우리는 마우스 흉선 상피 세포의 단일 세포 현탁액 준비 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색을 위한 프로토콜을 설명합니다.
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방법 논문
Preparation of single-cell suspension of mouse thymic epithelial cells (마우스 흉선 상피 세포의 단세포 현탁액 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색)
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
흉선 상피 세포(TEC)는 T 세포의 발달 및 레퍼토리 선택을 촉진하는 데 필수적인 역할을 합니다. 흉선 피질의 피질 TEC(cTEC)은 조기 T 세포 발달과 피질 흉선 세포의 양성 선택을 유도합니다. 대조적으로, 흉선 수질의 수질 TEX(mTEC)는 피질에서 긍정적으로 선택된 흉선세포를 끌어당겨 T 세포에서 자기 내성을 확립합니다. cTEC으로 발현되는 DLL4 및 beta5t, mTEC로 발현되는 Aire 및 CCL21을 포함한 다양한 분자는 T 세포 발달 및 선택을 지원하는 흉선 기능에 기여합니다. cTECs 및 mTECs에서 기능적으로 관련된 분자의 유세포 분석은 TEC의 생물학에 대한 이해를 향상시키는 데 유용하지만, TEC의 단일 세포 현탁액을 준비하기 위한 현재의 방법은 젊은 성인 마우스 흉선에서 TEC의 작은 부분(cTEC의 경우 약 1%, mTEC의 경우 약 10%)만 회수할 수 있습니다. TEC에서 이러한 기능적으로 관련된 분자 중 다수는 세포 내에 국한되어 있기 때문에 마우스 TEC의 단일 세포 현탁액 준비 및 유세포 분석을 위한 세포 내 분자의 염색을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.
서론
흉선은 T 림프구의 발달 및 레퍼토리 선택을 촉진하는 상피 중간엽 기관입니다. 흉선 내의 피질 및 수질 미세환경에서 흉선 상피 세포(TEC)는 T 세포 발달 및 선택을 지시하는 데 중요한 역할을 합니다. 흉선 피질의 피질 TEC(cTEC)는 주로 초기 T 세포 발달 유도와 새로 생성된 T 세포 항원 수용체(TCR) 발현 흉선세포의 양성 선택에 기여한다는 것은 잘 알려져 있습니다. 대조적으로, 흉선 수질의 수질 TEX(mTEC)는 피질에서 긍정적으로 선택된 흉선세포를 끌어당기고 자가 반응성 T 세포를 제거하고 조절 T 세포를 생성함으로써 중앙 자기 내성을 확립하는 데 필수적입니다1,2. T 세포 발달 및 선택을 지원하는 TEC의 이러한 기능은 cTEC 및 mTEC에서 발현되는 다양한 분자를 통해 매개됩니다.
여기에는 림프 전구 세포의 T 세포 계통 사양에 중요한 델타 유사 리간드 4(DLL4)가 포함됨)3,4, beta5t(Psmb11이라고도 함, CD8 T 세포의 양성 선택에 중요)5....
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프로토콜
모든 마우스 실험은 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)의 승인 하에 수행되었습니다(ASP21-431, ASP21-432 및 EIB-076-3).
1. 흉선 세포 현탁액의 준비
참고: 마우스 온토제니(ontogeny)는 흉선으로부터 TEC의 효소 방출 효율에 영향을 미칩니다. 마우스 사용 기간에 따른 세 가지 방법을 다음과 같이 설명합니다.
- 생후 3주 이상 된 산후 마우스의 경우
- 한 마리의 쥐에서 흉선(흉선 엽 2개)을 수확합니다. 얼음 위에 60mm 플라스틱 접시에 10mM HEPES가 함유된 5mL의 RPMI1640에 흉선을 놓습니다.
- 해부 현미경으로 구부러진 미세 끝 핀셋으로 혈액, 흉선이 아닌 조직 및 지방을 제거합니다. 해부 가위로 흉선을 작은 조각(약 1-2mm 크기)으로 자릅니다.
- 흉선 조각을 1mg/mL 콜라겐분해효소/디스파제 3mL와 2% 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 RPMI1640 1U/mL DNase 용액 1mL가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브....
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결과
분석을 위해서는 최소 6개의 형광 채널(CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye, 그리고 beta5t, CCL21 및/또는 Aire용)과 전방 산란(forward scatter) 및 측방 산란(side scatter) 파라미터의 검출이 가능한 유세포 분석기가 필요합니다. 생후 0일 된 마우스와 2주 된 마우스의 Collagenase/Dispase 처리 흉선 세포에 대한 대표적인 유세포 분석 프로파일이 각각 그림 1과 그림 2에 제시되어 있습니다. 두 그림 모두에서 패널 A의 도트 플롯은 전체 입자 신호의 전방 산란(FSC) 강도와 Ghost Dye Violet 510 형광 강도를 보여줍니다. Ghost Dye 시약의 음성 염색과 세포 크기를 반영하는 전방 산란으로 판단할 때, 입자 신호의 90% 이상이 생존 세포에 해당합니다. 패널 B는 조혈.......
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토론
Dispase가 있거나 없는 콜라게나제는 마우스 흉선을 소화하여 TEC 4,5,9,18,21을 제조하는 데 널리 사용됩니다. 콜라게나제를 포함한 프로테아제의 혼합물을 포함하는 리베라아제는 또한 흉선을 소화하여 TEC17,22를 제조하는 데 사용됩니다. 콜라게나제와 리베라아제를 사용하면 마우스 흉선에서 cTEC 및 mTEC의 수율과 품질이 본질적으로 동등하지만 효소의 제품 배치에 따라 약간의 차이가 나타날 수 있습니다. 트립신은 또한 효율적인 흉선 소화를 위해 사용되지만21,23
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공개 사항
저자에게는 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
원고를 읽어주신 오히가시 이즈미 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health), 미국 국립암연구소(National Cancer Institute) 및 암연구센터(Center for Cancer Research)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program) ZIA BC 011806의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 콜라겐 분해 효소 / 디스 파제 | Roche | 11097113001 | |
| Liberase TM | Roche | 5401127001 | |
| Foxp3 / 전사 인자 염색 버퍼 세트 | eBioscience | 00-5523-00 | |
| 고스트 염료 바이올렛 510 | Tonbo | 13-0870-T500 | |
| BV421 안티 마우스 CD45 단클론 항체, 클론 30-F11 | BD Horizon | 563890 | |
| Alexa Fluor 647 안티 마우스 Ly51 단일 클론 항체, 클론 6C3 | BioLegend | 108312 | |
| PE/Cy7 안티 마우스 EpCAM/CD326 클론 항체, 클론 G8.8 | BioLegend | 118216 | |
| DyLight 594 Ulex Europaeus Agglutinin I (UEA1) | Vector 실험실 | DL-1067-1 | |
| Alexa Fluor 488 안티 마우스 Aire 단클론 항체, 클론 5H12 | eBioscience | 53-5934-82 | |
| 안티 마우스 Psmb11 / beta5t 토끼 단일 클론 항체, 클론 CPTC-PSMB11 (마우스) -1 | NIH NCI | CPTC-PSMB11 (마우스) -1 | https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal |
| 안티 마우스 CCL21 / 엑소더스 2 토끼 폴리 클로날 항체 | Bio-Rad | AAM27 | |
| Alexa Fluor 555 항-토끼 IgG 무거운 사슬 염소 재조합 항체 | Invitrogen | A27039 | |
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| 안티 마우스 CCL21 / 엑소더스 2 토끼 폴리 클로날 항체 | 1 : 200 | 1x 투과 버퍼 | |
| 안티 마우스 Psmb11 / beta5t 토끼 단일 클론 항체, 클론 CPTC-PSMB11 (마우스) -1 | 1 : 1000 | 1x 투과 화 버퍼 | |
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| % FBS를 함유한 RPMI1640 1mg/ml 콜라겐분해효소효소/디스파아제 및 1U/ml DNase 용액 | |||
| PBS의 2% PFA | 세포 고정 | ||
| 용 고정/투과화 완충액(고정/투과화 농축액 1부와 고정/투과화 희석제 3부) | 세포 고정용 | ||
| 1x 투과화 완충액 (1 부분 10X 농축액과 9 부분 증류수) | 세포 간 항체 염색을 위해 |
참고문헌
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).
- Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. Generation of diver....
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재인쇄 및 허가
