이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.
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방법 논문
돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지
이 논문에서
요약
초록
지난 10년 동안 단일 세포 접근법은 유전자 발현 역학, 세포 이질성 및 샘플 내 세포 상태를 연구하기 위한 황금 표준이 되었습니다. 단일 세포가 발전하기 전에는 초기 개발 과정에서 역동적인 세포 환경과 빠른 세포 전이를 포착하는 것이 불가능했습니다. 이 논문에서는 배아 E6.5일부터 E8일까지의 마우스 배아에 대해 단세포 및 핵 분석을 수행하도록 견고한 파이프라인을 설계했으며, 이는 위축작용의 시작 및 완료에 해당합니다. 위축(Gastrulation)은 기관 형성에 필수적인 세 가지 생식층, 즉 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm), 내배엽(endoderm)을 형성하는 발달 과정의 기본 과정입니다. 야생형 주위 배아에 적용되는 single-cell omics에 대한 광범위한 문헌을 이용할 수 있습니다. 그러나 돌연변이 배아에 대한 단세포 분석은 여전히 부족하며 FACS로 분류된 집단에 국한되는 경우가 많습니다. 이는 부분적으로 유전형 분석, 임신 시기 제한, 임신당 원하는 유전자형을 가진 배아의 수, 이 단계에서 배아당 세포 수의 필요성과 관련된 기술적 제약 때문입니다. 여기에서는 이러한 한계를 극복하기 위해 고안된 방법론을 제시합니다. 이 방법은 원하는 유전자형과 동기화된 임신 가능성을 높이기 위해 번식 및 시기별 임신 지침을 설정합니다. 당일 유전형 분석 프로토콜(3시간)과 결합된 배아 분리 과정의 최적화 단계를 통해 미세 방울 기반 단일 세포를 같은 날에 수행할 수 있어 세포의 높은 생존력과 강력한 결과를 보장할 수 있습니다. 이 방법에는 배아에서 최적의 핵 분리를 위한 지침이 추가로 포함됩니다. 따라서, 이러한 접근법은 위축(gastrulation) 단계에서 돌연변이 배아(mutant embryo)에 대한 단세포 접근법의 실현 가능성을 증가시킨다. 우리는 이 방법이 돌연변이가 위골의 세포 환경을 어떻게 형성하는지에 대한 분석을 용이하게 할 것으로 기대합니다.
서론
위축은 정상적인 발달에 필요한 기본적인 과정입니다. 이 빠르고 역동적인 과정은 만능 세포가 장기가 형성되는 방식을 정의하는 계통 특이적 전구체로 전환될 때 발생합니다. 수년 동안 gastrulation은 오랫동안 중배엽, 외배엽 및 내배엽의 세 가지 크게 균질 한 집단의 형성으로 정의되었습니다. 그러나, 고해상도 기술과 새로운 배아 줄기 세포 모델(embryonic stem cell model)1,2은 초기 생식층(germ layers)3,4 사이에서 전례 없는 이질성(heterogeneity)을 밝혀내고 있다. 이것은 위스트룰라의 뚜렷한 세포 집단을 조절하는 메커니즘에 대해 밝혀져야 할 것이 훨씬 더 많다는 것을 시사합니다. 마우스 배아 발달은 gastrulation 3,5 동안 초기 세포 운명 결정을 연구하는 가장 좋은 모델 중 하나였습니다. 생쥐의 위축은 배아 E6.5일에서 E85까지 48시간 이내에 전체 위형성 과정이 발생하기 때문....
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프로토콜
이 프로토콜과 설명된 모든 동물 실험은 실험실 동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 국제 지침을 따르는 템플 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Temple University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 제정한 기관 지침에 따라 공식적으로 승인되었습니다. 기술된 모든 마우스는 C57/BL6N 배경 균주에 있었다. 이 연구에서 동물의 건강에 대한 우려는 관찰되지 않았다.
1. 번식 식민지와 시간 제한 임신
- 질 플러그의 시각화로 임신 시간을 정하십시오. 플러그 당일 정오는 E0.5로 간주됩니다.
- 부서진 나무 침구와 종이 둥지 재료가 포함된 침구 재료가 있는 우리에 있는 집 쥐.
- 각 케이지에는 쥐 차우, 담수 및 농축 항목(예: 터널 및 둥지 재료)이 들어 있습니다. 시간 제한 번식 동안 매일 군집 정보를 추적하고 수집합니다.
- 쥐의 나이, 암컷 쥐의 임신 횟수, 수컷 쥐가 삽입한 플러그의 수, 암컷 쥐의 발정 단계(그림 2
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결과
이 논문에서 고안된 방법론은 E6.5에서 E8까지의 단세포 오믹스를 위한 배아 샘플의 준비를 향상시키기 위해 특별히 고안되었습니다. 이 강력한 파이프라인은 동기화된 시간 임신, 배아 분리, 당일 유전형 분석, 세포 해리 및 세포 생존력 평가의 5가지 주요 단계로 구성됩니다(그림 1A). 제시된 데이터는 E7에서 E7.5까지의 시점에 초점을 맞추고 있지만, 절차에서 약간의 변형을 가하여 E8까지의 배아(그림 1B)에 적용할 수 있습니다(프로토콜 전체의 참고 사항 참조). 동기화된 시간 임신은 두 마리의 암컷 쥐를 수컷 쥐와 함께 케이지에 넣음으로써 달성되었습니다. 매일 아침 10시 이전에 질 플러그를 점검하고, 플러그가 관찰되면 그날 정오까지 E0.5로 간주했습니다(그림 2A). 이 연구에서 플러그를 위한 최적의 조건은 발정기 또는 발정기 단계의 암컷 쥐를 이전 번식 중에.......
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토론
이 논문에서는 gastrulating mouse embryos에서 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 얻기 위한 강력한 파이프라인을 제시하며, 특히 초기 개발에서 cell-fate 사양 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 하도록 설계되었습니다. 이 방법은 성별 또는 체세포 유전자와 같은 유전자형이 필요한 배아의 분석을 최적화하여 위형성 분야의 중요한 격차를 해결합니다. 이 파이프라인은 유전적 돌연변이 마우스 모델을 활용하고 전체 마우스 배아에 고분해능 단세포 시퀀싱을 사용함으로써 초기 마우스 위스트룰라의 유전자 발현 프로필에 대한 이해를 더욱 높일 수 있습니다. 이 방법은 Cre 재조합 효소 시스템에 의한 유전자 돌연변이 마우스 모델을 사용하여 단일 세포 오믹스를 위한 초기 발달 시점에서 고품질 세포와 핵을 얻을 수 있는 가능성을 보여줍니다. 이 방법은 여러 번의 시도를 통해 발전했으며, 이 기간 동안 샘플은 라이브러리 준비 및 염기서열분석에 필요한 품질 표준을 충족하지 못했습니다. 설명된 방법론은 .......
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
염기서열 분석 실험에 대한 기술 지원을 아끼지 않은 Fox Chase Cancer Center의 유전체학 핵심과 Dr. Johnathan Whetstine의 실험실 구성원인 Zach Gray, Madison Honer, Benjamin Ferman에게 감사드립니다. 우리는 Estaras 박사와 단일 세포 연구의 초기 분석에 기여한 순환 대학원생인 Alex Morris의 실험실 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 NIH 보조금 R01HD106969 및 Conchi Estaras에 대한 R56HL163146 자금을 지원합니다. 또한 Elizabeth Abraham은 T32 교육 보조금 5T32HL091804-12의 지원을 받았습니다.
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재료
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| 10cm 페트리 접시 | Genesee Scientific | 25-202 | |
| 1000 &마이크로; L 리치 배리어 팁 | Genesee Scientific | 23-430 | |
| 20 &마이크로; L 리치 배리어 팁 | Genesee Scientific | 24-404 | |
| 300 &마이크로; L 리치 배리어 팁 | Genesee Scientific | 24-415 | |
| 37 &마이크로; m 가역 여과기, 작은 | 줄기 세포 | 27215 | |
| 6cm 페트리 접시 | Genesee Scientific | 25-260 | |
| 8-스트립 PCR 튜브 | Genesee Scientific | 27-125U | |
| Agarose | Apex Bioresearch 제품 | 20-102 | |
| 벤치마크 Scientific BSH300 MyBlock 미니 드라이 배스 | Genesee | 31-437 | |
| 벤치 마크 사이언티픽 Z216-MK Z216MK Hermle 냉장 마이크로 원심 분리기 | Genesee | 33-759R | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 크롬 컨트롤러 | 10X | PN-1000127 | |
| 크롬 Next GEM Single Cell 3' 시약 키트 v3.1 | 10X | PN-1000269 | |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Countess Cell Couning Chamber Slides | Invitrogen | C10283 | |
| D1000 시약 | Agilent | 5067-5583 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| Digitonin | ThermoFisher Scientific | BN2006 | |
| DirectPCR 난황자 주머니 | Viagen | 201-Y | |
| Dithiothreitol ( DTT) | ThermoFisher Scientific | R0861 | |
| DNA LoBind Tube 1.5 mL | Eppendorf | 22431021 | |
| Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x) | CORNING | 10-013-CV | |
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| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF 펜치 | 파인 사이언스 도구 | 11252-00 | |
| 에탄올 | Koptec | V1401 | |
| EVOS M7000 이미징 시스템 | Invitrogen | AMF7000 | |
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| 광학 튜브 캡 8x 스트립 (401425) | 애질런트 | 401425 | |
| Poseidon 31-511, HS24 마이크로 원심분리기, 24 x 1.5/2.0 mL 로터 포함, 원심분리기 1개/장치 | Genesee | 31-511 | |
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| 테이프스테이션 4150 | 애질런트 | G2992AA | |
| 트리스-HCL (Ph7) | 품질 생물학 | 351-007-101 | |
| 트리판 블루 스테인 0.4% | 테로모 피셔 사이언티픽 | T10282 | |
| 트라이플 익스프레스 | Gibco | 12604-021 | |
| Tween-20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Vortex 믹서 IKA MS3(96웰 샘플 플레이트 어댑터 | IKA | 3617000 |
참고문헌
- Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering. Dev Biol. 488, 35-46 (2022).
- Kim, Y., Kim, I., Shin, K. A new era of stem cell and developmental biolo....
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