방법 논문

미세전극을 사용한 3차원 위장 오가노이드의 루미날 pH 프로파일링

DOI:

10.3791/66900

⸱

2024년 7월 5일

 ,  , 
1Department of Microbiology & Cell Biology, Montana State University, 2Department of Physics, Boston University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 프로토콜은 내강 내 생리학의 시공간 특성 분석을 위해 미세전극을 사용하는 인체 조직 유래 위 오가노이드의 pH 측정에 대해 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위장관 오가노이드 모델의 최적화와 상세한 특성 분석을 위해서는 발광 환경을 분석하기 위한 고급 방법이 필요합니다. 이 논문은 미세조작기 제어 미세전극을 통해 3D 인간 위 오가노이드의 루미나 내에서 pH를 정밀하게 측정하기 위한 재현성이 높은 방법을 제시합니다. pH 미세전극은 상업적으로 이용 가능하며 직경이 25μm인 비스듬한 유리 팁으로 구성됩니다. 측정을 위해 pH 미세전극은 Matrigel에 현탁된 오가노이드(>200μm)의 루멘으로 이동하고, 기준 전극은 배양 플레이트의 주변 매체에 잠겨 있습니다.

이러한 미세 전극을 사용하여 인간 위체에서 유래한 오가노이드를 프로파일링함으로써 루미날 pH가 ~7.7 ± 0.037로 각 배양유 내에서 비교적 일관되며 최소 15분 동안 연속 측정을 얻을 수 있음을 입증합니다. 일부 대형 오가노이드에서는 측정 결과 상피 표면과 내강 사이의 pH 구배가 나타났으며, 이는 오가노이드의 pH 측정이 높은 공간 분해능으로 달성될 수 있음을 시사합니다. 이전 연구에서는 미세전극을 사용하여 오가노이드의 발광 산소 농도를 측정하는 데 성공했으며, 이는 오가노이드 분석을 위한 이 방법의 다양성을 입증했습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 3D 오가노이드 내 복잡한 발광 공간의 기능적 특성화를 위한 중요한 도구를 설명합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

줄기 세포에서 유래한 오가노이드(organoid)는 인간 생리학을 연구하는 우리의 능력에 혁명을 일으켰으며, 규제 환경에서도 동물 모델을 대체하기 시작했습니다1. 2009년 Sato et al.이 장내 오가노이드를 처음 설명한 이후 오가노이드 기술은 엄청난 인기를 얻었습니다2. 많은 연구에서 오가노이드 모델의 세포 구성과 기능을 매우 상세하게 특성화했습니다 3,4,5,6. 그러나, 이러한 3D 다세포 구조의 발광 공간은 대체로 정의되지 않은 채로 남아 있다 7,8. 내강(元腺)은 점막 조직에서 유래한 오가노이드의 중심 구멍으로, 분극화된 상피 세포의 정점 부분으로 둘러싸여 있습니다. 세포 분비와 흡수는 주로 정점 상피 표면에서 발생하기 때문에 오가노이드의 발광 미세환경은 이러한 중요한 생리학적 과정에 의해 제어됩니다. 현재 사용되는 오가노이드 모델은 세포 신호 전달 패턴, 전반적인 줄기 농도, 대사 산물 농도 구배 및 환경 조건의 변화를 보여줍니다9. 따라서 장기 기능 및 병리학의 정확한 모델링을 위해서는 오가노이드 발광 생리학을 이해하는 것이 필요합니다. 불행히도, 루멘의 상대적 접근성은 3D 오가노이드10에서 발광 생리학의 기능적 분석을 크게 방해합니다.

pH 프로파일을 검사할 수 있는 능력은 위에서 특히 중요한데, 위장은 내강에서 약 1-3에 이르는 신체에서 가장 가파른 양성자 구배에서 상피11,12,13에 이르는 거의 중성으로 유명합니다. 위 pH 구배의 미시적 유지에 대한 이해와 위 점액층 전반에 걸쳐 이러한 동적 환경을 요약하는 데 있어 오가노이드 모델의 관련성에 대한 이해에는 상당한 격차가 남아 있습니다. 오가노이드 pH 분석을 위한 기존 접근법에는 형광 또는 비색 지시약일 수 있는 pH에 민감한 염료의 사용이 포함되었습니다. McCracken et al.은 히스타민 처리에 대한 반응으로 루미날 pH의 강하를 분석하기 위해 SNARF-5F-a 비율계량 pH 지시약을 오가노이드에 루미날 주입했습니다. 이러한 염료는 배양 배지에 통합될 수 있으므로 pH를 실시간으로 비침습적으로 모니터링할 수 있습니다. pH에 민감한 염료는 측정의 신뢰성과 정확도가 떨어지는 복잡한 보정 단계를 필요로 할 뿐만 아니라, 이러한 염료는 관심 미세환경 내에서 전체 pH 범위를 대표하지 않을 수 있는 특정 검출 범위 내에서 작동하는 경향이 있습니다14,15. 그러나 확증 실험을 위해 지시자 염료를 사용하는 것이 합리적인 것으로 간주 될 수 있습니다. 형광 optode 기반의 pH 감지 방식을 사용하는 광학 나노 센서도 개발되었습니다. 그러나 이러한 감지 기술은 현미경 이미징이 필요하며 광표백, 광독성 및 이미징 바이어스(imaging bias)에 취약합니다16,17. 또한, Brooks et al.은 미세전극을 포함하는 3D 프린팅된 멀티웰 플레이트를 가지고 있으며, 그 위에 오가노이드가 도금될 수 있습니다18. 그러나 이 접근 방식은 오가노이드 루멘 내부에서 직접 측정할 수 없습니다.

전극 기반 pH 측정은 다른 방법에 비해 향상된 정확도를 달성할 수 있을 뿐만 아니라 실시간 pH 모니터링을 제공할 수 있습니다. 또한 마이크로 매니퓰레이터에 장착된 pH 전극은 전극 팁의 정확한 위치를 미세하게 제어할 수 있으므로 pH 측정의 우수한 공간 분해능을 허용합니다. 이를 통해 오가노이드 모델 분석에서 최고의 유연성과 재현성을 얻을 수 있습니다. 여기에 사용된 전극은 얇은 백금 와이어를 둘러싸고 있는 선택적 pH 유리를 통한 양성자의 확산을 기반으로 작동하는 소형 pH 미세 전극입니다. 미세 전극은 외부 Ag-AgCl 기준 전극에 연결된 다음 고임피던스 밀리볼트 미터에 연결됩니다. 동일한 용액에 담갔을 때 두 전극 팁 사이의 전위는 용액(19)의 pH를 반영합니다. 이러한 미세프로파일링 시스템은 생물막(20,21), 플랑크톤 조류(22), 인간 객담 샘플(23), 심지어 중간엽 줄기세포 스페로이드(24)의 대사 분석에 사용되어 왔다. 우리 연구실과 Murphy 등은 이전에 미세조작기 제어 O2 미세전극을 사용하여 오가노이드의 발광 공간에서 산소 농도를 평가했습니다. Murphy et al.은 이 방법을 수학적 모델링과 결합하여 스페로이드 내의 산소 구배를 밝혔습니다. 우리 그룹은 조직 유래 위 오가노이드에서 주변의 세포외 기질에 비해 감소된 내강 산소 농도를 확인할 수 있었습니다25.

여기에서는 구형 위장관 오가노이드에서 루미날 pH를 수동으로 프로파일링하는 자세한 방법을 제공하여 복잡한 내강 미세환경에 대한 생리학적 이해를 높일 수 있습니다. 우리는 이 기술이 마이크로 스케일에서 pH 수준의 실시간 고분해능 측정을 통해 오가노이드 생리학 탐구에 새로운 차원을 추가할 것으로 기대합니다. 또한, 다음 프로토콜은 다양한 유형의 오가노이드 모델에서O2,N2O,H2, NO,H2S, 산화 환원 및 온도 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다. 생리학적 프로파일링은 생체 내 환경을 더 잘 모방하기 위해 오가노이드 배양 조건을 최적화하는 데 유용한 도구 역할을 하며, 이를 통해 생물의학 연구에서 오가노이드 모델의 관련성과 유용성을 향상시킵니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜에는 고유한 내강이 있고 인공 세포외 기질(ECM, 예: Matrigel)에 내장된 직경이 최소 200μm인 3D 오가노이드가 필요합니다. 오가노이드 유도를 위한 인체 위 조직은 몬태나 주립대학교 기관 검토 위원회(Institutional Review Board)의 승인과 Bozeman Health(프로토콜 # 2023-48-FCR, D.B.)에서 상부 내시경을 받는 환자의 정보에 입각한 동의를 얻어 획득했으며, 미국 국립질병연구교환지(National Disease Research Interchange, 프로토콜 #DB062615-EX)에서 면제된 위 전체 또는 소매 절제술 검체로 획득했습니다. 본 연구에 사용된 오가노이드 라인 및 통로 번호에 대한 정보는 표 1에 제공되었으며, 매체 조성은 표 2에 기재되어 있다. 위장관 오가노이드 라인의 생성 및 유지를 위해 이전에 발표된 프로토콜 6,26,27을 참조하십시오.

1. pH 프로파일링을 위한 인간 위 오가노이드 준비

  1. 표준 프로토콜을 사용하여 위 오가노이드 배양을 시작하고 유지합니다. 웰당 500μL의 팽창 매체에서 24웰 플레이트의 오가노이드를 유지합니다(표 2). Passage는 5-7일마다 오가노이드 라인을 구축하여 pH 프로파일링 실험을 준비하기 위해 35mm 유리 바닥 접시로 옮겼습니다.
    참고: 당사의 실험을 위한 오가노이드 배양은 위에서 설명한 대로 성인 조직에서 얻은 위샘 제제에서 파생됩니다. 우리는 이전에 설명한 바와 같이 ECM에 부유하기 전에 이러한 분비샘을 분리하기 위해 콜라겐 분해 효소 조직 소화 방법을 사용합니다 25,28,29.
  2. 통로 1-15에서 활발하게 성장하는 오가노이드 배양물에서 3.5mm 페트리 접시에서 전달 및 팽창하기 위해 직경이 200에서 700μm 사이인 최소 100개의 오가노이드(약 200만 개의 세포)가 포함된 웰을 선택합니다.
  3. 도금을 위해 오가노이드를 준비하는 동안(1.4-1.8단계) 세포외 기질(ECM) 부분 표본이 얼음에서 최소 45분 동안 해동되도록 합니다. 겔화를 방지하기 위해 이 프로토콜 전반에 걸쳐 얼음 위에서 ECM을 유지하십시오. 세포 배양 플레이트를 37 °C, 5%CO2 인큐베이터에 넣어 미리 데웁니다.
  4. 웰에서 배지를 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS를 각 ECM 방울에 피펫팅하고 P1000 피펫 끝으로 겔을 긁어 위 오가노이드 배양물을 수확합니다. 오가노이드가 포함된 ECM 단편이 있는 PBS를 15mL 코니컬 튜브에 피펫팅합니다.
  5. 4°C에서 200× g 으로 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 오가노이드를 포함하는 ECM 단편은 튜브 바닥에 층으로 보입니다. 상층액과 피펫 350μL의 0.25% 트립신-EDTA를 각 튜브에 조심스럽게 흡입하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다. 37°C 수조에서 2-5분 동안 튜브를 배양합니다.
  6. trypsin-EDTA로 배양한 후 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 600μL의 얼음처럼 차가운 DMEM을 각 튜브에 추가하고 최소 40배 이상 위아래로 세게 피펫팅합니다. 4°C에서 200× g 으로 5분 동안 원심분리기 상층액을 흡인합니다. pH 측정을 위한 배양액을 설정하려면 도금용 ECM에 대한 오가노이드 펠릿의 1:4 v/v 비율로 셀 펠릿을 얼음처럼 차가운 액체 ECM에 재현탁시킵니다.
  7. 각 샘플에 대해 오가노이드/오가노이드 단편이 포함된 40μL의 액체 ECM을 35mm 유리 바닥 접시의 직경을 따라 얇은 수평선으로 플레이트합니다.
    참고: 겔을 둥근 방울 대신 일렬로 플레이트에 분주하면 배양물을 얇게 하여 개별 오가노이드에 더 쉽게 접근할 수 있습니다.
  8. 겔을 15-30분 동안 중합시키십시오. 그런 다음 겔을 방해하지 않도록 웰 가장자리를 따라 피펫팅하여 플레이트에 2mL의 오가노이드 확장 매체를 조심스럽게 추가합니다.
  9. 이틀에 한 번씩 미디어를 교체합니다. 최소 10개의 오가노이드가 최소 직경 400μm로 성장하는 데 4-8일이 소요됩니다.
  10. pH 프로파일링 실험을 진행하려면 각 배양에 직경이 >200μm이고, 외관이 양호하며(명시야 현미경으로 관찰한 오가노이드 내에서 어두운 물질이 거의 또는 전혀 보이지 않음), 다른 오가노이드에 의해 과도하게 밀집되지 않음 기준을 충족하는 오가노이드가 10개 이상 포함되어 있는지 확인하십시오.

2. 미세전극의 포장 풀기 및 교정

참고: 마이크로 스케일 측정을 가능하게 하려면 통합된(따라서 더 부피가 큰) 설계를 사용하는 대신 pH 센서 마이크로 전극 외에 별도의 기준 전극이 사용됩니다. pH 미세 전극과 기준 전극은 모두 젖은 상태로 보관해야 합니다. 한 번에 10분 이상 공기에 노출시키지 마십시오. 응용 분야에 적합한 팁 크기를 결정하십시오. 여기에서는 베벨 팁 직경이 25μm인 전위차 pH 미세전극을 사용했습니다.

  1. 미세 전극이 보호 튜브에 있는 상태에서 팁에 손상이 있는지 육안으로 검사합니다.
  2. 커넥터를 통해 기준 전극을 pH 전극 케이블에 연결합니다. 그런 다음 미세 전극을 증폭기에 연결하고 증폭기를 USB 케이블을 통해 소프트웨어를 사용하여 접지된 PC에 연결합니다(그림 1A).
  3. 두 개의 50mL 코니컬 튜브 2/3에 70% 에탄올과 탈이온화된 H2O(diH2O)를 채웁니다. 미세 전극과 기준 전극을 diH2O 튜브에 놓고 두 팁이 액체에 최소 1cm 잠겨 있는 것처럼 보이도록 합니다.
    알림: 키가 큰 비커도 이 단계 및 유사한 단계에 사용할 수 있습니다.
  4. 전극이 ~10분 동안 평형을 이루도록 합니다.
    참고: 이 단계에서 절차를 일시 중지하고 전극이 diH2O에 저장될 수 있으므로 나중에 재개할 수도 있습니다.
  5. 전극이 평형을 이루는 동안 컴퓨터 워크스테이션에서 소프트웨어(빨간색 아이콘)를 엽니다. 설정 탭에서 미세 전극 옆의 상자가 선택되어 소프트웨어에서 제대로 연결되고 인식되었음을 나타내는지 확인합니다. 창의 왼쪽 상단에서 실험 시작 을 클릭하고 원하는 파일 이름과 대상을 입력합니다. Sensor calibration & experiment settings(센서 보정 및 실험 설정 ) 창에서 Clear all points(모든 점 지우기 )를 클릭하여 새 보정을 위해 소프트웨어를 준비합니다.
  6. 2개의 50mL 코니컬 튜브 2/3에 pH 4.01 및 pH 9.21 교정 버퍼를 채웁니다. 섬세한 실험실 물티슈로 보호 튜브와 기준 전극을 부드럽게 닦아내십시오.
  7. pH 4.01 버퍼의 전극부터 시작하여 알려진 pH 값으로 4.01 을 입력합니다. mV 판독값이 안정화되면 포인트 추가를 선택합니다. 신호가 ~380mV에서 안정적인지 확인합니다. 점을 추가한 후 두 전극을 diH2O에 다시 넣어 헹구고 다시 건조시킵니다.
  8. 9.21 버퍼로 이전 단계를 반복하고 신호가 안정적일 때(~83mV) 포인트 추가 를 클릭합니다. 미세 전극이 pH 4.01과 9.21 사이에서 선형으로 반응하는지 확인하십시오. 따라서 2점 검량선만 필요합니다. 이러한 점 사이의 결과 선이 50-70mV/pH 단위의 음의 기울기를 갖는지 확인합니다. Save & use calibration(저장 및 보정 사용)을 클릭합니다.
    알림: 이제 측정30을 기록할 준비가 되었습니다.

3. 인간 위 오가노이드의 pH 프로파일링

참고: 다음 프로토콜은 오른손잡이 사용자를 위해 설명됩니다. 주의: PC가 절전 모드로 전환되면 진행 중인 측정이 중단되므로 PC의 모든 절전 옵션을 비활성화하십시오.

  1. cl이 있는 링 스탠드를 조립합니다.amp 실체현미경의 왼쪽에 있어 기준 전극을 고정합니다. 현미경 오른쪽의 무거운 실험실 스탠드에 부착된 마이크로 매니퓰레이터를 배치합니다(그림 1A).
  2. 미세 전극을 벤치에 평평하게 놓고 빠르고 빠른 동작으로 케이스를 당겨 보호 케이스에서 조심스럽게 제거합니다.
    주의 : 미세 전극은 매우 깨지기 쉬우므로 팁이 뻣뻣하고 단단한 물질과 접촉하지 않도록 주의해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 벤치의 진동이나 전극의 원치 않는 움직임을 유발할 수 있는 장비가 없는 견고한 벤치탑에서 측정을 수행하십시오.
  3. 미세전극을 미세매니퓰레이터에 장착하고 미세전극이 대물렌즈나 현미경의 다른 부분에 부딪히지 않고 배양 접시 쪽으로 전진할 수 있도록 스테레오스코프와 미세매니퓰레이터를 배열합니다.
  4. 프로파일링할 첫 번째 오가노이드를 적절하게 시각화할 수 있도록 오가노이드가 포함된 배양 접시를 배치합니다(그림 1B).
  5. 기준 전극을 cl에 가볍게 고정합니다.amp 스테레오스코프 왼쪽에 있는 링 스탠드에 있습니다. ECM을 둘러싼 매체에 놓이도록 기준 전극을 배치합니다. stage가 측정 사이에 이동할 때 오가노이드를 방해하지 않도록 주의하십시오.
  6. 배양 플레이트를 직접 보면서(현미경이 아님) 매체에 충분히 잠길 때까지 미세 전극의 끝을 전진시킵니다. 소프트웨어의 데이터 로거 탭에서 시작 버튼(오른쪽을 가리키는 단일 삼각형)을 클릭하여 녹음을 시작합니다. 화면 오른쪽에서 Calibrated 확인란이 선택되어 있는지 확인합니다.
    알림: 다음 지역으로 이동하기 전에 각 판독값이 안정화될 때까지 ~10초를 허용합니다.
  7. ECM에 들어가기 전에 전극 팁이 현미경에서 볼 수 있고 관심 있는 첫 번째 오가노이드를 향해 선형으로 전진할 수 있는 위치에 있는지 확인하십시오. 오가노이드와 접촉하지 않고 전극을 겔 안으로 천천히 전진시킵니다. 최소 3개의 pH 판독값을 기록하고 평균을 계산합니다.
  8. 표면에 수직인 축을 따라 관심 있는 첫 번째 오가노이드를 향해 전진할 준비가 되도록 미세전극을 배치합니다. 전극이 침투하지 않고 상피 표면에 약간의 움푹 들어간 곳을 만들도록 합니다(그림 1C).
    참고: 이 단계는 또한 오가노이드가 제자리에 유지될지 또는 ECM에서 더 자유롭게 이동할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공합니다.
  9. 한 번의 빠른 동작으로 미세전극을 오가노이드로 전진시킵니다. 오가노이드가 미세전극 주위를 움직이거나 멀어지면 약간 다른 각도를 시도하거나 다른 오가노이드 또는 접시의 커버글라스 바닥을 둘러싼 플라스틱 테두리에 대고 백업합니다. 각 실험 조건에 대해 10개의 서로 다른 오가노이드의 루날 pH(개별 시간 3회)를 측정합니다. 측정 기록이 끝나면 사각형 중지 버튼을 클릭합니다.
    주의: 오가노이드의 직경을 추정하여 전극을 오가노이드 루멘으로 얼마나 전진시킬지 결정하고 관통하지 않도록 주의합니다. 정확도를 높이려면 현미경의 카메라 소프트웨어(사용 가능한 경우)로 직경을 측정하십시오. 참고: 한 번 또는 여러 번 측정한 후 미세전극의 끝이 파편으로 눈에 띄게 코팅되면 진행하기 전에 미세전극을 셀 해리 용액, PBS, EtOH 및 diH2O로 세척하십시오.

4. 전동 프로파일링(선택 사항)

참고: 이 옵션은 기계식 모터 스테이지에 장착된 마이크로 매니퓰레이터를 필요로 하며, 이는 궁극적으로 모터 컨트롤러(31)를 통해 컴퓨터 소프트웨어에 의해 제어됩니다.

  1. 프로파일링 소프트웨어(갈색 아이콘)를 열고 프로파일링 탭에서 새 실험을 시작합니다.
  2. z축에 대한 설정은 모터 장치가 제대로 연결되면 모터 를 자동으로 인식합니다.
    알림: x 및 y 방향의 이동은 여전히 이 설정으로 수동으로 제어됩니다.
  3. 프로필 상호 작용 탭30을 찾습니다. 시작을 누르기 전에 원하는 거리에서 오가노이드가 진입할 수 있도록 현미경 접안렌즈를 보는 것으로 빠르게 전환할 수 있는지 확인하십시오. 프로필 설정으로 이동하여 다음을 수행합니다.
    1. 시작 거리가 0μm임을 나타냅니다.
      주의: 주어진 오가노이드에서 상피 껍질이 특히 단단한 경우 오가노이드가 침투하는 대신 밀려나거나 변형될 수 있습니다. 미는 경우 전극을 계속 전진시키되 소프트웨어가 이를 자동으로 기록할 수 없으므로 진입이 발생하는 지점에 유의하십시오.
    2. 프로파일링되는 오가노이드의 크기를 판단할 때 오가노이드의 추정 직경을 3/4 이하로 하는 끝 거리를 나타냅니다.
      알림: 이 특정 단계는 전극 팁의 손상을 방지하도록 설계되었습니다.
    3. 원하는 단계 크기( 그림 2E와 같이 100μm)를 나타냅니다. 최소 단계 크기가 전극 팁의 크기와 일치하는지 확인합니다(예: 25μm pH-25 전극 팁의 경우 25μm).
    4. 모터가 프로파일 사이의 전극 팁을 되돌릴 안전한 위치를 나타냅니다.
      NOTE: 이 높이는 수동 미세 조작기를 사용하여 센서를 x 및 y 방향으로 안전하게 옆으로 이동할 수 있는 샘플(오가노이드 외부)보다 편안한 높이여야 합니다. 센서 각도 를 기본 설정으로 둡니다.
    5. 전극이 평형을 이룰 수 있도록 하려면 측정 전 대기(Wait before measure(s)) 아래에 최소 3초를 표시하십시오.
    6. 측정 기간을 1초 이상으로 설정합니다. 이 기간 동안의 측정값은 평균화됩니다.
      알림: 전기 노이즈가 많은 환경에서 측정을 수행하는 경우 더 긴 기간을 표시하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
    7. Delay between(s) 을(를) 최소 1초로 설정합니다.
    8. 각 수심에서 측정할 기본 반복실험 수를 설정합니다.
    9. 시작 버튼을 눌러 측정값 기록을 시작합니다.

5. 전극 청소

  1. 청소할 전극을 보호 튜브에 다시 넣습니다.
  2. 측정 후 diH2O로 전극을 세척하십시오.
  3. 몇 분 동안 70% 에탄올로 전극을 세척합니다.
  4. pH 4.01 버퍼로 전극을 헹굽니다.
  5. 측정을 진행하기 전에 diH2O로 전극을 한 번 더 헹굽니다.

6. 전극의 보관

알림: 두 전극 모두 우발적인 손상으로부터 안전한 활동이 적은 장소의 실온에서 보관해야 합니다.

  1. pH 미세전극을 사용한 후에는 조심스럽게 수평으로 보호 튜브에 다시 밀어 넣습니다(수평 지지를 위해 실험실 벤치를 따라 미끄러짐).
  2. 미세 전극을 똑바로 잡고(끝이 위쪽을 향함) 보호 튜브에 멸균수를 부드럽게 채웁니다. 전극과 함께 제공된 스토퍼로 보호 튜브를 꽂습니다. 보호 튜브의 모든 구멍이 전기 테이프로 밀봉되어 있는지 확인하십시오. 다음에 사용할 때까지 비산 방지 상자에 보관하십시오.
    알림: 전극을 보관할 때 전극을 제자리에 고정하도록 설계된 보호 인서트가 들어 있으므로 전극이 들어 있던 원래 상자를 사용하는 것이 좋습니다.
  3. 기준 전극을 3M KCl 용액으로 채워진 비커 또는 눈금이 매겨진 실린더에 보관합니다. 용액의 증발을 방지하기 위해 비커/눈금이 매겨진 실린더를 파라필름으로 덮습니다.
    알림: 눈금이 매겨진 실린더를 사용하는 경우 우발적인 움직임을 방지하기 위해 테이프로 실험실 벤치에 고정하는 것이 좋습니다.

7. (선택) 메틸 빨강 주입

알림: 메틸 레드는 미세 전극 측정을 검증하는 데 사용할 수 있는 비색 지시약 염료입니다.

  1. 2μL 유리 모세관에 멸균 미네랄 오일을 다시 채우고 미세 조작기로 제어되는 nL 자동 주입기에 로드한 다음 0.02% 메틸 레드 및 150mM HCl이 포함된 용액으로 채웁니다.
    알림: 용액은 HCl의 산성도로 인해 모세관에 있는 동안 빨간색/분홍색으로 나타나야 합니다.
  2. 직경이 300μm 이상인 오가노이드에 9.2μL의 용액25를 주입합니다.
  3. 실체현미경에 맞게 조정된 카메라를 사용하여 이미지 또는 비디오를 캡처합니다(그림 2G).

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

위산 분비는 인간의 위장에서 중요한 기능을 합니다. 그러나 오가노이드에서 산 분비를 어느 정도까지 모델링할 수 있는지는 여전히 논쟁의 여지가 있습니다 6,32,33,34. 따라서 우리는 위 오가노이드의 산 생성을 정확하게 측정하기 위해 위에서 설명한 프로토콜을 개발했습니다. 특히, 표준 팽창 조건에서 배양한 자극되지 않은 성체 줄기세포 유래 오가노이드를 여러 번 통과시켰으며, 이로 인해 두정세포 손실이 발생했습니다35. 따라서, 산 분비 두정 세포의 존재와 활성 산 방출은 우리의 모델 시스템에서 예상되지 않았습니다.

실험을 위해 직경이 200μm에서 1,000μm 사이인 오가노이드를 유리 바닥 접시에 파종했습니다. 먼저, 미세 전극에 대해 팁 직경이 25μm인 pH-25와 팁 직경이 50μm인 pH-50의 두 가지 팁 크기를 테스트했습니다. 그림 2A에서 볼 수 있듯이, 더 작은 팁과 더 큰 팁으로 얻은 측정값 간에 큰 차이는 없었습니다. 흥미롭게도 오가노이드의 기준선 pH는 ~pH 8에서 약알칼리성인 경향이 있었습니다. 다음으로 25μm pH-25 팁을 사용하여 각 오가노이드에서 얻은 3개의 측정값을 통해 동일한 배양 플레이트에서 유지되는 서로 다른 10개의 오가노이드 내에서 내강 pH의 변화를 평가했습니다(그림 2B). 한 플레이트 내에서 개별 오가노이드의 루날 pH는 유의미하지 않은 약간의 변동만 보였습니다(8.16 ± 0.12; p ≥0.0445-0.99)(그림 2B). 또한 3에서 16 사이의 통로가 있는 5개의 서로 다른 오가노이드 라인 내에서 광내 pH 측정을 비교했습니다(그림 2C). 다시 말하지만, 각 배양 내에서 일관된 pH 측정이 발견되었지만 오가노이드 라인 간에는 상당한 변동이 있었습니다. 그러나 루미날 pH는 일반적으로 pH 7.3과 pH 8.2 사이로 한 자릿수 이내로 유지되었으며, 초기 통과 수와 후기 통과 수를 비교할 때 평균 pH에 대한 뚜렷한 경향은 없었습니다(그림 2C). 다음으로 오가노이드 내강의 pH가 오가노이드 확장 매체 및 세포외 기질(ECM)의 pH와 직접적인 관련이 있는지 물었습니다. 배지, 오가노이드를 둘러싼 ECM 및 오가노이드 내강을 비교한 결과, 오가노이드의 발광 pH는 ECM보다 낮고 ECM pH는 주변 오가노이드 확장 매질의 pH보다 낮았으며(그림 2D), 오가노이드의 발광 pH가 배양 환경에 의해 직접 결정되는 것이 아니라 생리학적으로 관련이 있음을 시사합니다. 6개의 독립적인 실험에서 평균 루미날 pH는 7.13 ± 0.09로 중성에 가깝게 측정되었습니다.

전동식 미세 조작기를 사용하여 더 큰 공간 분해능으로 오가노이드 루멘의 pH 측정값을 얻었습니다. 이 접근법은 점액으로 채워진 오가노이드 내강(29 ) 내의 pH 또는 기타 그래디언트를 기록해야 하는 경우에 적합합니다. 그림 2E 는 대형 오가노이드(직경 >1,000μm)에서 pH 측정의 두 가지 대표적인 시리즈를 보여주며, 각 오가노이드의 진입점을 보여주고 ~800μm 깊이에서 끝납니다. 프로파일링된 두 오가노이드의 직경이 같지 않기 때문에 측정값을 즉시 비교할 수 없습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 상피 표면과 더 깊은 오가노이드 루멘 사이에 Δ0.6의 약간의 pH 구배의 증거를 보여줍니다(그림 2E). 시간 경과에 따라 오가노이드에서 pH 측정을 수행하여 처리 반응을 실시간으로 측정할 수 있는 타당성을 결정하기 위해 대표 오가노이드 내부의 내강 내 pH를 약 20분 동안 기록했으며 초기 적응 기간 후에도 판독값이 매우 일관되게 유지됨을 발견했습니다(그림 2F). 독립적인 방법으로 루날 pH 측정을 검증하기 위해 pH에 민감한 비색 염료(메틸 레드)를 사용하여 마이크로매니퓰레이터 장착 나노리터 자동주입기를 사용하여 오가노이드 루멘에 주입했습니다(그림 2G). 염료의 노란색 착색은 오가노이드 루멘의 pH >6.2를 확인했으며, 이는 거의 중성에 가까운 pH를 보여준 미세 전극 측정과 일치합니다. 전반적으로, 이러한 대표적인 결과는 오가노이드 배양에서 미세전극 기반 pH 측정의 타당성과 재현성을 보여줍니다.

figure-results-1
그림 1: 방법 개요. (A) 프로파일링 설정의 개략도. 그림 1A 의 미세 전극은 Unisense 웹사이트에서 발췌한 것입니다. 36 (B) 프로파일링 준비가 된 오가노이드 배양, 주변 ECM 및 주변 매체의 대표 이미지(스케일 바 = 5mm). (C) 오가노이드 프로빙을 준비하기 위한 올바른 미세전극 배치의 예(스케일 바 = 500μm). 약어: ECM = extracellular matrix. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 인간 위 오가노이드의 마이크로센서 프로파일링 검증. (A) 25 μm (pH-25) 및 50 μm (pH-50) 미세전극 팁을 사용한 중간 루멘 pH 측정 비교. 10개의 개별 오가노이드에서 얻은 데이터로, 각각 단일 대표 실험에서 추출한 데이터입니다. (B) 10개의 개별 오가노이드에 대해 3회의 반복 pH 측정을 수행했습니다. 다중 비교를 사용하는 일원 분산 분석(p = 0.1229). (C) pH-25 전극으로 얻은 pH 측정은 서로 다른 통로 번호에서 분석된 5개의 오가노이드 라인 각각에서 일관됩니다. 크기와 가용성에 따라 라인당 측정된 4-10개의 오가노이드. 다중 비교를 통한 일원 분산 분석(p < 0.0001). (D) 위 오가노이드 및 주변 Matrigel 및 배지 내 pH 측정(n = 6개의 독립적인 실험). pH-25로 위 상피 오가노이드를 관통하여 얻은 측정치. 각 데이터 포인트는 단일 오가노이드 내에서 10개의 개별 pH 측정의 평균입니다. 일원 분산 분석(p < 0.0001). (E) 전동식 미세 조작기를 사용하는 두 가지 대표적인 오가노이드의 상피-루멘 pH 프로필. (F) 하나의 대표적인 오가노이드에서 시간 경과(~19.8분) 따른 pH 안정성. (G) 메틸 레드 pH 지시약 염료 및 HCl을 위 오가노이드 내강에 미세 주입합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

기증자
숫자줄통로성연령민족성
2ᅡ356F40B
2ᄂ715F26B
74F26B
116F45C
343F44알려지지 않은
356F40B
2씨715F26B
2차원361알려지지 않은
75F26B
371알려지지 않은
313F45H
79F26B
74F26B
2E1015F43알려지지 않은
2층343F33C
2지75F26B

표 1.

인간 위 오가노이드 확장 배지(L-WRN)
L-WRN 컨디셔닝 매체50%
고급 DMEM/F1237%
소 태아 세럼10%
페니실린/스트렙토마이신1%
L-글루타민1%
겐타마이신0.10%
암포테리신 B0.10%
HEPES 완충액0.40%
Y-276320.10%
SB-431542 시리즈0.10%

표 2.

보충 그림 S1: 인간 위 오가노이드에서의 이온 수송체 발현. 18S rRNA로 정규화된 상대 복제 수. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S2: pH 마이크로센서 프로브로 구멍을 뚫은 후 구조가 변형된 인간 위 오가노이드. 눈금 막대 = 1mm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 S1: 위 오가노이드 배양에서 실패한 프로파일링 시도. 25 μm pH 미세전극은 관심 오가노이드를 향해 수동으로 전진합니다. 각도 판단 착오로 인한 시도가 실패한 후 다른 각도를 시도하고 오가노이드에 프로파일링할 구조적 무결성이 부족한 것으로 밝혀졌습니다(구형 구조는 견고하지 않고 전극으로 침투하면 변형됨). 그런 다음 사용자는 다른 오가노이드를 시도하기 위해 리디렉션합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

오가노이드의 발광 공간에 대한 제한된 접근은 이 미세환경의 생리학적 역학에 대한 우리의 이해를 심각하게 제한했습니다. 루미날 생리학의 기능 분석을 위한 신뢰할 수 있는 도구는 생리학, 약리학 및 질병 연구를 위한 체외 모델처럼 오가노이드를 활용할 수 있는 능력을 확장할 것입니다. 오가노이드는 조정 가능성이 높고 생리학적으로 관련성이 높은 모델로, 인간 집단 내에서 유전적 다양성을 복제할 수 있는 잠재력이 있습니다. 오가노이드 내강 내부의 pH 측정을 위한 기존 방법은 pH에 민감한 염료 또는 나노입자를 사용했으며, 이러한 방법은 종종 형광 현미경 또는 분광법 16,17,37과 결합되어야 합니다. 설명된 마이크로센서 기반 프로파일링 방법은 새로운 공간 정밀도로 위장 오가노이드의 내강 내 pH를 측정하기 위한 새로운 경로를 제공합니다. 당사의 분석법은 위장관 오가노이드 루미날 pH의 일관되고 신뢰할 수 있는 측정과 pH 구배의 증거를 보여줍니다. 미발표 실험에서는 양성자 교환을 담당하는 SLC9A3, 9A4, 9A8뿐만 아니라 중탄산염 분비를 담당하는 것으로 알려진 SLC4A2 및 26A7 계열 유전자의 발현을 확인하였다(보충 그림 S1)38,39,40,41. 우리의 연구는 중탄산염 분비가 우세하고 오가노이드에 두정 세포가 부족하다는 것을 시사하며, 이는 알칼리성을 설명할 수 있습니다.

사용되는 미세전극이 오가노이드 미세프로파일링에 적합한지 확인하는 것이 중요하며, 여기에는 올바른 팁 직경을 선택하는 것이 포함됩니다. 25μm 및 50μm 팁을 모두 시도해 보았고 유사한 결과를 얻었지만(그림 2A) 측정값이 비스듬한 팁 영역에서 평균을 내기 때문에 덜 침습적이고 더 높은 공간 해상도를 제공할 것으로 예상되었기 때문에 제조업체의 조언에 따라 더 작은 팁 크기를 사용하기로 결정했습니다. 그러나 단점으로 팁이 작을수록 깨지기 쉽습니다. 원하는 공간 분해능을 결정할 때 오가노이드 크기를 고려해야 합니다.

프로토콜의 중요한 단계는 ECM의 pH와 오가노이드 내강 내 pH를 구별할 수 있는 능력을 보장하는 것이었고, 그 후에는 주변 배양 배지에서 구별할 수 있는 능력을 보장하는 것이었습니다. 오가노이드(organoids) 안팎으로 합리적인 양의 대사산물 플럭스(metabolite flux)가 유입될 것으로 예상할 수 있다(42). 우리는 오가노이드의 pH가 환경의 영향을 받을 것으로 예상하며, 6개의 독립적인 실험에서 오가노이드가 주변 환경보다 일관되게 덜 알칼리성임을 발견했습니다(그림 2D). 또한 안정성은 센서 교정 중과 마찬가지로 프로파일링에서도 중요합니다.

조직 유래 오가노이드는 어느 정도의 공여체 간 변동성을 나타낼 것으로 예상되므로, 약물 치료와 같은 실험적 중재를 적용하기 전에 기준선에서 오가노이드 라인을 프로파일링하는 것이 필수적이다43. 우리는 하나의 오가노이드 배양 내에서 pH의 변동이 면역형광 및 면역조직화학적 염색(미공개 데이터)에 의해 결정된 미세 규모의 국소 이온 구배와 내강 점액의 이질적인 분포 때문일 수 있다는 가설을 세웠습니다. 개별 오가노이드 라인과 통로 간에 관찰된 pH 변화는 세포 구성 및 오가노이드의 분비 활성의 개인차 때문일 수 있습니다. 또한 일부 오가노이드 라인은 본질적으로 다른 오가노이드 라인보다 침투하기가 더 어렵다는 것을 발견했습니다. 마찬가지로, 일부는 전극 진입 시 구조적 무결성을 잃고 붕괴될 수 있습니다(보충 그림 S2 및 추가 비디오 S1). 이는 오가노이드 통로와 관련이 없는 것으로 보이지만 직경이 ~1.5mm 이상인 오가노이드에서 가장 일반적으로 관찰되었습니다. 이전 연구에서 우리는 오가노이드 내부의 점액이 이질적으로 분포되어 있음을 보여주었습니다29. 이러한 이질성으로 인해 점액 분포가 측정에 영향을 미쳤는지 여부(또는 어느 정도)에 영향을 미쳤는지 판단하기가 어려워집니다.

마이크로센서는 고속 및 높은 공간 분해능으로 오가노이드 광내 생리학을 프로파일링할 수 있는 최소 침습적 도구입니다. 이러한 센서는 또한 화학적 구배를 방해하지 않으며 관심 미세 환경의 난류에 최소한으로 민감합니다. 작은 설계는 기준 전극에서 센서 전극을 분리함으로써 가능하며, 표준 실험실 pH 프로브는 이 두 전극을 결합하여 더 큰 크기를 만듭니다. 세포 내 측정을 위한 광학 pH 및O2 나노센서는 Colorado School of Mines의 Cash 그룹에 의해 개발되었으며 마우스 및 생물막 모델 모두에서 대사 산물을 측정하는 데 성공했습니다. 그러나 오가노이드 루멘의 이질성으로 인해 이러한 센서는 해석할 수 없는 결과를 초래할 수 있습니다17. McCracken et al.은 SNARF-5F를 주입하고 실시간 컨포칼 현미경으로 pH에 민감한 염료를 시각화하여 배아 줄기세포 유래 위 오가노이드의 루날 pH를 분석했습니다37. 특히 McCracken이 보고한 측정값은 현재 연구에서 얻은 pH 값과 매우 유사했습니다(그림 2B,C). 우리의 기술은 아마도 생물막 프로파일링에서와 같이 수직 설정이 더 많은 단층 구조에 적용될 수 있을 수 있지만, 이는 전극(44)을 손상시킬 위험을 제기할 수 있다. 향후 연구에는 세포 발달과 관련된 변화를 평가하기 위해 여러 날에 걸쳐 pH를 순차적으로 측정하는 것도 포함될 수 있습니다. 중간 크기의 오가노이드는 일반적으로 프로빙 후 회복 및 치유되기 때문에 이론적으로 배양물의 무균 상태가 유지되는 한 하나의 오가노이드를 여러 번 프로빙할 수 있습니다. 오가노이드 모델의 pH 역학에 대한 이해를 넓혀감에 따라, 복잡하고 역사적으로 접근할 수 없었던 3D 미세환경을 정밀하게 매핑하기 위해서는 공간 분해능이 최우선 과제가 되어야 합니다.

요약하면, 이 프로토콜은 미세조작기 및 실체현미경에 장착된 pH 미세전극을 사용하여 높은 시공간 분해능으로 pH를 정확하게 측정하기 위한 자세한 방법을 제공합니다. 이 방법은 인간 성체 줄기세포 유래 오가노이드로 검증되었으며 고유한 내강을 가진 직경이 200μm 이상인 상피 오가노이드에 적합합니다. 대체 미세전극을 선택함으로써 이 방법을 다른 유형의 오가노이드 및 NO 또는 O2와 같은 대체 화합물의 측정에 쉽게 적용할 수 있을 것으로 예상합니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 Ellen Lauchnor 박사, Phil Stewart 박사 및 Bengisu Kilic의 이전 작업과 O2 마이크로 센서에 대한 도움에 감사드립니다. Andy Sebrell은 오가노이드 배양 및 미세 조작 교육을 제공합니다. Lexi Burcham은 오가노이드 배양, 배지 준비, 데이터 기록 및 조직에 대한 지원을 제공합니다. Susy Kohout 박사는 전기 생리학에 대한 일반적인 조언을 제공합니다. 우리는 이미징에 도움을 준 Heidi Smith 박사에게 감사드리며, National Science Foundation MRI Program (2018562), M.J. Murdock Charitable Trust (202016116), US Department of Defense (77369LSRIP & W911NF1910288) 및 Montana Nanotechnology Facility (NSF Grant ECCS-2025391에 의해 지원되는 NNCI 회원)의 자금 지원으로 지원되는 몬태나 주립 대학의 Biofilm Engineering Bioimaging Facility 센터를 인정합니다.

이 작업을 가능하게 해준 Unisense 팀 전체, 특히 Andrew Cerskus 박사, Laura Woods 박사, Lars Larsen 박사, Tage Dalsgaard 박사, Line Daugaard 박사, Karen Maegaard 박사 및 Mette Gammelgaard 박사에게 특별한 감사를 드립니다. 이 연구를 위한 자금은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 보조금 R01 GM13140801(D.B., R.B.) 및 UL1 TR002319(K.N.L)과 몬태나 주립대학교 연구 및 경제 개발 사무국(D.B.)의 연구 확장상(Research Expansion Award)에서 제공되었습니다. 그림 1A 는 BioRender로 만든 것입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
3 m KClUnisense
5 mL Wobble-not Serological Pipet, 개별 포장, 종이/플라스틱, 백, SterileCellTreat229091B
10 mL Wobble-not Serological Pipet, 개별 포장, 종이/플라스틱, 백, SterileCellTreat229092B
15 mL 원심분리기 튜브 - 폼 랙, SterileCellTreat229412
24웰 조직 배양 플레이트, 멸균CellTreat229124
25 mL 워블-비혈청학적 피펫, 개별 포장, 종이/플라스틱, 백, 멸균CellTreat229093B
35 mm 접시 | No. 1.5 커버슬립 | 20mm 유리 직경 | 코팅되지 않은MatTekP35G-1.5-20-C
50 mL 원심분리기 튜브 - 폼 랙, 멸균CellTreat229422
70% 에탄올BP82031GALBP82031GAL
70 μ m 세포 여과기, 개별 포장, 멸균CellTreat229483 
1,000 &마이크로; L 확장 길이 저보유 피펫 팁, 랙형, 멸균CellTreat229037
Amphotericin B (Fungizone) 솔루션HyClone Laboratories, IncSV30078.01
Biosafety CabinetNuaire NU-425-600Class II Type A/B3
소 혈청 알부민Fisher 생물 시약BP1605-100
세포 회수 용액Corning354253 세포 해리 용액
DMEM/F-12 (Advanced DMEM)Gibco12-491-015
Dulbecco's Modification of Eagles Medium (DMEM)Fisher Scientific15017CV
태아 소 혈청HyClone Laboratories, IncSH30088
G418 황산염Corning30-234-CR
겐타마이신 황산염IBI ScientificIB02030
HEPES, Free AcidCytivaSH30237.01
HP Pavillion 2-in-1 14" 노트북 Intel Core i3HPM03840-001
염산Fisher ScientificA144C-212
인큐베이터Fisher Scientific11676604
iPhone 12 카메라Apple
L-glutamineCytivaSH3003401
대형 Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes 섬세한 작업 와이퍼, 1-플라이Fisher Scientific34133
M 205 FA 실체 현미경Leica
Matrigel 멤브레인 매트릭스354234 CorningCB-40234
MC-1 UniMotor 컨트롤러Unisense
메틸 레드
MM33 MicromanipulatorMarzhauser Wetzlar61-42-113-0000오른손잡이
MS-15 전동 스테이지Unisense
Nanoject-IIDrummond3-000-204나노리터 자동주사기
페니실린/스트렙토마이신(10,000 U/mL)Gibco15-140-148
pH 미세전극Unisense50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160SensorTrace 소프트웨어는 Apple 컴퓨터와 호환되지 않습니다
참조 전극UnisenseREF-RM-001652SensorTrace 소프트웨어는 다음과 호환되지 않습니다. 애플 컴퓨터
SB 431542Tocris Bioscience16-141-0
스마트폰 카메라 어댑터Gosky
사양 실험실 스탠드 LSUnisenseLS-009238
트립신-EDTA 0.025%, 페놀 레드Gibco25-200-056
UniAmpUnisense11632
United Biosystems Inc  MINI CELL SCRAPERS 200/PKFisherMCS-200
Y-27632 dihydrochlorideTocris Bioscience12-541-0
µ 센서 교정 키트Unisense/ Mettler Toledo51-305-070, 51-302-069pH 4.01 및 9.21, 20 mL 패킷
.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, N., et al. Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry. GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).
  2. Sato, T., et al. Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  4. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems. Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).
  5. Achberger, K., et al. Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform. Elife. 8, e46188(2019).
  6. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  7. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).
  8. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  9. Davies, J. A. Organoids and Mini-organs. Davies, J. A., Lawrence, M. L. , Academic Press. Ch. 1-2 3-40 (2018).
  10. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS One. 15 (4), e0231423(2020).
  11. Williams, S. E., Turnberg, L. A. Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier. Gut. 22 (2), 94-96 (1981).
  12. Schubert, M. L. Gastric secretion. Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).
  13. Celli, J. P., et al. Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition. Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).
  14. Takeshita, Y., et al. Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater. Marine Chemistry. 223, 103801(2020).
  15. Mccracken, K. W., et al. Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  16. Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing. Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).
  17. Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).
  18. Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids. ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).
  19. pH and reference electrode manual. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf (2023).
  20. Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms. PLoS One. 11 (2), 0149096(2016).
  21. Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).
  22. Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp. Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).
  23. Kolpen, M., et al. Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection. PLoS One. 9 (1), 84353(2014).
  24. Murphy, K. C., et al. Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids. J R Soc Interface. 14 (127), 20160851(2017).
  25. Sebrell, T. A., et al. A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), e153 157-171 (2019).
  26. Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).
  27. Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research. J Vis Exp. (194), e65219(2023).
  28. Cherne, M. D., et al. A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells. Front Pharmacol. 12, 707891(2021).
  29. Sebrell, T. A., et al. Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events. Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).
  30. Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf (2023).
  31. Microprofiling system user manual. Unisense. , Available from: https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf (2023).
  32. Wolffling, S., et al. Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands. Gastroenterology. 161 (2), e616 623-636 (2021).
  33. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  34. Mccracken, K. W., et al. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).
  35. Schumacher, M. A., et al. The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology. J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).
  36. Unisense. , Available from: https://unisense.com/products/ph-microelectrode/ (2024).
  37. Mccracken, K. W., et al. Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans. Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).
  38. Schreiber, S., et al. In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures. Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).
  39. Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).
  40. Gawenis, L. R., et al. Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger. J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).
  41. Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer. Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).
  42. Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses. Redox Biol. 30, 101420(2020).
  43. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).
  44. Guimera, X., et al. A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling. Sensors (Basel). 19 (21), 4747(2019).

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

pHpHpH

관련 논문