A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice(성인 마우스의 망막 색소 상피 세포의 분리 및 배양을 위한 간소화된 방법)

망막 색소 상피(RPE)는 광수용체와 맥락막¹ 사이에 위치한 브루흐 막(Bruch's membrane)을 둘러싸고 있는 특수 세포 단층입니다. RPE 세포는 망막의 적절한 기능에 중요한 역할을 합니다. RPE 세포는 포도당과 비타민 A를 광수용체로 운반하고, all-trans retinal을 11-cis retinal로 재이성질화하여 시력을 촉진하고, 벗겨진 외부 분절의 phagocytosis를 통해 광수용체의 외부 분절을 유지하고, 망막하 공간에서 수분을 제거하고, 긴밀한 접합부의 존재를 통해 외부 혈액-망막 장벽을 형성하고, 신경 영양 성장 인자(예: Pigment Epithelium Derived Factor, 및 Basic Fibroblast Growth Factor)를 지원하여 광수용체를 지원한다². RPE 세포의 기능 장애는 연령 관련 황반 변성, 색소 망막염 및 당뇨병성 망막증을 포함한 다양한 망막병증의 발병에 관여합니다 ^3,4,5. RPE 세포를 사용한 체외 연구는 이러한 질병의 발병 기전에 대한 이해를 높이는 데 매우 중요합니다. RPE 세포주는 쉽게 구할 수 있지만 1차 RPE 세포의 주요 특성이 부족하기 때문에 이러한 연구에서 훨씬 선호됩니다.

다양한 종이 일차 RPE 세포의 공급원으로 활용되어 왔지만, 마우스는 유전자 변형을 사용하여 망막병증의 발병 기전을 이해하는 데 도움이 되는 장점이 있습니다. 설치류로부터 RPE 세포를 분리하기 위한 이전에 설명된 프로토콜은 신생아 동물의 사용을 필요로 하거나, 시간이 오래 걸리거나, 기술적 기술을 요구하거나, 배양에 적합하지 않다 6,7,8,9,10,11,12. 당사는 RPE 세포를 고순도 배양액을 생성하는 성체 마우스에서 RPE 세포를 분리하는 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

이 연구에서 동물 피험자의 사용은 Case Western Reserve University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 시약 준비

1. 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드가 없는 Hank's Balanced Sal 용액(HBSS)에 10mM HEPES 완충 용액을 보충하여 세척 완충 매체를 준비합니다. 사용할 때까지 용액을 4°C에서 유지하십시오.
2. Dulbecco's Modified Eagle's Medium에 4.5g/L 포도당, 1.25x GlutaMAX 보충제(스톡 농도 100x 또는 200mM, 최종 농도 2.5mM L-글루타민), 소 태아 혈청 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, MEM 비필수 아미노산 용액 1개(100x)를 보충하여 RPE 배지를 준비합니다. 사용하기 전에 수조에서 미디어를 37°C로 사전 예열하십시오.

2. 쥐 눈 추출

1. 가급적이면 생후 3주에서 14주 사이의 마우스를 IACUC가 승인한 안락사 방법(이 연구에서는 마우스 20g당 0.1mL의 케타민/자일라진 칵테일[87.5mg/kg 케타민 및 12.5mg/kg 자일라진]을 사용한 마취 하에 자궁경부 탈구)을 사용하여 안락사시킵니다.
   참고: 어린 쥐에서 채취한 눈은 시간이 지남에 따라 망막 색소 상피 세포 수율을 증가시키고 연속적인 통과 능력을 확장합니다.
2. 눈을 위로 향하게 하여 마우스를 옆으로 평평하게 눕힙니다.
3. 검지와 엄지를 각각 눈 위와 아래에 놓습니다. 눈을 둘러싼 뼈 구조에 부드럽게 압력을 가하여 안구의 돌출을 유도합니다.
4. 약간 열린 가위의 끝을 눈 아래에 삽입하고 눈이 소켓에서 분리될 때까지 손목을 눈에서 90° 부드럽게 회전시킵니다.
   알림: 눈이나 시신경을 절단하기 위해 가위를 닫지 마십시오., 아이컵의 해부를 더 어렵게 만들 수 있습니다.
5. 즉시 눈을 70% 에탄올에 넣고 5초 이상 굴린 후 얼음 위에 보관된 세척 완충 매체로 옮깁니다.
6. 해부 현미경으로 한 번에 한쪽 눈을 세척 완충액과 적신 거즈 조각으로 채워진 페트리 접시에 옮깁니다.
7. 핀셋으로 시신경을 잡아 눈을 안정시킵니다. 3.00mm 45° 수술용 칼 또는 0.009인치 면도날을 사용하여 오라 세라타 높이를 부드럽게 절개합니다.
8. Vannas 가위를 사용하여 절개 부위에 가위를 부드럽게 삽입하고 전방분절과 유리체를 제거하고 버릴 수 있을 때까지 ora serrata 둘레를 자릅니다.
9. RPE 층을 방해하지 않도록 주의하면서 끈으로 묶인 집게를 사용하여 아이컵에서 망막을 부드럽게 벗겨냅니다.
   참고: 망막을 더 쉽게 제거하려면 전사 피펫에 세척 버퍼 매체를 채우고 아이컵 가장자리에 조심스럽게 적용하여 망막을 부드럽게 들어 올립니다.
10. 마지막으로 가위를 사용하여 아이컵에서 시신경과 과도한 결합 조직을 제거합니다. 아이컵에 구멍이 뚫리지 않도록 주의하십시오.

3. 기본 RPE 격리

1. 1mL의 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA가 포함된 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 아이컵을 옮깁니다.
   참고: 배양 가능한 RPE의 수율을 높이기 위해 Trypsin-EDTA의 부분 표본 1개에 두 개의 아이컵을 추가할 수 있습니다.
2. 마이크로 원심분리기 튜브를 37°C로 설정된 수조로 옮기고 10분 동안 배양합니다. 2분마다 수조에서 튜브를 제거하고 튜브 바닥을 조리대에 40번 단단히 두드립니다.
3. 10분 후 P1000 또는 2mL 혈청학적 피펫을 사용하여 위아래로 3회 이상 피펫팅하여 아이컵을 기계적으로 부드럽게 파괴합니다.
   알림: 큰 시트는 제대로 접착되지 않으므로 RPE 시트의 단편화가 필수적입니다.
4. 아이컵이 아닌 분리된 RPE 시트를 15mL 원뿔형 튜브에 담긴 0.5mL의 소 태아 혈청(FBS)에 겹쳐 트립신을 즉시 중화시킵니다.
5. 또한 3mL의 RPE 배지를 FBS 및 RPE 시트 층에 적하하여 트립신을 희석합니다.
6. RPE를 340 x g 에서 3분 동안 원심분리합니다.
7. 상층액을 버리고 24웰 플레이트(1.9cm²/웰) 또는 48웰 플레이트(0.75cm²/웰)에 적합한 양의 RPE 매체에 세포를 재현탁시킵니다.
   참고: RPE는 세포외 기질 단백질, 특히 라미닌, 콜라겐 IV 또는 피브로넥틴으로 코팅된 웰 플레이트에 도금하여 부착력을 높일 수 있습니다¹¹. 또한 RPE는 1mL의 RPE 배지에 재현탁하고 40% 밀도 분리 그래디언트에 적층하여 순수 RPE 세포를 추가로 분리할 수 있습니다. 또한, 플레이트를 340 x g 에서 3-5분 동안 회전시키면 세포 접착력이 증가할 수 있다¹³.
8. 37 ° C에서 5 % CO₂ 로 배양합니다.

4. RPE 배양

1. 최소 3일 동안 격리된 RPE를 중단하지 마십시오. 72시간 후 기존 매체를 조심스럽게 제거하고 미리 데워진 새 매체로 교체합니다.
2. 처음 48일 후 3시간마다 매체를 교체하십시오.
3. 세포가 밀도에 도달하면 0.25% 트립신 + 0.02% EDTA를 사용하여 세포를 통과시키고 RPE 배지의 FBS를 2%로 줄입니다.
   참고: 일차 RPE는 이전에 5-7회 통과 후에 역분화를 시작하고 육각형 모양과 색소 침착을 잃기 시작하는 것으로 보고되었다¹⁴.

설명된 프로토콜은 C57BL/6 배경 마우스에 사용되었습니다. 성별은 RPE를 배양하는 능력을 변화시키지 않는 것으로 보인다. 6주 미만의 마우스는 나이가 많은 마우스에 비해 제한된 RPE 시트를 생성하며 최적의 밀도에 도달하기 위해 더 많은 눈이 필요할 수 있습니다. 분리 후 RPE 세포가 안정화되어 세포 배양 플레이트에 부착되는 데 약 3일이 걸립니다. 분리 후 약 24시간이 지나면 무핵세포처럼 보이는 동그랗고 색소가 있는 세포가 가라앉기 시작했지만 플레이트에 완전히 부착되지 않았습니다(그림 1A). 다음 48-72시간 동안 세포는 어두운 색소 침착과 투명한 핵을 유지하면서 부착되고 퍼지기 시작합니다(그림 1B, C). 5일 후, RPE는 밀도가 증가하고 육각형 모양의 편광 단층을 연상시키는 세포 간 접촉을 형성하기 시작했습니다(그림 1D).

분리된 RPE는 배양 6일 후 순도 및 밀착 접합 무결성에 대해 평가되었습니다. RPE는 먼저 RPE에 특이적인 마커인 레티노이드 이소메로가수분해효소 또는 망막 색소 상피 65kDA 단백질(RPE65)의 존재에 대해 평가되었습니다(그림 2, 녹색). 또한 RPE가 착색된 육각형 세포의 단일 층을 형성하려면 세포 간 접합부가 손상되지 않은 상태로 유지되어야 합니다. 밀착 접합 단백질-1 또는 조눌라 폐색-1(zonula occludens-1, ZO-1)은 개별 RPE 세포 사이의 밀착 접합부의 유지 및 무결성에 필수적인 스캐폴딩 단백질이다14. Confluent isolated RPE 배양은 세포 주변부에서 발견되는 ZO-1의 염색으로 입증된 세포 간 접합 단백질을 유지했습니다(그림 2, 빨간색). 이러한 세포가 큰 시트에서 밀도에 도달하면 최대 2주 동안 과도하게 성장하지 않고 세포 간 접촉을 유지합니다. 이전 연구에 따르면 ZO-1은 배양에서 최대 9일 동안 높게 발현되는 것으로 나타났습니다15. 일차 RPE 배양에 사용되는 추가 마커에는 콜라겐 IV, CRALBP 및 OTX211이 포함됩니다.

그림 1. 표준 폴리스티렌 24웰 플레이트에서 배양된 마우스 1차 RPE의 형태. (A) C57BL/6 마우스의 양쪽 눈에서 분리하고 분리 직후 비코팅 조직 배양 폴리스티렌 24웰 플레이트의 단일 웰에서 배양한 1차 RPE. (나,씨) 48시간 및 72시간 후, 일차 RPE는 플레이트에 부착되기 시작하고 색소가 있는 이핵 세포를 형성합니다. (D) 5일 후, 명시야 현미경 검사는 과색소가 함유된 육각형 모양의 세포가 밀도를 높이고 세포 간 접촉을 형성하기 시작하는 것을 보여줍니다. 눈금 막대: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2. RPE 특이적 마커인 RPE-65 및 세포간 접합 마커인 ZO-1은 분리된 원발성 쥐 RPE에서 보존됩니다. 3마리의 C57BL/6 마우스로부터의 1차 RPE를 4% 파라포름알데히드로 고정하기 전에 6일 동안 배양하였다. 세포를 PBS에서 0.1% Triton-X로 5분 동안 투과시키고, 5% 정상 염소 혈청으로 차단하고, RPE-65(녹색) 또는 ZO-1(빨간색)에 대한 항체로 배양했습니다. 눈금 막대: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. 망막 색소 상피 분리 프로토콜의 단순화된 개략 도. 마우스에서 안구를 제거한 후 세척 버퍼로 이동하기 전에 70% 에탄올에 잠시 담가 눈을 살균합니다. 세척 버퍼에서 ora serrata를 따라 자르고 앞쪽 부분을 제거합니다. 망막을 제거하고 트립신/EDTA가 있는 튜브에 아이컵을 넣습니다. 총 10분 동안 2분마다 카운터의 튜브를 부드럽게 두드리고 상층액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 RPE의 펠릿을 원심분리합니다. 셀과 플레이트를 24웰 또는 48웰 플레이트에 재현탁합니다. BioRender를 사용하여 생성된 그래픽. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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