, 보충 파일 2 참조).
6. 쥐를 다루는 동안 불안, 과흥분, 공격성 또는 축을 따라 회전하는 존재가 있는지 쥐의 일반적인 자발적인 행동을 관찰하십시오. gESS 점수표에 따른 점수(점수 0-4, 보충 파일 2 참조).
7. 위의 모든 단계(관찰 점수, 3.2단계에서 3.6단계)의 점수를 더하여 gESS의 점수를 계산합니다.
   참고: gESS 점수는 뇌졸중 병변에 의해 유발된 국소 결손을 감지하지 못하며 이전에 표시된 바와 같이 mSU의 영향을 받지 않습니다 ¹³. 모든 테스트는 NS 척도 ^9,15에서 조정됩니다.

4. Cylinder Test를 통한 앞다리 결손의 정량화

알림: 실린더 테스트는 이전에^{자세히 9,15,27}에 설명되어 있으며 여기에서는 자세히 설명하지 않습니다. 실린더 테스트는 앞다리의 결손을 편향되지 않게 정량화하는 독립적인 행동 테스트입니다(4.2 참조).

1. 여기에 제공된 지침에 따라 테스트를 실행합니다¹⁵. 비디오를 캡처하고 ¹⁵와 같이 분석합니다. 벽에 대한 오른쪽 및 왼쪽 첫 번째 팔다리 접촉을 측정합니다. 그림 3a,b는 설정 이미지를 보여줍니다.
2. 반대(오른쪽) 마비로 인한 사지 사용의 측면화를 % 백분율로 계산합니다. 왼쪽 단계에 대한 % preference = [(왼쪽 - 오른쪽) 첫 번째 연락처 / (오른쪽 + 왼쪽) 연락처] x 100 공식을 사용합니다.
   알림: 스트로크를 유도하기 전에 각 마우스에 대해 기준선 실린더 테스트를 실행하십시오. 각 실험 계획에 따라 특정 시점에 테스트를 실행합니다.

5. Ladder-rung Test를 통한 앞다리 및 뒷다리 결손의 정량화

알림: 플렉시글라스( 그림 3c 참조)에서 마우스용 장치를 구성합니다: 1cm 높이의 벽이 있는 20m 길이의 복도, 3mm의 일정한 간격으로 배치된 플라스틱 가로대(직경 15mm) 및 말단 끝에 있는 "피난처" 상자. 친숙함을 위해 동물 침구를 피난처 상자에 넣고 보상으로 음식 알갱이나 땅콩 버터를 넣으십시오. 복도의 너비는 10cm여야 하며 지면에서 약 30cm 높아야 합니다.

1. 실험의 기준선 1-3일 전에 장치에서 마우스를 훈련시킵니다. 5.1.1 - 5.1.4단계와 같이 훈련을 실행합니다.
   참고: 동물이 정지, 회전 또는 탐색 행동 없이 가로대 복도를 통해 일정하고 정상적인 보행을 할 수 있도록 훈련이 필요합니다. 연속 2일(2세션) 동안 훈련을 수행합니다. 각 훈련 세션은 3번의 달리기(달리기 = 대피소를 향해 전체 복도를 한 번 걷기)로 구성됩니다. 후속 조치를 위해 기준선 데이터 수집이 필요합니다.
   1. 매번 달리기 전에 70% 알코올로 가로대와 벽을 청소하여 냄새와 마우스의 "탐색적" 산만함/정지를 방지하십시오.
   2. 사다리 가로대 복도의 시작 부분에 마우스를 놓고 대피 상자를 향하게 하여 달리기를 시작합니다. 쥐가 복도 끝에 있는 대피소를 향해 자유롭게 걸어가게 하십시오. 동물을 강제로 걷게 하지 마십시오.
      참고: 훈련 중 달리기는 일반적으로 지속 시간과 걷기 패턴 측면에서 매우 가변적입니다. 훈련의 목표는 보통 <10초 이내에 정지/회전 없이 대피소를 향해 안정적으로 걷는 것이며, 이는 보통 두 번째 훈련일이 끝날 때까지 달성됩니다. 적절한 훈련을 방해할 수 있는 스트레스 유발을 피하기 위해 동물을 항상 부드럽게 다루십시오. 동물이 복도에서 제거되고 복도에 남아 있으면 달리기를 다시 실행하고 습관화를 피하기 위해 >1분 동안 지역을 탐색하십시오.
   3. 1^차 훈련 실행을 수행합니다. 동물을 5^차 실행 후 1분 동안 피난처 상자에 넣으십시오.
      알림: 이 연장된 휴식 시간을 통해 마우스는 피난처 상자에 익숙해지고 도달해야 할 "휴식/보상" 목표로 인식할 수 있습니다. 피난처 상자에 대한 "보람 있는 인식"을 얻는 것은 성공적인 달리기를 위해 매우 중요합니다.
   4. 피난처 상자에서 마우스를 제거하고 5.1.2와 같이 두 번째 및 세 번째 훈련 실행을 수행합니다. 습관화를 피하기 위해 이 달리기가 끝날 때 피난소에서 더 짧은 휴식 시간(30-60초)을 허용하십시오.
      참고: 교육은 2일차에 완료됩니다. 2일째가 되면 거의 모든 동물이 일정한 속도로 복도를 걷는 법을 배웁니다. 동물이 학습하지 않는 경우 추가 실험에서 제외하는 것을 고려하십시오.
2. 훈련된 쥐에 대해 실험을 실행합니다. 실험 및 기준선의 모든 시점 동안 매번 2회 실행하도록 마우스를 테스트합니다.
   1. 5.1.1 및 5.1.2 단계에 설명된 대로 실행을 수행합니다. 피난처에서 5번의 런 사이에 최대 2분의 휴식 시간을 허용합니다.
   2. 스마트폰(또는 이에 상응하는 카메라)과 "셀카봉"을 사용하여 일정 거리에서 약간의 복부 각도와 "블라인드" 각도로 동물의 비디오(데이터)를 캡처합니다( 그림 3c2 참조). 동물이 복도를 걸을 때 팔다리를 캡처해야 합니다. 달리는 동안 마우스의 주의를 시각적으로 산만하게 하지 말고 달리는 동안 팔다리를 따라가십시오(그림 3c2).
   3. 두 실행을 모두 기록하되 두 번째 실행의 데이터를 사용하고 분석합니다.
   4. 슬로우 모션 옵션이 있는 미디어 플레이어 소프트웨어를 사용하여 비디오를 사용하여 각 팔다리(왼쪽/오른쪽, 앞다리/뒷다리)(그림 3c3)에 대한 가로대 사이의 오류 단계(낙하) 수를 측정합니다. 앞다리와 뒷다리에 대해 별도로 오른쪽 및 왼쪽 다리 결함 단계 간의 절대 또는 % 차이를 계산합니다.
      참고: 두 번째 실행은 더 신뢰할 수 있는 결과를 제공합니다. 건강한 마우스는 일반적으로 두 번째 실행 중에 팔다리(오른쪽 또는 왼쪽)당 0-1개의 임의의 오류 단계를 가지며 일반적으로 0 ±1의 차이 범위를 제공합니다. 스트로크가 있는 마우스는 오른쪽(반대측) 마비 사지(앞다리 또는 뒷다리)로 결함 단계를 만들어 긍정적인 "오른쪽" 측면화를 초래합니다. 심하게 뇌졸중을 앓은 동물은 뇌졸중 후 처음 7-10일 동안은 속도가 느려지거나 달리기를 완료하지 못할 수 있지만, 그 후에는 적절한 달리기를 달성하고 심각한 결핍을 보일 수 있습니다.

결과

상술한 바와 같이, mSU는 fMCAo 연산 후에 시작된다. fMCAo stroke 및 sham의 두 개의 독립적인 마우스 코호트에 대한 당사의 대표 결과(그림 4a)는 특히 3일에서 10일 사이의 임계 기간 동안 이전에 입증된 mSU의 값을 확인합니다¹³. 우리 코호트에서는 뇌졸중 병태생리학의 일환으로 코호트 1의 3/15마리(뇌졸중, 6개월 추적관찰), 코호트 2의 2/10(뇌졸중, 14일 추적관찰), 가짜 운영 동물의 0/6(그림 4a)에서 폐사율이 발생했으며(모두 아침 방문 중에 죽은 채로 발견됨) 점수에 포함되었습니다. 어떤 동물도 사전 정의된 인도적 평가변수에 따라 안락사되지 않았다. A상(초기 fMCAo 후 24-48시간) 내에서의 이러한 급성 사망률(10-15%)(그림 4a)은 큰 지역 뇌졸중으로 인한 반구 부종 ...

토론

본 프로토콜은 mSU 지원 프로토콜에 대한 포괄적인 가이드로, fMCAo 모델¹³에 의해 대규모 영토 스트로크를 받은 마우스에서 3-10일 사이의 인공물 사망률을 줄이기 위해 고안되었습니다. 또한, 본 프로토콜에는 뇌졸중 후 마우스에서 신경학적 초점 점수의 확장된 주관성 및 편향을 줄이기 위해 ESS 척도(fESS)의 초점 구성 요소에 대한 표준화된 비디오 가이드가 포함되어 있습니다. 이와 함께 장기(최대 6개월) 반대측 전지 및 후방 운동 결손을 정량화하기 위한 Ladder-rung 테스트를 소개합니다.

mSU는 사용자 친화적이고 효과적입니다. 당사의 비디오 지원 프로토콜은 경험이 없는 연구자도 mSU를 적용할 수 있도록 합니다. mSU의 3단계(즉, 단계 A, B 및 C, 위 프로토콜의 섹션 1 및 그림 1h 참조)는 평...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
mSU
5% 포도당 용액용 도구	VIOSER S.A	na (해당 사항 없음)	모든 genericon
비접촉식 디지털 온도계	AVRON	YTC20095	모든 genericon
디지털 체중	KERN & Sohn Gmbh	FCB6K1	Any genericon
식품 펠릿	Mucedola srl	na	Any genericon, 동물 시설의 일반 식품을 사용하십시오
가열판	Photax	na	Photax 식기 따뜻한 2
액체 방부제	Sch ü LKE & Mayr GmbH	na	Octenisept®
일반 식품 블렌더		na	펠릿 분쇄용. 모든 genericon
일반 식염수	DEMO SA	염화	나트륨 주입 0,9 %
Pinsetter 및 면봉			모든 genericon
설탕		또는	27
	및	주사기 (1ml)를 사용합니다	. 식품 투여(바늘 없음) 및 피하 유체 투여(바늘 포함)
<강한>ESS용 도구
45도; 각진 표면	구성하십시오		플렉시글라스 또는 기타 재료로 만들어졌으며, 고무 표면이 있으며, 등반 테스트를 위해
면봉	모든 genericon	또는	상업용 귀 면봉은 면 끝을 길고 얇게 가장자리
를 날카롭게 만든 나무 막대		. 예를 들어 이쑤시개	일반적인
무엇입니까?	그것을 구성		크기 : 1 x 1 x1cm, 약 100cm 길이, 나무. 빔 워킹 테스트를 위해 두 개의 테이블 가장자리 사이에 놓
으십시오. 두꺼운 장갑		빔에서 떨어질 때 동물 외상을 방지하기 위한	모든 제네릭