방법 논문

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

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DOI:

10.3791/66866

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2024년 6월 14일

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1Department of Cardiovascular Sciences, Aging + Cardiovascular Discovery Center, Temple University, Lewis Katz School of Medicine, 2Raymond G. Perelman Center for Cellular and Molecular Therapeutics, The Children's Hospital of Philadelphia, 3Department of Child and Adolescence Psychiatry, Children's Hospital of Philadelphia

이 논문에서

요약

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

초록

지난 10년 동안 단일 세포 접근법은 유전자 발현 역학, 세포 이질성 및 샘플 내 세포 상태를 연구하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 단일 세포가 발전하기 전에는 초기 개발 과정에서 역동적인 세포 환경과 빠른 세포 전이를 포착하는 것이 불가능했습니다. 이 논문에서는 배아 E6.5일부터 E8일까지의 마우스 배아에 대해 단세포 및 핵 분석을 수행하도록 견고한 파이프라인을 설계했으며, 이는 위축작용의 시작 및 완료에 해당합니다. 위축(Gastrulation)은 기관 형성에 필수적인 세 가지 생식층, 즉 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm)을 형성하는 발달 과정의 기본 과정입니다. 야생형 주위 배아에 적용되는 single-cell omics에 대한 광범위한 문헌을 이용할 수 있습니다. 그러나 돌연변이 배아에 대한 단세포 분석은 여전히 부족하며 FACS로 분류된 집단에 국한되는 경우가 많습니다. 이는 부분적으로 유전형 분석, 임신 시기 제한, 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수, 이 단계에서 배아당 세포 수의 필요성과 관련된 기술적 제약 때문입니다. 여기에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 고안된 방법론을 제시합니다. 이 방법은 원하는 유전자형과 동기화된 임신 가능성을 높이기 위해 번식 및 시기별 임신 지침을 설정합니다. 당일 유전형 분석 프로토콜(3시간)과 결합된 배아 분리 과정의 최적화 단계를 통해 미세 방울 기반 단일 세포를 같은 날에 수행할 수 있어 세포의 높은 생존력과 강력한 결과를 보장할 수 있습니다. 이 방법에는 배아에서 최적의 핵 분리를 위한 지침이 추가로 포함됩니다. 따라서, 이러한 접근법은 위축(gastrulation) 단계에서 돌연변이 배아(mutant embryo)에 대한 단세포 접근법의 실현 가능성을 증가시킨다. 우리는 이 방법이 돌연변이가 위골의 세포 환경을 어떻게 형성하는지에 대한 분석을 용이하게 할 것으로 기대합니다.

서론

위축은 정상적인 발달에 필요한 기본적인 과정입니다. 이 빠르고 역동적인 과정은 만능 세포가 장기가 형성되는 방식을 정의하는 계통 특이적 전구체로 전환될 때 발생합니다. 수년 동안 gastrulation은 오랫동안 중배엽, 외배엽 및 내배엽의 세 가지 크게 균질 한 집단의 형성으로 정의되었습니다. 그러나, 고해상도 기술과 새로운 배아 줄기 세포 모델(embryonic stem cell model)1,2은 초기 생식층(germ layers)3,4 사이에서 전례 없는 이질성(heterogeneity)을 밝혀내고 있다. 이것은 위스트룰라의 뚜렷한 세포 집단을 조절하는 메커니즘에 대해 밝혀져야 할 것이 훨씬 더 많다는 것을 시사합니다. 마우스 배아 발달은 gastrulation 3,5 동안 초기 세포 운명 결정을 연구하는 가장 좋은 모델 중 하나였습니다. 생쥐의 위축은 배아 E6.5일에서 E85까지 48시간 이내에 전체 위형성 과정이 발생하기 때문에 빠릅니다.

최근 단세포 기술의 발전으로 야생형 마우스 배아 발달에 대한 상세한 매핑이 가능해졌으며, 이는 위축작용 중 배아의 세포 및 분자 환경에 대한 포괄적인 개요를 제공합니다 3,4,6,7,8. 그러나, 이 단계에서 돌연변이 배아에 대한 분석은 덜 일반적이며, 종종 FACS에 의해 분류된 집단에 국한된다 9,10. 희소한 문헌은 유전형 분석이 필요한 gastrulating embryos의 조작 및 단일 세포 준비와 관련된 기술적 문제를 반영합니다. 위축의 역동적인 과정을 포착하는 것은 특히 돌연변이 배아를 이해하는 데 있어 빠른 특성으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 임신 시기와 동기화는 매우 중요한데, 임신 시기가 정해진 임신 간의 조금만 차이 나도 돌연변이 유전자에서 비롯된 발달 표현형으로 잘못 해석될 수 있기 때문입니다. 이것은 돌연변이 유전자가 위형성 과정에 영향을 미칠 때 특히 중요해진다13,14. 이 연구에서는 질 마개(즉, 짝짓기 후 암컷의 질에서 형성된 응고된 정액의 질량)의 시각화를 통해 동기화된 임신을 얻기 위한 지침을 수립합니다. 또한, E6.5에서 E8까지의 돌연변이 배아로부터 강력한 단세포 데이터를 얻기 위한 전략이 고안되었습니다. 이 전략은 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수가 적고 배아 또는 세포의 동결-해동으로 인한 생존력 감소와 관련된 제약을 극복하기 위해 고안되었습니다.

이 논문은 질 플러그를 통한 시간 제한 임신의 확립부터 단일 세포/핵의 최종 시퀀싱에 이르기까지 최적화된 방법론을 설명합니다. 이 방법은 원하는 유전자형을 가진 더 많은 수의 배아를 얻기 위해 동기화된 임신 수를 늘리는 방법, 세포의 생존력을 개선하기 위한 세포/핵 분리 및 당일 유전형 분석 프로토콜을 설명하는 방법을 설명합니다. 이 원고는 또한 다양한 위축 시점에서의 배아 분리 과정을 설명합니다. 이 방법론은 염기서열분석을 위한 최종 생존 가능한 배아 세포/핵의 수를 증가시켜 고품질 염기서열분석 데이터를 보장하는 데 도움이 됩니다. 따라서 이 방법은 유전형 분석이 필요한 배아의 단세포 연구의 문을 열 것입니다.

프로토콜

이 프로토콜과 설명된 모든 동물 실험은 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 국제 지침을 따르는 템플 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Temple University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제정한 기관 지침에 따라 공식적으로 승인되었습니다. 기술된 모든 마우스는 C57/BL6N 배경 균주에 있었다. 이 연구에서 동물의 건강에 대한 우려는 관찰되지 않았다.

1. 번식 식민지와 시간 제한 임신

  1. 질 플러그의 시각화로 임신 시간을 정하십시오. 플러그 당일 정오는 E0.5로 간주됩니다.
  2. 부서진 나무 침구와 종이 둥지 재료가 포함된 침구 재료가 있는 우리에 있는 집 쥐.
    1. 각 케이지에는 쥐 차우, 담수 및 농축 항목(예: 터널 및 둥지 재료)이 들어 있습니다. 시간 제한 번식 동안 매일 군집 정보를 추적하고 수집합니다.
    2. 쥐의 나이, 암컷 쥐의 임신 횟수, 수컷 쥐가 삽입한 플러그의 수, 암컷 쥐의 발정 단계(그림 2)와 같은 모든 정보를 기록합니다.
      참고: 이미 1-2번 출산한 암컷은 향후 임신에서 더 큰 새끼를 낳을 것입니다.
  3. 시간 제한 임신을 시작하기 전에 번식 1주일 전에 수컷 쥐를 케이지에 혼자 수용하십시오. 번식이 시작되는 주간에는 수컷 한 마리당 최소 1마리의 암컷을 케이지에 도입합니다.
    알림: 승인된 동물 프로토콜에 따라 번식 케이지에 2-3마리의 암컷을 추가하는 것이 허용될 수 있으며 플러그 생성을 늘리는 것이 좋습니다.
  4. 최소 4개의 번식 트리오(암컷 쥐 2마리 대 수컷 1마리)를 설정하여 케이지 전체에서 동기화된 임신 가능성을 높입니다(즉, 같은 날에 여러 플러그). 이것은 동일한 발달 단계에서 분리된 배아의 수를 증가시킬 것입니다.
  5. 오후 5시 이전에 오후나 저녁에 이상적인 짝짓기를 준비하고 암컷은 수컷의 케이지에 넣거나 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 4-5일 내에 번식이 이루어지지 않으면 이틀에 한 번씩 짝짓기 파트너를 바꾸는 것을 고려하십시오.
    참고: 다음 날 아침에 질 플러그를 확인할 수 없는 경우, 전날 밤(예: 주말/공휴일)에 번식 쌍을 분리하십시오.
  6. 매일 이른 아침에 질 마개를 확인하십시오. 오전 9시 이전이 선호됩니다.
    1. 질 마개가 있는지 확인하려면 암컷 쥐의 꼬리 바닥을 부드럽게 들어 올리고 질 입구를 관찰하십시오. 흰색 또는 크림색의 젤라틴 덩어리를 찾으십시오. 종종 질 마개가 뚜렷할 수 있지만 불분명한 경우 핀셋을 사용하여 질 입구를 부드럽게 조사하십시오. 절연을 위해 더 명백한 플러그만 고려하십시오. 그림 2C를 참조하십시오.
      참고: 잠재적인 임신을 놓치지 않도록 가능한 한 일찍 아침 일찍 질 마개를 확인하는 것이 중요합니다. 플러그는 12시간 후에 떨어지거나 녹을 수 있습니다.
      알림: 플러그가 관찰되더라도 암컷 쥐가 임신할 것이라는 보장은 없습니다. 부분적으로 플러그가 관찰되거나 전혀 관찰되지 않지만 암컷 마우스의 질 입구 근처에 발적이 있는 경우 플러그가 붙을 가능성이 적으므로 이러한 암컷을 격리로 간주하지 마십시오. 교미 후 임신 가능성은 쥐 균주에 따라 다르며 교미 중 발정 주기의 단계에 따라 다릅니다(그림 2).
  7. 질 플러그가 관찰되면 하루를 기록하십시오. 질 마개가 관찰된 같은 날 정오는 E0.5로 간주됩니다. 번식 케이지에서 암컷 마우스를 분리하고 원하는 위형성 단계에 따라 배아를 분리합니다.
    참고: 이 방법은 짝짓기를 위한 정확한 타이밍을 제공하지 않습니다. 일반적으로 짝짓기는 전날 밤 자정 경에 발생하는 것으로 가정합니다. 결과적으로, 배아는 질 마개가 관찰된 날 정오까지 반나절(E0.5)이 된 것으로 간주됩니다.

2. 위축(gastrulation) 중 마우스 배아의 분리

  1. 배아 분리를 시작하기 전에 필요한 모든 시약과 장비를 준비하십시오.
    1. 70% 에탄올로 해당 부위를 철저히 청소하십시오. 모든 해부 도구(집게 및 가위)가 세척되고 멸균되었는지 확인하십시오. 멸균 5mL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)/10% 소 태아 혈청(FBS) 및 20mL DPBS-/- 를 구하여 얼음에 넣습니다.
    2. 총체적 발달 표현형을 돕기 위해 투과광 스테이지와 카메라가 있는 실체현미경을 사용하여 모든 분리를 수행합니다.
  2. 임신한 쥐댐을 안락사시키고 즉시 격리를 시작한다.
    1. 분당 케이지 부피의 20%를 변위하도록 조정된 CO2 유속과 함께 임신 댐을 CO2 챔버에 놓습니다. 쥐를 면밀히 관찰하고 호흡 움직임이 없는 것을 관찰하여 죽음을 확인합니다.
    2. 호흡 움직임이 없는 후 추가로 2분 동안 CO2 흐름을 유지합니다. 자궁 경부 탈구를 수행하여 안락사를 확인합니다.
    3. 단단하고 평평한 표면에 정상적인 서있는 자세로 마우스를 배치하십시오. 그런 다음 한 손의 엄지와 첫 번째 손가락을 두개골 기저부의 목 뒤쪽에 대고 앞뒤로 밀면서 다른 손으로 꼬리 받침대를 잡고 뒤로 당깁니다.
    4. 경추의 분리를 느껴 탈구의 효과를 확인합니다. 척수가 절단되면 후두과두와 첫 번째 경추 사이에 2-4mm의 공간이 만져집니다.
      참고: 세포 생존력에 영향을 미치므로 한 번에 여러 개의 임신한 댐을 안락사시키지 마십시오. 이소플루오란은 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 또는 이에 상응하는 기관에서 승인한 경우 대체 마취제로 사용할 수 있습니다.
  3. 임신한 댐을 등에 대고 질 입구 근처를 에탄올로 소독합니다.
    1. 해부 가위와 핀셋을 사용하여 질 입구 근처의 피부 주름을 들어 올리고 작은 V 자형으로 절단하여 임신 댐의 자궁을 천천히 드러냅니다(그림 3 [노란색 화살표]).
    2. 임신한 자궁 뿔의 한쪽 끝을 핀셋으로 잡고 따라 잘라 자궁 경부를 제거하십시오. 얼음 위에 DPBS-/- 가 들어 있는 10cm 페트리 접시에 자궁 뿔을 넣습니다(그림 3).
      참고: 배아 분리 단계에 따라 자궁은 더 작거나 더 큰 착상 부위(즉, 끈에 있는 '진주')와 유사합니다.
  4. 해부 가위와 핀셋을 사용하여 내부의 부종이 있는 각 이식 부위('진주')를 자르고 얼음 위에 6cm 페트리 접시에 신선한 DPBS-/- 에 넣습니다(그림 3).
    참고: 평균적으로 임신한 댐에는 약 6-8개의 배아가 이식됩니다.
  5. 하나의 이식 부위를 가져와서 실체현미경 스테이지 위에 있는 새로운 6cm 페트리 접시에 놓고 그 위에 500μL의 DPBS-/- 를 추가합니다. 현미경과 광원의 초점을 조정합니다(그림 3).
    알림: 이식 부위의 크기에 따라 DPBS의 양이 달라질 수 있습니다. 목표는 이식 부위가 물에 잠길 수 있을 만큼 충분한 DPBS를 확보하는 것입니다.
  6. 끝이 가는 박리 핀셋을 사용하여 착상 부위에서 자궁 근육을 제거합니다. 한 손에 핀셋 한 세트를 들고 착상 부위를 누르고 다른 손으로 다른 한 쌍의 겸자를 자궁 뿔에서 잘라낸 착상 부위 끝에 천천히 삽입하여 십막골 부종을 천천히 드러냅니다(그림 3).
    알림: 자궁 표면을 너무 세게 당기거나 잡아당기면 자궁 부종이 파열되거나 배아가 용해될 수 있습니다.
  7. 좌엽 부종이 분리된 후 배아를 공개합니다.
    1. 한 쌍의 겸자로 경막 종윤의 항 중성 부종을 잡고 다른 쌍으로 중막 종단에서 경막 종윤의 약 1/4 크기(즉, 종종 경막 종윤의 더 뾰족한 끝)를 수평으로 절단합니다.
    2. 이제 양쪽 겸자를 사용하여 두엽 부종의 anti-mesometrial 끝에서 천천히 밀어내면 배아가 갓 절단된 mesometrial 끝에서 튀어나옵니다(그림 3).
      알림: 배아가 깨질 수 있으므로 부풀어 오른 부분을 찢지 마십시오. 필요한 경우 경부 팽윤의 중간 끝을 따라 더 작게 자릅니다.
  8. 배아가 드러나면 부착된 배아 외 조직을 제거합니다.
    1. 두정엽 내배엽 주머니와 외태반 원뿔은 폭로 과정에서 배아에서 자발적으로 떨어질 수 있지만, 그렇지 않은 경우 한 쌍의 겸자를 사용하여 관련 모체와 함께 제거하십시오. 그런 다음 두 개의 집게를 사용하여 한 쌍으로 배아를 누르고 다른 쌍을 사용하여 배아에서 내장 난황낭을 천천히 벗겨냅니다.
    2. P20 피펫을 사용하여 접시에서 DPBS-/- 가 10μL 이하인 난황낭을 얼음 위의 8스트립 중합효소 연쇄 반응(PCR) 튜브에 넣으면 당일 유전형 분석에 사용됩니다.
      참고: 난황낭 샘플이 임신한 댐의 조직으로 오염되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 오염은 배아의 잘못된 유전자형 할당으로 이어질 수 있습니다.
  9. 갓 분리된 배아의 밝은 필드 사진을 찍어 새끼의 병기가 비슷한지 확인합니다. P200 피펫을 사용하여 50μL의 DMEM/10% FBS로 배아를 천천히 피펫팅하고 얼음 위의 1.5mL 튜브에 넣습니다. 유전자형이 확인될 때까지 배아를 얼음 위에 두십시오.
    참고: 배아는 명백한 분해 없이 3-4시간 동안 얼음 위에 보관되었지만, 세포 생존율의 감소가 발생할 수 있으므로 이 시간을 초과하지 마십시오. 그에 따라 배아와 유전형 분석 튜브에 라벨을 붙입니다. 명시야 이미지를 촬영하는 것은 배아 간의 총체적인 표현형 차이를 식별하고 주석을 달기 위해 권장됩니다.
  10. 남아 있는 모든 좌엽 부종에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 분리 도구를 청소하고 모든 분리에 새 플라스틱을 사용하여 이전 분리로 인한 오염이 없도록 합니다.
    알림: 해부 절차는 임신한 댐에서 이식 부위를 채취하는 순간부터 1시간으로 제한되어야 합니다.
  11. 당일 유전형 분석 단계로 이동하기 전에 다음 임신 댐에서 배아를 분리합니다(여러 개의 동기화된 임신이 확인된 경우).

3. 당일 유전형 분석(그림 4)

  1. 각 내장 난황낭을 8-strip PCR 튜브에서 분해합니다. P20 피펫을 사용하여 19.3μL의 PCR 템플릿 DNA 용해 완충액과 0.7μL의 0.2μg/mL Proteinase K를 각 난황낭 샘플에 추가합니다.
  2. 10초 동안 샘플을 소용돌이치게 하고 10초 동안 1,000 x g 에서 스트립 어댑터가 있는 미니 원심분리기를 사용하여 샘플을 튜브 바닥에 배치하기 위해 회전합니다. 8-스트립 PCR 튜브를 85°C 열 블록에 45분 동안 넣고 5분마다 5초 동안 와류를 넣습니다.
    참고: 45분 내에 세포 용해를 최대화하기 위해 분해하는 동안 샘플을 소용돌이치게 하는 것이 중요합니다.
  3. 45분 후 스트립 어댑터가 있는 미니 원심분리기를 사용하여 1,000 x g 에서 10초 동안 튜브 스트립을 회전시키고 원하는 유전자 식별을 위해 PCR을 진행합니다. 참고로, Cre-lox 시스템에 대한 샘플 프로토콜이 제공됩니다. 다음은 Cre 유전형 분석을 위한 PCR 조건의 예입니다. 표적 Cre 부위의 5' 및 3' 영역을 증폭하기 위한 프라이머를 설계합니다.
  4. Cre 유전형 분석을 위한 PCR 반응을 수행하려면 10μL의 Taq DNA 중합효소 혼합물, 0.5μL의 0.5μL 순방향 Cre 프라이머, 0.5μL의 0.5μM 역Cre 프라이머, 5μL의 PCR 인증 물 및 4μL의 난황낭 게놈 DNA를 포함하는 각 난황낭에 대해 8-strip PCR 튜브당 PCR 마스터 믹스를 준비합니다.
    참고: 쥐 꼬리 유전형 분석에 최적화된 프로토콜을 사용하는 경우 더 깨끗한 결과를 위해 일반적으로 사용되는 DNA 양의 두 배를 추가하십시오.
  5. PCR 마스터 믹스가 만들어지면 PCR 열 주기 증폭 프로그램을 실행합니다. Cre 유전형 분석의 경우 주기는 (1) 3분 동안 95°C, (2) 30초 동안 95°C, (3) 30초 동안 55°C, (4) 30초 동안 72°C, 34주기 동안 2-4단계 반복, (5) 10분 동안 72°C, (6) 4°C 유지입니다. PCR 산물을 1% 아가로스 겔에서 실행하여 유전형 분석 결론을 도출합니다.
    참고: 유전자 식별을 위해 둘 이상의 PCR이 필요한 경우 PCR 반응을 동시에 실행하여 타이밍을 최적화하십시오. 프로세스를 신속하게 진행하려면 실험 당일 하루 전에 아가로스 겔을 준비하고 4°C에서 밤새 보관합니다. 명확한 유전자형이 없는 샘플은 고려하지 마십시오. 샘플에 대해 유전자형과 발달 단계를 모두 고려해야 하는데, 새끼 배설물이 서로 다른 위형성 단계에 있을 수 있고 잠재적으로 결과를 왜곡할 수 있기 때문입니다. LoxP 대립유전자의 유전형 분석을 수행할 때 겔에서 예상되는 PCR 밴드는 사용된 Cre-driver에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, Cre 드라이버가 내장 난황낭에서 발현되는 경우, Loxp 띠는 Cre-음성(Cre-)에 비해 Cre-양성(Cre+) 배아에서 이동된 것처럼 보입니다. 그러나, Cre가 내장 난황낭에서 발현되지 않는 경우, Loxp 띠의 크기는 Cre+ 및 Cre- 배아에서 동일한 크기가 될 것입니다(즉, Loxp 대립유전자는 난황낭 계통에서 플록스화되지 않을 것입니다). 하나의 Cre+ 대립유전자와 2개의 Loxp 대립유전자를 가진 배아는 조건부 KO 배아로 간주됩니다. 그러나 플록시드 유전자의 결실을 확인하기 위해서는 유전형 분석 프로토콜을 반복하거나 플록시드 유전자의 mRNA 수준의 qPCR 분석을 통해 Cre 드라이버를 발현하는 세포에서 유전자의 knockout을 확인하는 것이 좋습니다(그림 4D, E).
  6. 남은 분해된 난황낭 샘플은 장기 보관을 위해 -20°C 냉동고에 보관합니다.

4. 배아의 세포 해리와 세포 생존력

  1. 유전자형이 확인되면 P200 피펫과 50 μL의 DMEM/10% FBS 피펫팅을 사용합니다. 동일한 유전자형을 가진 배아를 새로운 1.5mL 튜브에 풀링하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 그룹당 배아가 5개 이상(E7-E7.5) 또는 3개(E7.75-E8) 이상인 경우 세포 수와 생존력이 크게 감소하므로 실험을 진행하지 마십시오.
  2. 유전자형에 따라 배아를 합친 후 배아가 튜브 바닥에 가라앉도록 합니다. 50μL의 DPBS-/-를 첨가하여 합쳐진 배아를 세척한 다음 배아가 가라앉을 때까지 기다렸다가 튜브에서 배아를 제거하지 않고 가능한 한 많은 DPBS-/- 를 제거합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
    참고: 1.5mL 튜브를 광원이나 창문 쪽으로 들고 있으면 배아가 튜브 바닥에 가라앉는 것을 더 쉽게 볼 수 있습니다.
  3. 합폐된 배아에 100μL의 트립신을 추가하고 37°C에서 열 블록에서 5분 동안 배양합니다. 30초마다 1.5mL 튜브를 부드럽게 튕겨 세포가 해리되도록 합니다.
    알림: 트립신화 과정에서 와류나 피펫을 사용하면 세포가 손상될 수 있으므로 사용하지 마십시오. 5개 이상의 배아(E7-E7.5) 또는 3개의 배아(E7.75-E8)가 합쳐진 경우 동일한 양의 트립신(배아 1개당 ~20μL)이 있는 다른 튜브에서 트립신 분해를 수행합니다. 배아당 ~20μL의 트립신(E6.5-E7.5), 배아당 35μL(E7.75), 배아(E8)에 40μL를 사용합니다.
  4. 5분 후 300μL의 DMEM/10% FBS로 트립신을 중화합니다. 합친 배아를 실온(RT)에서 4분 동안 100 x g 으로 원심분리합니다. 원심분리 후 모든 샘플에 대해 작은 펠릿이 나타납니다. 펠릿을 40μL의 DMEM/10% FBS에 재현탁시키고 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 펠릿의 크기는 풀링된 배아의 수에 따라 달라집니다. 펠릿이 보이지 않을 수 있지만 다음 단계를 진행하십시오. 트립신을 중화하는 데 필요한 DMEM/10% FBS의 양은 첨가된 트립신의 양에 따라 다릅니다. 트립신 양에 DMEM/10%의 3배를 추가합니다.
  5. 자동 세포 카운터를 사용하여 재현탁 세포(40 μL)의 농도를 측정합니다. 새 1.5mL 튜브에서 5μL의 세포와 5μL의 트리판 블루를 혼합합니다. 피펫을 철저히 혼합하고 슬라이드에 피펫팅하여 세포 수와 세포 생존율을 측정합니다. 세포의 최적 농도는 700-1200 cells/μL이며 세포 생존율은 90% 이상입니다.
    참고: 농도가 200 cells/μL 미만이고 생존율이 50% 미만인 경우 실험을 계속하지 마십시오. 세포 농도가 너무 높으면 세포 현탁액을 희석하고 세포를 다시 계수하십시오. 세포 덩어리가 관찰되면 세포 여과기를 사용하여 단일 세포 현탁액을 확인하십시오.
  6. 미세유체 칩을 사용하여 단일 셀 분할을 진행하고 미세유체 칩 제조업체11의 프로토콜을 따릅니다.

5. 핵 분리 마우스 배아(E8 이후의 더 큰 배아 시점에 대한 옵션)

  1. 신선한 용해물을 준비하고 표 1에 요약된 완충액을 세척하고 얼음 위에 놓습니다.
    참고: 핵 분리는 신선 또는 냉동 샘플에서 수행할 수 있습니다. 샘플이 얼면 얼음에서 2-5분 동안 해동합니다.
  2. 실험을 시작하기 전에 모든 유전자형을 확인하고 명확한 유전자형을 가진 배아만 풀링합니다.
  3. P200 피펫을 사용하여 돌연변이 그룹당 최소 3개의 배아를 목표로 1.5mL 튜브의 통합 배아에 50μL의 핵 용해 완충액을 추가합니다. 용해 완충액을 사용하여 샘플을 얼음 위에 5분 동안 놓고 30초마다 소용돌이를 일으킵니다.
  4. 배양 5분 후 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. P200 피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 펠릿을 50μL의 세척 버퍼에 재현탁시킵니다. 다시 현탁한 후에는 500 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  5. 상층액을 제거하고 40μL의 DPBS-/-에 재현탁합니다. 자동화된 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 계산합니다. 새로운 1.5mL 튜브에 5μL의 핵과 5μL의 트리판 블루를 혼합합니다. 혼합물을 철저히 피펫팅하고 슬라이드에 로드하여 세포 수와 생존율을 측정합니다.
    알림: 핵막은 trypan blue까지 투과성이 있습니다. 따라서 분리된 핵 염색은 트리판 블루에 대해 양성입니다. 자동화된 세포 계수기에서 죽은 세포의 비율은 분리된 핵의 비율을 추정하는 데 사용됩니다(그림 5A).
  6. 온전한 핵의 비율이 90%를 초과하는 경우(핵의 최소 90%가 트리판 블루로 염색되고 둥근 모양과 탁한 측면을 나타낸다는 것을 의미, 그림 5B, C 참조), 미세유체 칩을 사용하고 미세유체 칩 제조업체11의 프로토콜을 따릅니다.

6. 단일 세포 분할(cDNA 증폭 및 라이브러리 구축 포함)

  1. 최적의 결과를 위해 미세유체 칩 제조업체의 프로토콜11 에 따라 단일 세포 RNA 염기서열 분석 프로토콜을 즉시 진행하십시오. 대상 셀 복구를 6000 셀 이상으로 설정합니다.

7. 시퀀싱

  1. 라이브러리를 구축한 후에는 자동 전기영동 분석기를 사용하여 시료의 단편 크기 분포 및 농도를 측정합니다.
    참고: 최적의 단편 크기 분포는 300-1000bp 사이입니다.
  2. 샘플을 시퀀서에 로드할 준비가 되었습니다. 서로 다른 샘플의 라이브러리를 함께 풀링합니다. pooled library의 최종 로딩 농도는 총 24 μL의 부피에서 750 pM입니다. 염기서열분석 제조업체의 프로토콜12에 따라 pooled library를 시약 카트리지에 로드합니다.
  3. pair-end, dual indexing을 통해 원하는 염기서열분석 깊이에 따라 사전 조립된 flow cell과 cartridge에 로드된 라이브러리를 시퀀싱합니다. 미세유체 칩 제조업체가 설명한 프로토콜을 준수하는 시퀀싱 판독은11: 읽기 1: 28 사이클, i7 인덱스: 10 사이클, i5 인덱스: 10 사이클 및 읽기 2: 90 사이클입니다. 염기서열 분석이 완료된 후 데이터는 생물정보학 분석을 거칩니다.
  4. 생물정보학 방법을 사용하여 품질 관리를 수행합니다. 여기에는 염기서열 세포의 수, 세포당 판독 수, 세포당 매핑된 유전자 수 평가가 포함됩니다.
    참고: 최적의 결과를 위해 염기서열 분석된 세포의 수는 표적 세포의 80% 이상이어야 합니다. 세포당 판독 횟수는 30,000개 이상이고 검출된 유전자 수는 3000개 이상(마우스 샘플의 경우)인 것이 좋습니다.

결과

이 논문에서 고안된 방법론은 E6.5에서 E8까지의 단세포 오믹스를 위한 배아 샘플의 준비를 향상시키기 위해 특별히 고안되었습니다. 이 강력한 파이프라인은 동기화된 시간 임신, 배아 분리, 당일 유전형 분석, 세포 해리 및 세포 생존력 평가의 5가지 주요 단계로 구성됩니다(그림 1A). 제시된 데이터는 E7에서 E7.5까지의 시점에 초점을 맞추고 있지만, 절차에서 약간의 변형을 가하여 E8까지의 배아(그림 1B)에 적용할 수 있습니다(프로토콜 전체의 참고 사항 참조). 동기화된 시간 임신은 두 마리의 암컷 쥐를 수컷 쥐와 함께 케이지에 넣음으로써 달성되었습니다. 매일 아침 10시 이전에 질 플러그를 점검하고, 플러그가 관찰되면 그날 정오까지 E0.5로 간주했습니다(그림 2A). 이 연구에서 플러그를 위한 최적의 조건은 발정기 또는 발정기 단계의 암컷 쥐를 이전 번식 중에 여러 플러그를 성공적으로 배치한 이력이 있는 수컷과 짝을 이루어야 했습니다(그림 2B). 배아 분리를 위해 명백한 플러그만 고려되었습니다(그림 2C).

발달 시기는 그림 2A의 시간표에 따라 추정되었습니다. E7.5의 경우, 플러그가 발견된 날로부터 7일 째 되는 날 오후 12시에 배아 해부가 시작되었습니다. 그림 3 은 E7.5에서 성공적인 배아 분리를 보여줍니다. 임신한 댐을 안락사시킨 후, 자궁 뿔을 절제하고, 부풀어 오른 부분을 개별적으로 잘라내어 배아가 드러나게 하고, 난황 자루를 분리하여 유전형 분석을 실시하였다(그림 3).

당일 유전형 분석은 그림 4A의 단계에 따라 배아 분리 후 3시간 이내에 수행되었습니다. 배아는 온전함을 보존하기 위해 유전형 분석 과정에서 얼음 위에 보관되었습니다. 배아를 동결하면 배아당 생존 가능한 세포의 수가 줄어들기 때문에 동결하지 마십시오. 그림 4B,C는 내장 난황 주머니, 두정엽 내배엽 주머니 및 관련 모계 혈액이 있는 외태반 원뿔을 보여줍니다. 내장 난황낭은 유전형 분석에 활용되었습니다(그림 4C). 난황낭을 소화한 후, PCR 혼합물을 제조하고, PCR 반응을 실행하였다. 생성된 PCR 산물을 이어서 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 그림 4D는 LoxP 및 야생형 대립유전자(각각 597bp 및 498bp) 및 Cre 대립유전자(650bp)의 예상 단편 크기를 보여줍니다. 그림 4E에는 Cre 및 LoxP(플록스) 대립유전자를 운반하는 번식 쌍에서 얻은 6개 배아의 난황낭 유전형 분석의 예가 제시되어 있습니다. 겔은 분석된 6개의 배아에서 Cre 및 LoxP 대립유전자의 PCR 산물을 묘사합니다. 2번과 5번 배아는 2개의 플록스 대립유전자와 1개의 크레 대립유전자를 가지고 있습니다. 따라서 이들은 조건부 KO 배아(conditional KO embryo)로 간주된다(그림 4E, 빨간 점). 배아 1과 3은 2개의 플록스 대립유전자를 가지고 있지만 Cre에 대해서는 음성입니다. 따라서 그들은 flox 컨트롤로 간주됩니다. 배아 4는 2개의 플록스 대립유전자와 Cre 대립유전자에 대한 희미한 띠를 가지고 있어 "불분명한" 유전자형이 발생합니다. 이 배아는 더 이상 처리되지 않았습니다(대안적으로, 실험자는 유전형 분석을 반복하거나 Cre를 발현하는 세포를 사용하여 조건부 KO의 2차 검증을 수행하는 것을 고려할 수 있음). 이 실험에 사용된 Cre 드라이버는 내장 난황낭(15)에서 발현되지 않는다는 점에 유의하는 것이 중요하다; 따라서, LoxP 대립유전자는 Cre-음성 배아에 비해 Cre-양성 배아의 겔에서 이동된 것으로 보이지 않습니다.

성공적인 단일 세포 실험을 위해서는 세포 수와 우수한 생존율이 필요합니다. 세포 생존율이 낮거나, 죽은 세포의 비율이 높거나, 응집되거나, 상당한 파편이 있는 현탁액은 추가 처리에 적합하지 않습니다. 최적의 조건은 마이크로리터당 700-1200개의 살아있는 세포와 >90%의 생존율입니다. 그림 5A 는 양호한 세포 생존율과 차선의 세포 생존율을 모두 보여주는 패널을 보여줍니다. 그림 5B와 같이 핵 분리에도 동일한 기준을 적용할 수 있습니다. 그러나, 트리판 블루의 평가는 세포 및 핵과 다르다는 점에 유의하는 것이 중요합니다: 생존 가능한 세포는 트리판 블루를 포함하지 않는 반면, 생존 가능한 핵은 트리판 블루를 포함합니다. 세포/핵 현탁액이 최적인 경우(>90% 생존율) 제조업체의 절차11에 따라 미세유체 칩을 사용하여 단일 세포 분할을 진행합니다. 문제 해결 옵션은 그림 5C와 같이 세포/핵 생존율이 60%-89% 사이인 현탁액에 대해 제공됩니다. 총 세포 수에 관계없이 생존율이 60% 미만으로 떨어지면 실험을 중단하는 것이 좋습니다.

임신한 댐의 도태부터 도서관 건설까지 전체 파이프라인은 같은 날 총 8시간이 소요됩니다(즉, 프로토콜 단계 2-6은 같은 날에 수행되어야 함). 단일세포 제조사의 절차11에 요약된 절차에 따라, E7 배아에서 얻은 세포를 사용하여 단일세포 RNA 염기서열분석을 위한 라이브러리 구성을 준비하였으며, 세포 생존율은 최적이 아닌 조건에서 최적 조건에 이르며, 2,000개의 세포의 예상 목표 회수율을 목표로 했습니다(그림 6). 그림 6A 는 최적이 아닌 조건과 최적 조건 모두에 대한 scRNAseq 라이브러리의 대표적인 단편 크기 분포를 보여주며, 세포 생존율이 전체 단일 세포 분할 과정에 큰 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 단편 크기 분포는 400-500 bp 사이였습니다. 이는 최적이 아닌 조건이 라이브러리 준비 프로세스에 영향을 주지 않음을 나타냅니다. 그림 6B 는 성공적인 단일 세포 RNAseq 실험과 차선의 단일 세포 RNAseq 실험의 결과를 보여줍니다. 염기서열분석 후, 샘플에 대해 품질 관리 검사를 실시한 결과, 세포 생존율이 최적이 아닌 경우 세포의 10%만이 성공적으로 염기서열 분석을 수행하는 것을 관찰했습니다. 대조적으로, 최적의 샘플은 전체 세포의 91%가 염기서열 분석되어 더 높은 비율을 보였습니다. 이는 바코드 플롯에 의해 더욱 입증되며, 이는 최적이 아닌 조건이 최적 조건에 비해 더 큰 배경 소음을 갖는다는 것을 나타냅니다. 두 실험 모두에 대해 클러스터링 분석을 수행한 결과 9개의 클러스터가 최적 조건에서, 4개의 클러스터가 최적이 아닌 조건에서 확인되었습니다. 알려진 마커3 를 사용한 클러스터의 주석은 E7 배아에서 epiblast 및 primitive streak을 포함하여 예상되는 세포 유형을 나타냈습니다(그림 6B). 최적이 아닌 실험의 클러스터 주석은 각 클러스터에 대해 알려진 마커의 농축 부족으로 인해 불가능했습니다. 이는 이러한 개발 단계에서 데이터를 적절하게 표현하는 데 필요한 고품질 셀의 중요성을 강조합니다.

figure-results-1
그림 1: single-cell RNA 염기서열분석을 위한 전체 마우스 배아의 gastrulating 최적화. (A) gastrulating embryos에서 고품질 세포 및/또는 핵을 얻기 위한 워크플로우 개략도. (B) E7에서 E8까지의 gastrulation 중 마우스 배아의 대표적인 명시야 이미지 및 적응된 계획3 . 스케일 바: 125 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 위축(gastrulation) 중 배아 분리를 위한 효율적인 동기화 시간 임신을 위한 전략. (A) 시간 제한 임신을 위한 파이프라인을 나타내는 개략도와 특정 위산 단계 분석을 위한 플러그 감지에서 배아 분리까지의 시간을 설명하는 시간표. (B) 암컷 마우스의 발정 주기 단계를 대표하는 이미지. 번식에 가장 잘 적응하는 단계가 표시됩니다. (C) 질 플러그를 확인하는 방법과 플러그가 없는 질 입구, 부분 플러그 또는 배아 분리를 위해 고려할 수 있는 좋은 플러그의 예를 보여주는 개략도. 질 입구는 각 이미지 아래에 확대되어 있습니다. 플러그(질 입구의 응고된 정액)는 빨간색 화살표로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 위한 E7.5 배아의 해부 및 유전형 분석. E7.5 배아를 분리하고 내장 난황낭을 해부하는 과정에 대한 개략도 및 이미지. 노란색 화살표는 임신한 댐의 자궁을 나타내고 노란색 점선 원은 배아의 위치를 나타냅니다. 점선은 색인 중에 절단된 영역을 나타냅니다. "M"은 중간체 끝을 나타내고 "AM"은 반중간체 끝을 나타냅니다. 스테레오스코프 이미지의 스케일 바는 400μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
그림 4: gastrulating mouse 배아에서 채취한 난황낭의 당일 유전형 분석. (A) 난황낭의 당일 유전형 분석을 위한 워크플로우 개략도. (B) 관련 모계 혈액이 있는 두정엽 내배엽 주머니 및 외태반 원뿔의 대표 이미지. (C) 점선으로 강조 표시된 E7.5 배아의 내장 난황낭. 척도 막대: 200 μm. (D) 관찰된 DNA 단편 크기를 가진 야생형(+/+), 이형접합(Flox/+) 및 동형접합 플록스(Flox/Flox) 및 Cre 유전형 분석(Mesp1cre15)의 대표적인 겔. (E) 6개 배아(1-6)의 난황낭에서 채취한 Cre 및 flox 대립유전자에 대한 당일 유전형 분석 결과가 제공됩니다. 플록스/플록스 및 Cre 음성(-) 유전형 분석이 있는 두 배아는 플록스 대조군(파란색 점)인 반면, 플록스/플록스 및 Cre 양성(+) 유전형 분석이 있는 배아는 조건부 KO(빨간색 점)입니다. 배아 4는 희미한 Cre 띠(flox/flox 및 Cre-unclear)로 인해 최적이 아니며 결과적으로 추가 처리에서 제외됩니다. 동일한 유전자형을 가진 배아는 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 위해 통합되고 처리됩니다. 난황낭에 Cre 대립유전자가 존재한다는 것은 플록스 띠의 크기에 영향을 미치지 않으며, 사용된 Cre(Mesp1cre)는 난황낭에서 발현되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
그림 5: 세포 품질 및 핵 생존력 평가. (A) E7.5 배아의 최적 및 최적이 아닌 세포 생존력 조건의 대표 이미지. (B) E8 배아의 최적 및 최적이 아닌 핵 생존력 조건의 대표 이미지 (C) 단일 세포 분할을 시작하기 전에 세포의 생존력을 높이는 데 도움이 되는 잠재적 솔루션을 나타내는 문제 해결 계획. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-6
그림 6: E7 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석. (A) E7 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석 라이브러리에 대한 단편 크기 분포의 대표적인 추적으로, 세포 생존율의 최적 및 최적 조건 모두에 대해 주 피크가 400-500bp에 가깝습니다. 이러한 조건 간의 추적은 유사하며, 이는 세포 생존율이 라이브러리의 품질 관리에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. (B) 최적이 아닌 조건과 최적 조건 모두에서 E7 마우스 배아에 대한 단일 세포 RNA 염기서열 분석 결과를 분석하여 관찰된 표적 회수율, 바코드 순위 지정 및 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 분포를 통한 세포 유형의 클러스터링을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

리시스 버퍼
시약 이름주식 집중최종 집중총 부피 1mL
트리스 - HCL (Ph7)1개 m10 mM10 마이크로리터
염화나트륨5개 M10 mM2 μL
마그네슘Cl20.1 미터3 m엠3 μL
Tween-20 (트윈-20)20%0.10%5 마이크로리터
Nondiedt P4010%0.10%10 마이크로리터
디지토닌5%0.01%2 μL
디에티(DTT)1개 m1 m엠1 μL
RNase 억제제40 U/μL1유/μL25 마이크로리터
뉴클레아제가 없는 물----924 마이크로리터
세척 버퍼
시약 이름주식 집중최종 집중총 부피 1mL
PBS 의 BSA10%1%100 μL
증권 시세 표시기----900 마이크로리터

표 1: 핵 분리 용해 완충액 및 세척 완충액 조성.

토론

이 논문에서는 gastrulating mouse embryos에서 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 얻기 위한 강력한 파이프라인을 제시하며, 특히 초기 개발에서 cell-fate 사양 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 하도록 설계되었습니다. 이 방법은 성별 또는 체세포 유전자와 같은 유전자형이 필요한 배아의 분석을 최적화하여 위형성 분야의 중요한 격차를 해결합니다. 이 파이프라인은 유전적 돌연변이 마우스 모델을 활용하고 전체 마우스 배아에 고분해능 단세포 시퀀싱을 사용함으로써 초기 마우스 위스트룰라의 유전자 발현 프로필에 대한 이해를 더욱 높일 수 있습니다. 이 방법은 Cre 재조합 효소 시스템에 의한 유전자 돌연변이 마우스 모델을 사용하여 단일 세포 오믹스를 위한 초기 발달 시점에서 고품질 세포와 핵을 얻을 수 있는 가능성을 보여줍니다. 이 방법은 여러 번의 시도를 통해 발전했으며, 이 기간 동안 샘플은 라이브러리 준비 및 염기서열분석에 필요한 품질 표준을 충족하지 못했습니다. 설명된 방법론은 (1) 배아 수를 늘리기 위한 동기화된 시간 임신, (2) 동결/해동을 방지하기 위한 당일 유전형 분석, (3) 죽어가는 세포의 염기서열 분석을 피하기 위한 세포/핵 생존력 평가의 세 가지 중요한 단계의 최적화를 통해 E8보다 어린 배아에서 충분한 세포/핵을 생성합니다. 이 프로토콜은 단일 세포 RNASeq로 성공적인 결과를 제공하지만, 이 프로토콜에서 얻은 세포 또는 핵 현탁액은 세포 생존율이 제한 요소인 smart-seq, drop-seq 및cel-seq 16과 같은 다른 염기서열분석 플랫폼에서 처리할 수 있습니다.

E7 배아에서 세포의 수는 균주와 돌연변이 유전자형에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로 E7 배아는 수백 개에서 수천 개의 세포에 이를 수 있으며, 원하는 유전자형을 가진 배아를 얻는 것은 임신 댐당 1개 또는 2개의 배아만 기준을 충족하기 때문에 어렵습니다. 이 프로토콜을 사용하면 단일 세포 분석을 위해 E7 배아 당 약 300개의 생존 가능한 세포를 캡처할 수 있습니다. 임신한 댐에서 배아를 다른 날에 급속 냉동하여 배아 풀 크기를 늘리려는 시도는 동결 보존제를 추가했음에도 불구하고 해동 후 세포 생존력이 심각하게 손상되어 성공하지 못했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 번식 전략과 임신한 댐의 동기화가 최적화되었습니다. 여러 번의 격리 가능성을 높이려면 번식하기 전에 1-2번 출산한 암컷 쥐를 사용하여 격리를 위해 사용하는 것이 좋습니다. 암컷의 발정 주기를 모니터링하는 것이 중요합니다. 짝짓기는 발정기와 발정기에 발생할 가능성이 더 높습니다. 번식에 어려움이 생기면 4일 후에 번식 파트너를 바꾸는 것도 플러그가 생성되지 않는 경우 도움이 됩니다.

이 방법에는 한계가 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다: 관찰된 플러그에 의존하며, 플러그가 관찰되더라도 임신을 보장하지 않고 성행위만 나타낸다. 따라서 하루에 관찰된 플러그의 수를 늘리면 하루에 두 개 이상의 임신 댐이 있을 확률이 높아지고 더 많은 양성 유전자형이 있습니다. 이 프로토콜은 E7에서 E7.75에 이르는 배아 단계를 gastrulation 중 개념 증명으로 사용할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 그러나 이 파이프라인은 E6.5에서 E8 배아까지 적용할 수 있습니다. E6.5 배아의 경우, 원하는 유전자형을 가진 최소 7개의 배아를 얻기 위해 동기화된 임신 횟수를 늘리는 것이 권장됩니다. 대신, E8 배아의 경우 각 배아를 해리하는 데 사용되는 트립신의 양을 20 μL 대신 ~ 40 μL로 늘립니다. 목표는 partitioning을 진행하기 전에 μl당 700-1200 cells의 농도 범위에서 cell/nuclei suspension를 얻는 것입니다.

우수한 세포 생존율은 단일 세포 염기서열분석의 성공에 필수적입니다. 제조업체가 제공하는 미세유체 칩 설계에서, 단일 셀은 알려진 바코드 겔 비드(11)를 포함하는 칩 내에서 겔 비드 인 에멀젼(GEM)으로 분할된다. 그러나 이 프로세스의 주목할만한 제한 사항은 고품질 및 저품질 단일 셀을 모두 분할할 수 있다는 것입니다. 적절한 수의 살아있는 세포(즉, 1000 cells/μL)가 있더라도 현탁액의 생존율이 낮으면(즉, 1000개의 세포가 살아 있고 1000개의 세포가 죽어 50%의 생존율이 발생함) 염기서열분석 실험은 실패할 가능성이 높습니다. 최적의 결과를 얻으려면 약 90%의 생존 가능성을 목표로 하는 것이 좋습니다. 세포 생존율이 약 60%-89% 사이인 경우 실험의 생존율을 향상시키기 위해 특정 조치를 취할 수 있습니다. 그러나 세포 생존율이 60% 미만인 경우 실험을 계속하지 않는 것이 좋습니다. 그 이유는 죽어가는 세포가 partitioning gel에서 '포획'되고 후속 라이브러리 준비 및 품질 관리가 눈에 띄는 문제 없이 통과되기 때문입니다. 그러나 대부분의 염기서열 분석 판독은 미토콘드리아, 리보솜 또는 세포사멸 유전자를 매핑하여 처음부터 세포 생존력이 좋지 않다는 징후를 나타내기 때문에 실제 염기서열 분석 실험은 완전히 실패할 수 있습니다. 이 논문에 제시된 데이터는 고품질 세포를 가진 gastrulating mouse 배아의 단일 세포 염기서열 분석을 위한 파이프라인을 보여줍니다. 이 방법론은 개발 과정에서 다양한 유전자 돌연변이 마우스 모델을 이해하는 데 적용할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 글

염기서열 분석 실험에 대한 기술 지원을 아끼지 않은 Fox Chase Cancer Center의 유전체학 핵심과 Dr. Johnathan Whetstine의 실험실 구성원인 Zach Gray, Madison Honer, Benjamin Ferman에게 감사드립니다. 우리는 Estaras 박사와 단일 세포 연구의 초기 분석에 기여한 순환 대학원생인 Alex Morris의 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01HD106969 및 Conchi Estaras에 대한 R56HL163146 자금을 지원합니다. 또한 Elizabeth Abraham은 T32 교육 보조금 5T32HL091804-12의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
10cm 페트리 접시Genesee Scientific25-202
1000 &마이크로; L 리치 배리어 팁Genesee Scientific23-430
20 &마이크로; L 리치 배리어 팁Genesee Scientific24-404
300 &마이크로; L 리치 배리어 팁Genesee Scientific24-415
37 &마이크로; m 가역 여과기, 작은줄기 세포27215
6cm 페트리 접시Genesee Scientific25-260
8-스트립 PCR 튜브Genesee Scientific27-125U
AgaroseApex Bioresearch 제품20-102
벤치마크 Scientific BSH300 MyBlock 미니 드라이 배스Genesee31-437
벤치 마크 사이언티픽 Z216-MK Z216MK Hermle 냉장 마이크로 원심 분리기Genesee33-759R
소 혈청 알부민 (BSA)Sigma-AldrichA2153
크롬 컨트롤러10XPN-1000127
크롬 Next GEM Single Cell 3' 시약 키트 v3.110XPN-1000269
Countess 3 Automated Cell CounterInvitrogen
Countess Cell Couning Chamber SlidesInvitrogenC10283
D1000 시약Agilent5067-5583
D1000 ScreenTapeAgilent5067-5582
DigitoninThermoFisher ScientificBN2006
DirectPCR 난황자 주머니Viagen201-Y
Dithiothreitol ( DTT)ThermoFisher ScientificR0861
DNA LoBind Tube 1.5 mLEppendorf22431021
Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)CORNING10-013-CV
Dulbecco's PBSGenClone25-508
Dumont #5 Fine ForcepsFine Science Tools11254-20
Dumont #5SF 펜치파인 사이언스 도구11252-00
에탄올KoptecV1401
EVOS M7000 이미징 시스템InvitrogenAMF7000
- 샤프파인 사이언스 툴14060-11
GoTaq G2 그린 마스터 믹스PromegaM7823
그레이프 펜치파인 사이언스 도구11049-10
MgCl2ThermoFisher ScientificAC223211000
MiniAmp Thermal CyclerApplied BiosystemsA37834
NaClFisher ChemicalS271-500
NextSeq 1000/2000 P2 시약(100 사이클) v3Illumina20046811
NextSeq2000Illumina
Nikon SMZ 1000 스테레오 현미경Nikon
Nondiedt P40Sigma-Aldrich74385
뉴클레아제가 없는 물GenClone25-511
광학 튜브 8x 스트립 (401428)애질런트401428
광학 튜브 캡 8x 스트립 (401425)애질런트401425
Poseidon 31-511, HS24 마이크로 원심분리기, 24 x 1.5/2.0 mL 로터 포함, 원심분리기 1개/장치Genesee31-511
Proteinase KSigma-AldrichP6556
Qubit dsDNA 정량 분석 키트InvitrogenQ32851
Qubit Flex 3Invitrogen
RNase 억제제Fisher Scientific12-141-368
표준 패턴 집게파인 사이언스 도구11000-12
테이프 스테이션 로딩 팁애질런트5067-5598
테이프스테이션 4150애질런트G2992AA
트리스-HCL (Ph7)품질 생물학351-007-101
트리판 블루 스테인 0.4%테로모 피셔 사이언티픽T10282
트라이플 익스프레스Gibco12604-021
Tween-20Bio-Rad1662404
Vortex 믹서 IKA MS3(96웰 샘플 플레이트 어댑터IKA3617000
AMQAX2000파인 사이언스 도구 포함)

참고문헌

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돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지
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