방법 논문

Preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells (마우스 흉선 상피 세포의 단세포 현탁액 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색)

DOI:

10.3791/66945

⸱

2024년 7월 26일

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1Thymus Biology Section, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Flow Cytometry Facility, Experimental Immunology Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 마우스 흉선 상피 세포의 단일 세포 현탁액 준비 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색을 위한 프로토콜을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

흉선 상피 세포(TEC)는 T 세포의 발달 및 레퍼토리 선택을 촉진하는 데 필수적인 역할을 합니다. 흉선 피질의 피질 TEC(cTEC)은 조기 T 세포 발달과 피질 흉선 세포의 양성 선택을 유도합니다. 대조적으로, 흉선 수질의 수질 TEX(mTEC)는 피질에서 긍정적으로 선택된 흉선세포를 끌어당겨 T 세포에서 자기 내성을 확립합니다. cTEC으로 발현되는 DLL4 및 beta5t, mTEC로 발현되는 Aire 및 CCL21을 포함한 다양한 분자는 T 세포 발달 및 선택을 지원하는 흉선 기능에 기여합니다. cTECs 및 mTECs에서 기능적으로 관련된 분자의 유세포 분석은 TEC의 생물학에 대한 이해를 향상시키는 데 유용하지만, TEC의 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 현재의 방법은 젊은 성인 마우스 흉선에서 TEC의 작은 부분(cTEC의 경우 약 1%, mTEC의 경우 약 10%)만 회수할 수 있습니다. TEC에서 이러한 기능적으로 관련된 분자 중 다수는 세포 내에 국한되어 있기 때문에 마우스 TEC의 단일 세포 현탁액 준비 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

흉선은 T 림프구의 발달 및 레퍼토리 선택을 촉진하는 상피 중간엽 기관입니다. 흉선 내의 피질 및 수질 미세환경에서 흉선 상피 세포(TEC)는 T 세포 발달 및 선택을 지시하는 데 중요한 역할을 합니다. 흉선 피질의 피질 TEC(cTEC)는 주로 초기 T 세포 발달 유도와 새로 생성된 T 세포 항원 수용체(TCR) 발현 흉선세포의 양성 선택에 기여한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 대조적으로, 흉선 수질의 수질 TEX(mTEC)는 피질에서 긍정적으로 선택된 흉선세포를 끌어당기고 자가 반응성 T 세포를 제거하고 조절 T 세포를 생성함으로써 중앙 자기 내성을 확립하는 데 필수적입니다1,2. T 세포 발달 및 선택을 지원하는 TEC의 이러한 기능은 cTEC 및 mTEC에서 발현되는 다양한 분자를 통해 매개됩니다.

여기에는 림프 전구 세포의 T 세포 계통 사양에 중요한 델타 유사 리간드 4(DLL4)가 포함됨)3,4, beta5t(Psmb11이라고도 함, CD8 T 세포의 양성 선택에 중요)5,6 및 Prss16(흉선 특이적 세린 프로테아제 또는 TSSP, CD4 T 세포의 양성 선택에 중요)7,cTEC으로 발현되는 8 및 자가면역 조절자(Aire, 자가 유전자의 난잡한 발현에 중요)9,10, Fez family zinc finger 2 (Fezf2, Aire 독립 자가 유전자의 난잡한 발현 및 흉선 다발 세포 생성에 중요)11,12,13,14, 및 C-C 모티프 케모카인 리간드 21 (CCL21, 골수 이동 및 양성 선택된 흉선세포의 축적에 중요)14,15,16은 mTEC로 표현됩니다. 유세포 분석은 TEC에서 기능적으로 중요한 분자를 정량적으로 검출하는 수단을 제공하여 cTEC 및 mTEC의 발달 및 기능을 모두 평가할 수 있도록 합니다. TEC의 많은 분자는 주로 세포질(예: 프로테아솜 성분 beta5t) 및 핵(예: 전사 조절자 Aire)과 같은 세포 내에서 발현되기 때문에 유세포 분석을 사용하여 cTEC 및 mTEC의 세포 내 분자를 정량적으로 분석하는 것이 유리합니다.

TECs는 흉선에서 드뭅니다. 생후 5주 된 암컷 마우스는 약 1 × 106 cTEC와 약 2.5 × 106 mTEC를 가지고 있는 반면, 흉선 피질은 약 3 × 108 CD4+CD8+ 흉선 세포를 포함하고 흉선 수질은 약 5 × 107 CD4+CD8- 및 CD4-CD8+ 흉선세포를 포함합니다17. 그러므로, 흉선에 있는 세포의 대다수(>99%)는 젊은 성체 마우스의 TEC가 아니라 흉선세포를 포함한 조혈 세포입니다. 더욱이, TEC는 흉선 내의 인접 세포(예: 흉선세포) 및 구조적 세포외 구성 요소(예: 콜라겐)와 밀접하게 연관되어 있으므로 TEC가 세포 현탁액으로 방출되려면 흉선의 프로테아제 소화가 필요합니다. 효소 분해를 위한 기존의 방법은 TEC의 작은 부분만 산출합니다. 5주 된 생후 마우스 thymus17,18,에서 cTEC와 mTEC의 경우 각각 약 1%(1 ×10 4) 및 10%(2 × 105). 흉선에서 TEC가 방출되는 효율이 낮은 것은 단백질 분해 효소 및 기계적 스트레스에 대한 TEC의 민감성과 TEC와 인접 세포, 특히 cTEC와 CD4+CD8+ thymocytes20 사이의 긴밀한 연관 때문일 수 있습니다. 이와 관련하여, 현재의 효소 분해 매개 세포 전처리 방법을 기반으로 한 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 염기서열분석 분석을 포함한 마우스 TEC의 단일 세포 분석 결과는 TEC의 극히 일부만을 대표하므로 포괄적이지 않습니다. 그럼에도 불구하고, TEC의 효소 검색에 대한 이러한 한계에도 불구하고, 단일 세포 현탁액에서 마우스 TEC의 유세포 분석은 cTEC 및 mTEC에서 기능적으로 관련된 분자의 정량 분석에 여전히 유용합니다. 세포 현탁액에서 TEC는 상피 표면 분자 EpCAM(CD326)에 대해 양성이고 조혈 표면 분자 CD45에 대해 음성인 세포로 정의되었습니다. EpCAM+CD45-TEC 내에서 Ly51 분자(BP-1 및 CD249라고도 함) 및 Ulex Europaeus agglutinin I(UEA1) 결합 용량(주로 α 결합 푸코스를 포함하는 당단백질 및 당지질에 결합)의 세포 표면 발현 수준은 cTECs(Ly51높음,UEA1 낮음) 및 mTEC(Ly51,낮음, UEA1높음, 높음)를 표현형으로 표시하는 데 사용되었습니다). 여기에서는 마우스 TEC의 단일 세포 현탁액의 기존 준비 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색을 위한 실험 프로토콜에 대해 설명하며, 새로 준비된 마우스 TEC에서 세포 내 분자 beta5t, CCL21 및 Aire의 정량 분석에 중점을 둡니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 마우스 실험은 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인 하에 수행되었습니다(ASP21-431, ASP21-432 및 EIB-076-3).

1. 흉선 세포 현탁액의 준비

참고: 마우스 온토제니(ontogeny)는 흉선으로부터 TEC의 효소 방출 효율에 영향을 미칩니다. 마우스 사용 기간에 따른 세 가지 방법을 다음과 같이 설명합니다.

  1. 생후 3주 이상 된 산후 마우스의 경우
    1. 한 마리의 쥐에서 흉선(흉선 엽 2개)을 수확합니다. 얼음 위에 60mm 플라스틱 접시에 10mM HEPES가 함유된 5mL의 RPMI1640에 흉선을 놓습니다.
    2. 해부 현미경으로 구부러진 미세 끝 핀셋으로 혈액, 흉선이 아닌 조직 및 지방을 제거합니다. 해부 가위로 흉선을 작은 조각(약 1-2mm 크기)으로 자릅니다.
    3. 흉선 조각을 1mg/mL 콜라겐분해효소/디스파제 3mL와 2% 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 RPMI1640 1U/mL DNase 용액 1mL가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 37°C의 수조 또는 가열 블록에서 20분 동안 배양합니다.
    4. 3mL 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 조직 조각이 여전히 보이는 경우 20분 더 배양합니다.
    5. 3mL 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 조직 조각이 여전히 보이는 경우 10분 더 배양합니다.
    6. 3mL 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 1% FBS를 함유한 1x HBSS에 5mM EDTA 5mL를 추가합니다.
    7. 60μm 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 여과하여 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 세포 현탁액을 350 × g에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.
    8. 세포 펠렛을 10mL의 FACS 완충액(1% 소 혈청 알부민[BSA] 및 0.1% NaN3을 함유하는 1x HBSS)에 재현탁합니다.
    9. 세포를 얼음 위에 저장하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
  2. 생후 1주에서 2주 사이의 신생아 마우스용
    1. 1.1.1단계를 수행합니다.
    2. 해부 현미경으로 해부 핀셋으로 혈액과 흉선이 아닌 조직을 제거합니다. 흉선을 10mM HEPES가 있는 RPMI1640 200μL가 들어 있는 1.5mL 플라스틱 튜브로 옮기고 해부 가위로 흉선을 작은 조각(약 1-2mm 크기)으로 자릅니다.
    3. 흉선 조각이 튜브 바닥에 가라앉도록 한 다음 200μL 마이크로피펫으로 현탁액을 부드럽게 제거합니다.
    4. 흉선 조각을 2mL의 0.5mg/mL 콜라겐분해효소/디스파아제와 2% FBS가 함유된 RPMI1640 1U/mL DNase 용액이 들어 있는 5mL 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브로 옮깁니다. 37°C의 수조 또는 열 블록에서 10분 동안 배양합니다.
    5. 3mL 플라스틱 전사 피펫을 사용하여 부드럽게 혼합한 다음 추가 균질화를 위해 플라스틱 팁이 장착된 1mL 마이크로피펫으로 혼합합니다.
    6. 1% FBS를 함유한 1x HBSS에 5mM EDTA 2mL를 첨가합니다. 60μm 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브로 여과합니다. 10mM HEPES를 함유한 RPMI1640 16mL를 추가합니다.
    7. 세포 현탁액 350 × g을 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 10mL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
    8. 얼음 위에 세포를 저장하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
  3. 최대 1주일 된 배아 마우스 및 신생아 마우스의 경우
    1. 한 마리의 쥐에서 흉선(흉선 엽 2개)을 수확합니다. 흉선을 60mm 플라스틱 접시에 넣고 해부 현미경으로 구부러진 핀셋으로 혈액, 흉선이 아닌 조직 및 지방을 제거합니다.
    2. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 10mM HEPES가 포함된 0.2mL의 RPMI1640에 흉선을 놓습니다. 200μL 마이크로피펫으로 액체를 폐기합니다.
    3. 2% FBS가 포함된 RPMI1640에 0.5mg/mL 콜라겐분해효소/디스파아제 0.5mL와 1U/mL DNase 용액을 추가합니다. 37°C의 수조 또는 열 블록에서 10분 동안 배양합니다. 플라스틱 팁이 있는 1mL 마이크로피펫을 사용하여 부드럽게 섞습니다.
    4. 1% FBS를 함유하는 1x HBSS에 0.5mL의 5mM EDTA를 첨가합니다. 60μm 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 여과하여 새로운 15mL 코니컬 튜브에 넣습니다. 10mM HEPES를 함유 한 RPMI1640 9mL를 첨가하십시오.
    5. 세포 현탁액을 350 × g, 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 세포 펠렛을 1-3mL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
    6. 얼음 위에 세포를 저장하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
  4. 대체 방법: 리베라제 분해
    1. 1.1.1 및 1.1.2단계를 수행합니다.
    2. 흉선 조각이 튜브 바닥에 가라앉도록 한 다음 200μL 마이크로피펫으로 현탁액을 부드럽게 제거합니다. 흉선 조각을 1mL의 0.5 U/mL 리베라아제와 10 mM HEPES를 함유한 RPMI1640 1 U/mL DNase가 함유된 5 mL 튜브로 옮깁니다. 37 ° C의 수조 또는 열 블록에서 15 분 동안 배양하십시오.
    3. 플라스틱 팁이 있는 1mL 마이크로피펫을 사용하여 부드럽게 섞습니다. 조직 조각이 여전히 보이는 경우 15분 더 배양합니다.
    4. 플라스틱 팁이 있는 1mL 마이크로피펫을 사용하여 부드럽게 섞습니다. 1% FBS를 함유한 1x HBSS에 5mM EDTA 1mL를 추가합니다.
    5. 60μm 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 여과하여 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 10mM HEPES를 함유 한 RPMI1640 18mL를 첨가하십시오.
    6. 세포 현탁액을 350 × g, 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하고 10mL의 FACS 완충액 (1 % BSA 및 0.1 % NaN3 를 함유 한 1x HBSS)에 세포를 재현탁시킵니다.
    7. 얼음 위에 세포를 저장하고 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 결정합니다.

2. 흉선 세포의 항체 염색

  1. 16 × 106 셀을 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 넣습니다. 350 × g에서 4 °C에서 5 분 동안 세포를 원심 분리합니다. 상등액을 버리십시오.
  2. FACS 완충액에 10μL의 작업 농도의 항-Fc 수용체 단클론 항체(mAb, 클론 2.4G2)를 추가하여 세포 표면 Fc 수용체에 대한 염색 IgG의 비특이적 결합을 차단합니다. 4 °C에서 5 분 동안 배양하십시오.
  3. 항-CD45 mAb (조혈 세포 특이적 ; 예: BV421 표지), 항-EpCAM mAb (상피 세포 특이적 ; 예: PE-Cy7 표지), anti-Ly51 mAb (cTEC 검출, 예: AF647 표지) 및 Ulex europaeus agglutinin I (UEA-1) (mTEC 검출, 예: AF594 표지)의 작업 농도를 각각 40 μL씩 추가하십시오. 이와 병행하여, 유세포 분석기를 설정하기 위해 단색 염색 세포와 염색되지 않은 세포를 위한 튜브를 준비합니다.
  4. 4°C에서 45분 동안 배양합니다. 10분마다 잘 섞습니다. 2mL의 FACS 버퍼를 추가합니다.
  5. 원심분리기 셀 350 × g, 4°C에서 5분 동안 상층액을 폐기합니다.
  6. 1 μL의 Ghost Dye Violet 510을 추가합니다(고정 및 투과성 세포의 유세포 분석에서 생존 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해). 희석되지 않은 Ghost Dye 시약을 사용하십시오. 잘 섞는다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 10분마다 잘 섞습니다.
  7. FACS 버퍼 2mL를 추가합니다. 원심분리기 셀 350 × g, 4°C에서 5분 동안 상등액을 버리십시오.
  8. PBS에 1mL의 2% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하고 실온에서 10분 동안 배양하여 세포를 고정합니다.
  9. 튜브에 PBS 3.5mL를 추가하고 4°C에서 8분 동안 700×g의 세포를 원심분리 합니다. 상층액을 버립니다.
  10. Intracellular Fixation/Permeabilization Buffer 1mL를 첨가하고 4°C에서 20분 동안 배양하여 세포를 투과합니다.
  11. 세포를 700 × g에서 4 ° C에서 8 분 동안 원심 분리하고 상층액을 버립니다.
  12. 1x 투과화 완충액 1mL를 추가합니다. 700 × g에서 4°C에서 8분 동안 셀을 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
  13. 1x 투과화 완충액에 항-베타5t 항체 또는 항-CCL21 항체의 작동 농도 각각 100μL 또는 항-에어 항체(예: AF488 표지)의 작동 농도 40μL를 추가하고 잘 혼합한 후 실온에서 60분 동안 배양합니다.
  14. 1x 투과화 완충액 1mL를 추가합니다. 700 × g에서 4°C에서 8분 동안 셀을 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
  15. 2.14단계를 반복합니다.
  16. 100μL의 작업 농도의 항토끼 IgG(예: AF555 라벨)를 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  17. 1x 투과화 완충액 1mL를 추가합니다. 700 × g에서 4°C에서 8분 동안 셀을 원심분리합니다. 상등액을 버리십시오.
  18. 200μL의 FACS Buffer에 세포를 재현탁시키고 잘 혼합합니다.
  19. 유세포 분석이 이루어질 때까지 4°C의 어두운 곳에 세포를 보관합니다.
  20. 유세포 분석 전에 60μm 나일론 메쉬를 통해 세포를 필터링합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

분석을 위해서는 최소 6개의 형광 채널(CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye 및 beta5t, CCL21 및/또는 Aire)과 전방 및 측면 산란 파라미터를 검출할 수 있는 유세포 분석기가 필요합니다. 0일 된 마우스와 2주 된 마우스의 콜라겐 분해 효소/디스파제 소화 흉선 세포의 대표적인 유세포 분석 프로파일은 각각 그림 1 및 그림 2에 나와 있습니다. 두 그림 모두에서 패널 A의 점도표는 총 미립자 신호의 전방 산란(FSC) 강도와 Ghost Dye Violet 510 형광 강도를 보여줍니다. 미립자 신호의 90% 이상이 Ghost Dye 시약에 의한 음성 염색 및 세포 크기를 반영하는 전방 산란으로 판단되는 생존 가능한 세포를 나타냅니다. 패널 B는 조혈 세포에 의해 발현되는 분자인 CD45와 상피 세포에 의해 발현되는 분자인 EpCAM에 대한 생존 가능한 흉선 세포의 세포 표면 형광 신호를 보여줍니다. 작지만 독특한 세포 집단은 CD45-EpCAM+이므로 TEC를 나타냅니다.

figure-results-1
그림 1: 생후 0일 된 야생형 C57BL/6 배경 마우스의 콜라겐분해효소/디스파제 분해 흉선 세포의 대표적인 유세포 분석 프로파일.(A) 총 미립자 신호의 전방 산란 강도 및 Ghost Dye Violet 510 형광 강도. 빨간색 상자는 생존 가능한 세포의 신호를 나타냅니다. (B) CD45 및 EpCAM에 대한 생존 세포(패널 A의 빨간색 상자)의 형광 신호. 빨간색 상자는 CD45-EpCAM+ TEC를 나타냅니다. (C) TEC의 Ly51 및 UEA1 세포 표면 염색 신호(패널 B의 빨간색 상자)는 두 가지 주요 집단, 즉 cTEC가 풍부한 Ly51높은 UEA1낮은 세포와 mTEC가 풍부한 Ly51낮은 UEA1높은 세포를 나타냅니다. (D-F) 패널 C에 정의된 대로 cTEC(상단 패널) 및 mTEC(하단 패널)에서 (D) beta5t, (E) CCL21 및 (F) Aire를 감지합니다. 회색 히스토그램은 (D,E) 2차 항체로만 염색된 대조군 프로필과 Aire가 결핍된 마우스의 세포를 사용하여 (F)로 염색된 대조군 프로파일을 보여줍니다. 약어: FSC = 전방 산란; TECs = 흉선 상피 세포; cTECs = 피질 TECs; mTEC = 수질 TECs. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 생후 2주 된 야생형 C57BL/6 배경 마우스의 콜라겐분해효소/디스파제 분해 흉선 세포의 대표적인 유세포 분석 프로파일.(A) 총 미립자 신호의 전방 산란 강도 및 Ghost Dye Violet 510 형광 강도. 빨간색 상자는 생존 가능한 세포의 신호를 나타냅니다. (B) CD45 및 EpCAM에 대한 생존 세포(패널 A의 빨간색 상자)의 형광 신호. 빨간색 상자는 CD45-EpCAM+ TEC를 나타냅니다. (C) TEC의 Ly51 및 UEA1 세포 표면 염색 신호(패널 B의 빨간색 상자)는 두 가지 주요 집단, 즉 cTEC가 풍부한 Ly51높은 UEA1낮은 세포와 mTEC가 풍부한 Ly51낮은 UEA1높은 세포를 나타냅니다. (D-F) 패널 C에 정의된 대로 cTEC(상단 패널) 및 mTEC(하단 패널)에서 (D) beta5t, (E) CCL21 및 (F) Aire를 감지합니다. 회색 히스토그램은 (D,E) 2차 항체로만 염색되고 (F) FITC 표지 동형과 일치하는 IgG로 염색된 대조군 프로파일을 보여줍니다. 약어: FSC = 전방 산란; TECs = 흉선 상피 세포; cTECs = 피질 TECs; mTECs = 수질 TECs; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

패널 C에서 볼 수 있듯이

Ly51 및 UEA1 세포 표면 염색 신호는 TEC에서 두 가지 주요 집단을 나타냅니다. Ly51에서 상대적으로 높고 UEA1에서 낮은 집단은 cTEC로 강화되었으며, Ly51에서 상대적으로 낮고 UEA1에서 높은 또 다른 집단은 mTEC로 강화되었습니다21,22,23,24,25. 생후 0일을 포함한 배아 및 신생아 단계에서 cTEC의 빈도는 mTEC의 빈도보다 큽니다. 출생 후 단계에서는 흉선에서 cTEC의 방출 효율이 극도로 낮아지기 때문에(cTEC의 약 1%와 mTEC의 10%가 단일 세포 현탁액으로 회수될 수 있음) mTEC의 빈도가 우세합니다)17.

세포의 고정 및 투과화는 TEC 내에서 세포 내 분자를 검출할 수 있도록 합니다. 패널 D는 대부분의 cTEC에서 검출된 beta5t 발현을 보여주지만 mTEC에서는 검출되지 않습니다. 패널 E는 cTEC가 아닌 mTEC의 일부에서 CCL21의 검출을 보여주고, 패널 F는 mTEC의 하위 모집단에서 발현된 Aire를 보여줍니다.

beta5tsup class="xref">6,20, CCL2114,16,26 및 Aire27,28 및 케라틴을 포함한 추가 세포 내 분자에 대해 발표된 논문에서 찾을 수 있습니다.22,29 및 Fezf211,30.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dispase가 있거나 없는 콜라게나제는 마우스 흉선을 소화하여 TEC 4,5,9,18,21을 제조하는 데 널리 사용됩니다. 콜라게나제를 포함한 프로테아제의 혼합물을 포함하는 리베라아제는 또한 흉선을 소화하여 TEC17,22를 제조하는 데 사용됩니다. 콜라게나제와 리베라아제를 사용하면 마우스 흉선에서 cTEC 및 mTEC의 수율과 품질이 본질적으로 동등하지만 효소의 제품 배치에 따라 약간의 차이가 나타날 수 있습니다. 트립신은 또한 효율적인 흉선 소화를 위해 사용되지만21,23, TEC에 의해 발현되는 EpCAM 및 CD80을 포함한 많은 세포 표면 분자는 트립신 소화에 민감한 것으로 나타났습니다21. 흉선의 효소 소화를 위해 손상된 세포에서 DNA 방출로 인해 점도를 낮추기 위해 DNase가 종종 첨가됩니다17,21.

흉선의 효소 소화는 흉선에서 TEC를 방출하는 데 필수적입니다. 흉선은 조직 조각이 보이지 않고 세포 현탁액이 균질하게 나타날 때까지 충분히 소화되어야 합니다. 그러나 과도한 효소 처리는 세포를 손상시키고 세포 생존력을 감소시키기 때문에 소화를 너무 오래 방치해서는 안 됩니다. 모든 실험에서 흉선 소화 중 잠복기와 피펫팅 강도에 세심한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 현재의 효소 분해 기술은 서론에 자세히 설명되어있고 이전에 보고된 바와 같이 TEC의 작은 부분만 방출할 수 있다는 점을 인식하는 것도 중요합니다.

TEC는 총 흉선 세포 현탁액에서 드물기 때문에 총 흉선 세포 현탁액을 사용한 TEC의 유세포 분석을 위해서는 일반적으로 측정당 8 × 106 내지 16 106 세포× 많은 세포의 염색이 필요합니다.

효소 소화된 흉선 세포로부터 유래된 TEC는 항-CD45 마그네틱 비드(22 ) 및/또는 Percoll 밀도 구배 원심분리(31)를 사용하여 농축될 수 있다. 이러한 농축 절차는 특히 TEC가 이후에 유세포 분석 세포 분류기를 통해 정제될 때 시간을 절약해 줍니다. 또한 항-CD45 농축은 CD45-발현 흉선세포20 과 밀접하게 연관된 TEC의 하위 집단을 제거하고 Percoll 원심분리는 예기치 않게 조밀한 TEC 하위 집단을 제거할 수 있다는 점에 유의해야 합니다.

TEC의 고정과 관련하여 PFA 처리는 유세포 분석에서 세포를 축소시키고 전방 산란 강도를 감소시키는 것으로 알려져 있습니다. 2% PFA를 첨가한 직후 세포를 부드럽게 피펫팅하고 PBS를 첨가하면 과도한 세포 수축을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다.

유세포 분석의 경우, 흉선 내에서 TEC가 드물게 발생한다는 점을 감안할 때 TEC의 묘사에는 흉선세포 또는 비장세포와 비교하여 뚜렷한 접근 방식이 필요합니다. 초기 분류는 흉선세포 및 수지상 세포 및 대식세포를 포함한 기타 조혈 세포에 유비쿼터스한 조혈 범 마커인 CD45의 활용에 근거합니다. 반대로, 기원이 비조혈인 TEC는 CD45 발현이 부족합니다. 대신 TEC는 표면에서 EpCAM을 발현하므로 CD45 음성 및 EpCAM 양성의 간단한 게이팅 전략을 통해 TEC를 식별할 수 있습니다. 유세포 분석에서는 이 모집단을 정의하는 것으로 시작하여 TEC와 흉선세포 사이의 상당한 크기 불일치와 TEC의 큰 크기와 높은 자가형광을 감안할 때 전방 및 측면 산란 매개변수의 적절한 스케일링을 보장합니다.

그 후, CD45 음성 EPCAM 양성 집단 내에서 cTEC 및 mTEC 마커의 평가에 관심이 집중됩니다. 이 모집단의 크기가 작기 때문에 이 단계는 cTEC 및 mTEC를 보상하는 데 필수적입니다. 모든 염색 패널(예: tec 정의 CD45 및 EpCAM과 함께 cTEC-마커 Ly51 및 mTEC-마커 UEA-1)의 검사는 산란 스케일링의 적절성을 추가로 보장합니다. 유세포 분석 설정 중에 우리의 주요 목표는 각 항체에 대한 양성 및 음성 집단을 식별하는 것입니다.

Aire, beta5t 및 CCL21의 공동 염색에서 TEC 하위 집합 내의 별개의 집단이 확인됩니다. mTEC에 의한 Aire의 선택적 발현을 감안할 때, 우리는 CD45 음성/EPCAM 양성/UEA-1 양성/Ly51 음성 세포의 4색 염색에 초점을 맞춥니다. 여기서, UEA-1 양성 세포는 Aire에 대한 음성 대조군을 확립하는 데 활용되어 Aire 양성 세포의 명확한 식별을 용이하게 합니다. mTEC 내에서 표현되는 CCL21에도 유사한 접근 방식이 채택됩니다. 반대로, cTEC에 의해서만 발현되는 베타5t의 경우, 베타5t에 대한 배경 수준을 확인하기 위해 4색 염색 내의 Ly51 양성 세포에 중점을 두고 유사한 게이팅 전략이 적용됩니다. 항-베타5t로 염색된 샘플의 후속 분석은 양성 모집단의 식별을 용이하게 합니다.

항-베타5t 항체와 항-CCL21 항체는 토끼 항체이므로 사전 형광 표지 없이 혼합해서는 안 됩니다. 항체의 작동 농도는 항체의 연속 희석으로 염색된 대조군 세포(예: 야생형 및 녹아웃 마우스의 TEC)의 유세포 분석을 수행하여 미리 결정되어야 합니다.

유세포 분석에서 cTEC 및 mTEC는 cTEC의 경우 Ly51 또는 CD205, mTEC의 경우 UEA1 및 CD80의 세포 표면 발현에 의해 정의되는 경우가 많습니다. 그러나 cTEC와 mTEC는 궁극적으로 흉선의 미세해부학적 국소화에 의해 정의되어야 한다는 점을 명심해야 합니다. 배아 흉선에서 Ly51 및 CD205의 발현이 cTEC에 국한되지 않고 cTEC/mTEC 이능 전구 세포 및 미성숙 mTEC를 포함한 다른 TEC 집단으로 확장된다는 새로운 증거가 있습니다32,33. 또한, cTEC에서의 Ly51 발현은 그림 1 및 그림 2에 표시된 바와 같이 출생 후기간 33에 비해 배아 발생 및 주산기 동안 낮게 유지됩니다.

결론적으로, TEC의 효소적으로 방출된 단일 세포 현탁액의 유세포 분석 분석은 TEC 방출의 제한된 효율성에도 불구하고 단일 세포 분해능에서 TEC 및 그 하위 집단의 정량 분석을 위한 강력한 기술을 제공합니다. 특히, 단일 세포 TEC 현탁액에서 세포내 분자의 유세포 분석은 TEC 및 그 하위 집단의 발달 및 기능에 중요한 다양한 분자의 발현을 연구하는 데 유용합니다.

공개 사항

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저자에게는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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원고를 읽어주신 오히가시 이즈미 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 미국 국립암연구소(National Cancer Institute) 및 암연구센터(Center for Cancer Research)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program) ZIA BC 011806의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
콜라겐 분해 효소 / 디스 파제 Roche11097113001
Liberase TMRoche5401127001
Foxp3 / 전사 인자 염색 버퍼 세트eBioscience00-5523-00
고스트 염료 바이올렛 510 Tonbo13-0870-T500
BV421 안티 마우스 CD45 단클론 항체, 클론 30-F11BD Horizon563890
Alexa Fluor 647 안티 마우스 Ly51 단일 클론 항체, 클론 6C3BioLegend108312
PE/Cy7 안티 마우스 EpCAM/CD326 클론 항체, 클론 G8.8BioLegend118216
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)Vector 실험실DL-1067-1
Alexa Fluor 488 안티 마우스 Aire 단클론 항체, 클론 5H12eBioscience53-5934-82
안티 마우스 Psmb11 / beta5t 토끼 단일 클론 항체, 클론 CPTC-PSMB11 (마우스) -1NIH NCICPTC-PSMB11 (마우스) -1https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal
안티 마우스 CCL21 / 엑소더스 2 토끼 폴리 클로날 항체Bio-RadAAM27
Alexa Fluor 555 항-토끼 IgG 무거운 사슬 염소 재조합 항체InvitrogenA27039
항-마우스 CD32/CD16 – 정제 (Fc 블록 항체)Leinco TechnologiesC247
나일론 메쉬 60 미크론부품 공급W31436
장비
써모믹서Eppendorf열 블록
셀로미터 자동 2000 세포 생존도 카운터Nexcelom생존 세포 계수
LSRFortessa 세포 분석기BD Biosciences유세포 분석기5 개의 레이저 (355, 408, 488, 595 및 637 nm)
FACSDiva 소프트웨어 버전 9.0.1BD Biosciences유세포 분석
FlowJo 10.9.0BD Biosciences유세포 분석 데이터 분석
항체희석 속도 (작업 농도)희석 버퍼
안티 마우스 CD32 / CD16 – 정제 (Fc 블록 항체)1:40FACS 완충액
BV421 항마우스 CD45 단클론 항체1:25FACS 완충액
PE/Cy7 항마우스 EpCAM/CD326 단클론 항체1:100FACS 완충액
Alexa Fluor 647 항마우스 Ly51 단클론 항체1:100FACS 완충액
DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1)1:400FACS 버퍼
안티 마우스 CCL21 / 엑소더스 2 토끼 폴리 클로날 항체1 : 2001x 투과 버퍼
안티 마우스 Psmb11 / beta5t 토끼 단일 클론 항체, 클론 CPTC-PSMB11 (마우스) -11 : 10001x 투과 화 버퍼
Alexa Fluor 555 안티 토끼 IgG 중쇄 염소 재조합 항체1 : 4001x 투과 버퍼
버퍼10
RPMI1640세포 제제
RPMI1640 2% FBS를 함유세포 제제
FACS 완충액(1% BSA를 함유하는 1x HBSS  및 0.1% 아지드화나트륨)세포 준비 및 항체 염색
% FBS를 함유한 RPMI1640 1mg/ml 콜라겐분해효소효소/디스파아제 및 1U/ml DNase 용액
PBS의 2% PFA세포 고정
용 고정/투과화 완충액(고정/투과화 농축액 1부와 고정/투과화 희석제 3부)세포 고정용
1x 투과화 완충액 (1 부분 10X 농축액과 9 부분 증류수)세포 간 항체 염색을 위해 
기 mM HEPES를 함유하는 목적 용하는 용용 2 PBS의 경우 효소 분해용

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