Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

요약

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

초록

혈관신생은 종양 성장 또는 신생혈관 안질환을 포함한 신체 내 생리학적 및 병리학적 과정 모두에서 중요한 역할을 합니다. 근본적인 분자 메커니즘에 대한 자세한 이해와 신뢰할 수 있는 스크리닝 모델은 질병을 효과적으로 표적으로 삼고 새로운 치료 옵션을 개발하는 데 필수적입니다. 혈관신생을 모델링하기 위해 여러 in vitro assay가 개발되었으며, 분자 수준에서 혈관신생 동인을 규명하고 치료 표적을 스크리닝하기 위해 통제된 환경이 제공하는 기회를 활용하고 있습니다.

이 연구는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사용하여 체외 에서 혈관 신생을 조사하기 위한 워크플로우를 제시합니다. 2D 설정에서 내피 세포 이동을 측정하는 라이브 셀 이미징 시스템을 활용한 스크래치 상처 이동 분석과 콜라겐 매트릭스가 제공하는 3D 설정에서 내피 세포 발아를 평가하는 스페로이드 발아 분석에 대해 자세히 설명합니다. 또한 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 3D 환경에서 전사체학(transcriptomics)과 같은 추가 분자 분석을 가능하게 하는 시료 전처리 전략을 간략하게 설명합니다. 전체적으로 이 프레임워크는 과학자들에게 체외 혈관신생 분석에 대한 과학적 연구를 추구할 수 있는 신뢰할 수 있고 다재다능한 도구 세트를 제공합니다.

서론

혈관신생술은 기존의 혈관에서 새로운 혈관이 형성되는 것을^{말하며1 생}리적 발달 및 병리학적 조건에서 중요한 과정이다. 이는 망막(retina)² 또는 발달 중인 중추신경계(central nervous system⁾³와 같이 대사 활동이 활발한 조직에 에너지를 공급하고, 손상된 조직⁴을 치유하는 과정에서 필수적이다. 반면에 비정상적인 혈관 신생은 수많은 질병의 기초가 됩니다. 대장암이나 비소세포폐암과 같은 고형암은 혈관신생을 촉진하여 종양의 성장과 필요한 에너지 공급을 촉진한다⁵. 암 외에도 당뇨병성 망막병증 또는 연령 관련 황반 변성과 같은 눈의 신생 혈관 질환은 선진국에서 실명의 주요 원인으로 비정상적인 혈관 성장의 결과입니다 ^6,7. 근본적인 발병 기전에 대한 자세한 이해는 예를 들어 혈관 증식성 안구 질환과 같은 병리학적 상태를 더 잘 제어하면서 상처 치유에서 생리적 혈관 신생을 향상시킬 수 있는 방법을 이해하는 데 중요합니다.

세포 수준에서, 혈관 내피 세포는 혈관 신생에서 다양한 신호 분자에 의해 활성화되어 세포 증식과 이동을 시작한다⁸. 세포는 이어서 계층으로 조직되며, 비증식하는 팁 세포는 발달 중인 혈관 분지(⁸)의 선두 가장자리에 선체(filopodia)를 형성합니다. 이와 함께 빠르게 증식하는 줄기 세포가 팁 세포를 따라가며 새로 나오는 혈관의 형성에 기여합니다. 그 후, pericyte 또는 평활근 세포와 같은 다른 세포 유형이 모집되어 초기 분지⁹를 더욱 안정화시킨다.

혈관 내피 세포 수준에서 분자 과정을 탐구하기 위해 수많은 in vitro 프로토콜이 개발되었으며 최근에는¹⁰ 검토되었습니다. 이러한 분석은 일반적으로 두 가지 범주로 나뉩니다: 더 단순하지만 확장 가능한 2D 접근 방식과 더 정교한 3D 프로토콜. 최근 프로젝트에서 우리는 2D 긁힌 상처 이동 분석과 3D 스페로이드 발아 분석(¹¹ ) 간의 포괄적인 비교 분석을 수행하여 차이점의 정도와 혈관 신생의 다양한 측면을 모델링할 수 있는 능력을 평가했습니다¹².

둘 다 신뢰할 수 있고 쉽게 구현할 수 있다는 장점을 제공하지만, 분자 수준에서 3D 스페로이드 발아 분석은 대사 스위치 또는 세포-매트릭스 상호 작용과 같은 생체 내 데이터와 비교하여 혈관 신생의 주요 측면을 해결하는 데 유리했습니다. in vitro angiogenesis assay는 신호전달 경로⁽¹³)의 혈관조절 전위를 평가하고 치료제를 스크리닝하는 데 사용되기 때문에, in vitro 결과를 in vivo 환경으로 이전하는 것이 필수적이다. 또한, 통제된 조건에서 혈관 생성 과정의 표적 조절에 대한 반응으로 분자 변화를 특성화하기 위한 RNA 및 단백질 수준에 대한 오믹스 기반 분석의 기회는 생체 내 설정에 비해 중요한 이점으로 남아 있습니다^14,15.

이 간행물에서는 단백질 수준에서의 전사체 분석을 위한 RNA 염기서열 분석 및 면역조직화학과 같은 후속 분자 분석을 포함하여 살아있는 세포 이미징 이동 분석 및 스페로이드 발아 분석의 활용을 통해 혈관 신생 관련 질문을 탐구하기 위한 주요 분석을 제시합니다.

프로토콜

1. HUVEC 세포 배양

알림: 멸균 작업 조건(멸균 작업대)에서 다음 단계를 모두 수행하십시오.

1. HUVEC 확장
   1. 두 혈관신생 분석의 경우 통합형 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 또는 인간 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 사용합니다.
   2. 분할을 수행하기 전에 내피 세포 성장 배지(EGM)가 있는 코팅되지 않은 T75 플라스크에서 90% 합류점에 도달할 때까지 세포를 배양합니다. 일주일에 3번 미디엄 체인지를 실시합니다.
      알림: 성장을 촉진하기 위해 매체는 매일 교체할 수 있습니다. 여섯 번째 통로 이후에는 HUVEC을 사용하지 마십시오. 이 연구는 동일한 통로의 HUVEC으로 모든 실험을 실행한 결과 가장 일관된 결과를 받았습니다.
2. HUVEC 분할
   1. HUVEC이 T75 플라스크에서 원하는 합류점에 도달하면 5mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 한 번 헹구고 인큐베이터에서 2분 동안 0.5% 트립신으로 세포를 배양합니다.
      알림: 트립신에 장기간 노출되면 HUVEC 기능이 손상될 수 있습니다.
   2. 플라스크를 두드려 세포를 부드럽게 분리합니다. 역위상차 현미경으로 성공적인 분리를 확인합니다.
   3. EGM 8mL를 첨가하고 용액을 튜브에 옮기고 250 x g 에서 3분 동안 원심분리하여 세포를 펠트합니다.
   4. 세포 계수가 필요한 경우 5mL의 EGM에 세포를 재현탁시키고 Neubauer 챔버를 사용합니다. 그렇지 않으면 EGM 40mL를 넣고 4개의 새 T75 세포 배양 플라스크에 분배합니다.

2. 스크래치 상처 이동 분석

참고: 긁힌 상처 이동 분석은 완료하는 데 3일이 소요됩니다(그림 1). 멸균 작업 조건(멸균 작업대)에서 다음 단계를 모두 수행합니다.

1. 세포의 도금 및 고갈(1일차)
   1. 라이브 셀 이미징을 위한 특수 96웰 플레이트를 사용하여 웰당 100μL의 EGM에 20,000개의 HUVEC을 시드합니다. 세포가 인큐베이터에서 6시간 동안 가라앉도록 합니다.
      참고: 공급업체와 실험실 간의 혈관 내피 세포 성장 속도의 차이를 고려하여 세포 수를 최적화하는 것이 좋습니다. 목표는 스크래치를 시작하기 전에 다음 날 완벽한 단층을 달성하는 것입니다. 과도하게 밀집된 웰은 예를 들어 접촉 억제¹⁶에 의해 내피 세포 거동을 변경할 수 있으며, 불완전한 단층은 분석을 크게 방해합니다.
   2. 100% FBS가 보충된 웰당 100μL의 EBM으로 모든 웰을 하룻밤 동안 굶깁니다.
      알림: 특히 다중 채널 피펫을 사용할 때 세포 단층이 손상되지 않도록 주의하십시오.
2. 자극 솔루션 준비(2일차)
   1. 2% FBS가 보충된 내피 세포 성장 기초 배지(EBM)에서 원하는 물질과 대조군을 희석합니다. 각 웰에 대해 100μL의 용액을 사용합니다.
      참고: 2% FBS가 보충된 EBM은 음성 대조군으로 작용하는 반면, 25ng/mL의 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다. 96웰 플레이트를 사용하는 경우 최소한의 기술적 반복실험(동일한 조건의 웰 4개)으로 실험을 설계하는 것이 권장되지만 최적의 결과를 위해 8웰을 사용하는 것이 좋습니다. 배치를 계획할 때 잠재적인 가장자리 또는 모서리 효과를 최소화하기 위해 노력하십시오.
3. 스크래치 만들기(2일차)
   1. 현미경으로 세포를 검사하여 융합 세포 단층과 세포 생존율을 확인합니다. 96웰 플레이트를 96웰 와인딩 메이커 도구에 놓고 장치의 레버를 눌러 스크래치를 생성합니다. 이중 긁힘을 방지하기 위해 레버를 놓기 전에 상처 제조 도구의 뚜껑을 조심스럽게 들어 올리십시오.
   2. 2% FBS가 보충된 웰당 200μL의 EBM을 사용하여 모든 웰을 두 번 세척합니다. 현미경으로 이물질이 성공적으로 제거되었는지 확인합니다.
4. 세포 자극(2일차)
   1. 웰당 100μL의 준비된 자극 또는 대조 용액을 추가합니다.
5. 이미징(2-3일차)
   1. live-cell imaging microscope에서 제공하는 자동화된 스케줄을 사용하여 최대 24시간 동안 시간당 한 번씩 이미지를 획득합니다.
      참고: 우수한 이미지 품질을 보장하려면 라이브 셀 이미징 시스템이 있는 인큐베이터로 이송한 직후 모든 웰을 스캔하십시오. 인큐베이터에서 30분의 적응 시간은 더 나은 화질을 얻는 데 도움이 됩니다. 현미경 소프트웨어는 정의된 스크래치의 정중선에서 각 웰에 대해 시간당 하나의 이미지를 획득하도록 프로그래밍되어 있습니다.
6. 상처 제조 도구와 살아있는 세포 이미저가 없는 경우 아래 설명된 단계를 따르십시오.
   1. 24웰 플레이트에 피펫 팁을 사용하여 긁힘을 유발합니다. 기존 세포 배양 현미경으로 특정 간격으로 이미지를 촬영합니다. 이를 위해 정밀한 x 및 y 추적 기능을 갖춘 전동 현미경을 사용하십시오. 이를 통해 자동 위치 지정이 가능하여 사전 정의된 위치에서 일관된 이미지 캡처를 보장할 수 있습니다.
      참고: 수동 이미징이 필요한 경우 T0만 이미징하고 치료 후 한 시간 'x'시간 동안 이미징하는 것이 실행 가능한 옵션입니다. HUVEC을 사용한 기술된 프로토콜에서, 시점 T12(자극 후 12시간)는 음성 및 VEGF-자극 양성 대조군 사이의 명확한 구분을 가진 매력적인 시점이었다. 그러나 각 실험실의 특정 실험 설정에 대한 최적의 시점을 결정하기 위해 2시간 또는 1시간마다 이미징을 사용하여 초기 시간 과정 실험을 실행하는 것이 좋습니다.
7. 분석(3일차)
   1. 라이브 셀 이미징 현미경 소프트웨어를 사용하면 획득한 이미지를 직접 분석할 수 있습니다. 세포 잔디, 초기 스크래치 및 상대적 상처 밀도 영역을 설명하는 마스크를 정의합니다. 대비 차이를 기반으로 셀 경계를 결정합니다.
      참고: HUVEC로 실행된 실험에는 분할 조정 1.6, 구멍 파일 500μm2, 조정된 크기 1픽셀, 면적 >500μm 및 편심 >0.6이 사용되었습니다. 실제 이미지와 관련된 세포 검출 매개변수에 대한 철저한 시각적 검사는 필수적입니다. 최적화된 구성을 통해 소프트웨어는 시간 경과에 따른 상대 상처 밀도(RWD)를 자동으로 계산하고 기술 복제의 표준 편차(SD)와 함께 해당 시간 그래프를 생성합니다. 그런 다음 이 데이터를 통계 분석에 사용할 수 있습니다.

3. 2D 배양 세포를 이용한 RNA 추출

알림: 멸균 작업 조건(멸균 작업대)에서 3.3단계까지 다음 단계를 모두 수행합니다.

1. 도금 셀(1일차)
   1. HUVEC 세포 배양 프로토콜의 1.2단계에 따라 HUVEC를 분리합니다.
   2. 웰당 2mL의 EGM이 있는 12웰 플레이트에 웰당 50,000개의 세포를 시드합니다.
   3. 6시간 후 배지를 밤새 굶주리기 위해 2% FBS(굶주린 미디어)가 포함된 EBM으로 변경합니다.
2. 세포 처리(2일차)
   1. EBM에 관심 있는 약제를 희석하여 2% FBS를 보충합니다. 굶주린 배지를 준비된 희석액으로 교체하고 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 세포를 배양합니다.
3. RNA 추출(2-3일차)
   1. 웰당 750μL의 Trizol로 세포를 용해하고 오비탈 쉐이커에서 10분 동안 배양합니다.
   2. 1000 μL 피펫으로 샘플을 몇 번 재현탁시킨 다음 특정 저결합 RNA 튜브(부피 1.5mL)에 보관합니다. -80 °C에서 보관하십시오.

4. 2D 배양 세포를 이용한 면역세포화학

알림: 멸균 작업 조건(멸균 작업대)에서 4.4단계까지 다음 단계를 모두 수행하십시오.

1. 커버슬립의 준비
   1. 50mL 튜브에 담긴 5% 수산화칼륨에 직경 12mm의 커버슬립 100개를 넣고 50mL 튜브에 30분 동안 배양합니다.
      참고: 이것은 커버슬립의 표면을 탈양성자화하고 코팅 및 배양 조건을 개선하는 데 매우 중요한 단계입니다. 이 시점에서 커버슬립이 매체 내에 잘 분포되어 있고 건조되어 서로 붙지 않도록 하는 것이 좋습니다.
   2. 커버슬립을 탈염수로 30분 4회 세척합니다.
   3. 세척 후 보관을 위해 70% 이소프로필 용액에 옮깁니다.
2. 커버슬립의 코팅
   1. 이소프로필 알코올이 증발할 수 있도록 커버슬립을 정사각형 페트리 접시의 벽에 개별적으로 기대십시오.
   2. 5분 후 커버슬립을 24웰 플레이트로 옮깁니다(웰당 하나의 커버슬립). PBS의 10mg/mL 콜라겐 I 용액 1mL를 각 웰에 적용하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
   3. 그런 다음 PBS로 커버슬립을 4-5분 동안 5번 세탁합니다.
3. 세포 배양
   1. HUVEC 세포 배양 프로토콜의 1.2단계에 설명된 절차에 따라 HUVEC를 분리합니다.
   2. 웰당 50,000개의 세포를 웰당 2mL의 EGM이 있는 24웰 플레이트에 시드합니다.
   3. 6시간 후 배지를 2% FBS가 포함된 EBM으로 변경하여 세포가 웰에 부착되고 밤새 세포를 굶주리게 할 수 있도록 합니다.
   4. 다음 날, EBM에 관심 있는 약제에 2% FBS를 첨가합니다. 웰의 굶주린 용액을 준비된 희석액으로 교체하고 인큐베이터에서 원하는 시간 동안 세포를 배양합니다.
4. 고정 및 차단
   1. 원하는 시간 동안 세포를 배양한 후 PBS로 5분 동안 세포를 세척합니다.
   2. PBS에서 2% 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 실온(RT)에서 20분 동안 고정합니다.
   3. PBS로 3-4 번 5 분 동안 세척하십시오.
   4. PBS에서 5% 정상 염소 혈청(NGS), 0.1% Triton-X-100을 함유한 차단 완충액이 있는 샘플을 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
      참고: 이 단계에서는 PFA가 완전히 제거되도록 샘플을 세척하는 것이 중요합니다. 2차 항체의 기원에 따라 혈청의 종을 선택합니다.
5. 얼룩
   1. 4°C에서 1차 항체와 함께 차단 완충액에서 샘플을 밤새 배양합니다.
   2. 다음 날, 결합되지 않은 1차 항체를 제거하기 위해 PBS로 샘플을 각각 5분 동안 3-4회 세척합니다.
   3. 그 후, 차단 완충액에 함께 희석된 해당 2차 항체 및 Phalloidin-FITC와 함께 RT에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.
   4. 추가로 3-4 번 씻으십시오.
   5. DAPI 함유 장착 매체의 작은 방울로 커버슬립을 슬라이드에 뒤집고 어두운 곳에서 건조시킨 다음 매니큐어로 밀봉합니다. 시료는 4°C의 어두운 곳에 보관하십시오.

5. 회전 타원체 발아 분석

참고: 스페로이드 발아 분석은 완료하는 데 3일이 걸립니다(그림 2). 멸균 작업 조건(멸균 작업대)에서 5.7단계까지 다음 단계를 모두 수행합니다.

1. 매달린 방울에서 스페로이드 생성(1일차)
   1. HUVEC 세포 배양 프로토콜의 1.2단계에 설명된 절차에 따라 HUVEC를 분리합니다.
   2. 200,000개의 세포를 8mL의 EGM 및 2mL의 메토셀 원액과 결합하여 철저한 혼합을 보장합니다. 메토셀 스톡 용액 준비에 대한 지침은 보충 파일 1 을 참조하십시오.
   3. 용액의 25μL 방울을 큰 사각형 페트리 접시의 반전된 내부 표면에 분사합니다. 뚜껑을 180° 부드럽게 회전하고 액적이 매달려 있도록 세포 배양 용기 바닥에 놓습니다. 용기를 세포 배양 인큐베이터에 밤새 넣습니다.
2. 콜라겐 젤 준비(2일차)
   1. 혼합물이 일관되게 균일한 노란색 색조를 얻을 때까지 2.3mL의 쥐 꼬리 콜라겐 유형 I과 0.280mL의 10x Medium 199를 철저히 혼합합니다. 전체 과정 동안 이 혼합물을 얼음 위에 두십시오.
3. 콜라겐 겔 적정(2일차)
   1. NaOH(2 N)를 사용하여 주황색으로 표시된 생리학적 pH를 얻기 위해 혼합물을 적정합니다.
   2. 최종 제품에 50μL의 HEPES 완충액을 추가합니다.
      참고: 분석을 위한 최적의 dynamic range를 보장하려면 생리학적 pH에 가능한 한 가깝게 접근하는 것이 중요합니다. 다양한 콜라겐 배치에는 다양한 양의 NaOH가 필요할 수 있습니다. 공정 전반에 걸쳐 혼합물을 얼음 위에 엄격하게 유지하고 항상 균질하게 혼합하십시오.
4. 스페로이드 채취(2일차)
   1. 세포 배양 뚜껑에서 매달려 있는 점안액을 20mL의 PBS로 헹굽니다.
   2. 250 x g에서 7분 동안 용액을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 튜브를 부드럽게 두드려 0.1mL의 FBS와 0.4mL의 EGM에 스페로이드를 재현탁시킵니다.
   3. 메토셀 원액 2mL를 넣고 잘 섞는다. 스페로이드 손상을 방지하기 위해 최소 5mL 용량의 피펫을 사용하십시오.
5. 3D 콜라겐 매트릭스에 스페로이드 추가(2일차)
   1. 준비된 콜라겐 혼합물 2mL를 재현탁 스페로이드에 넣고 잘 섞는다.
   2. 생성된 혼합물 0.5mL를 24웰 플레이트의 웰에 분주하고 세포 인큐베이터에서 30분 동안 배양합니다.
6. 3D 콜라겐 매트릭스의 스페로이드 자극(2일차)
   1. EBM에서 원하는 물질의 희석액을 준비합니다. 각 웰에 대해 100μL의 용액을 사용합니다.
      참고: EBM은 음성 대조군으로 작용하는 반면, 25ng/mL(500μL의 콜라겐 매트릭스 및 100μL EBM 층의 최종 농도)에서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
   2. 원하는 시간 동안 배양하십시오.
      참고: 표준 분석에서는 18-24시간이 권장되지만 각 실험실에서 타이밍을 신중하게 최적화해야 합니다.
7. 스페로이드 이미징(3일차)
   1. 도립 현미경 및 이미징 플랫폼을 활용하여 웰 테두리와 접촉하지 않거나 서로 접촉하지 않거나 손상 징후가 보이는 모든 스페로이드의 이미지를 캡처합니다. 모든 조건에서 일관된 설정과 확대/축소 수준을 유지할 수 있습니다.
8. 분석(3일차)
   1. ImageJ Fiji의 측정 도구를 사용하여 모든 이미지에서 각 회전 타원체의 모든 새싹 길이를 확인합니다.
      참고: 보충 파일 2에 제공된 플러그인을 사용하면 분석이 보다 효율적으로 수행되고 출력 .txt 파일이 생성됩니다.
   2. 데이터를 스프레드시트, R 또는 기타 선호하는 소프트웨어로 가져오고 스페로이드당 모든 새싹의 평균 누적 길이를 각 조건에 대한 판독값으로 사용합니다.
      참고: 다른 겔의 결과는 절대 발아 길이의 형태로 결합할 수 없습니다. 데이터를 병합하기 전에 각 처리 그룹의 데이터를 EBM 또는 VEGF 대조군(상대 발아 길이)으로 정규화해야 합니다.

6. 3D 배양 세포를 이용한 RNA 추출

1. 스페로이드 새싹 분석
   1. 섹션 5에 설명된 대로 스페로이드 발아 분석을 수행합니다.
2. 콜라겐 겔의 용해
   1. 따뜻한 PBS로 스페로이드 젤을 5분 동안 세척합니다.
   2. 스페로이드 겔을 4등분하고 4개의 4분의 1을 모두 50mL 튜브에 옮깁니다. 겔의 기계적 해부를 위해 메스를 사용하십시오.
   3. 겔 샘플을 용해 용액(PBS에 2mg/mL 콜라겐분해효소 D 함유)으로 처리하고 셰이커에서 37°C에서 45분 동안 배양합니다.
   4. 용해 완충액의 반응을 멈추기 위해 2mM EDTA가 보충된 PBS로 겔을 부드럽게 세척합니다.
3. RNA 추출
   1. 용해된 겔을 750μL의 Trizol에 재현탁시키고 3.3단계에 설명된 대로 충분한 RNA 추출을 보장하기 위해 10분 동안 배양합니다.
   2. 1000 μL 피펫으로 시료를 몇 번 재현탁시키고 시료를 특정 저결합 RNA 튜브(부피 1.5mL)로 옮깁니다. -80 °C에서 샘플을 보관하십시오.

7. 3D 콜라겐 매트릭스에서 스페로이드의 면역세포화학(Immunocytochemistry)

1. 스페로이드 새싹 분석
   1. 섹션 5에 설명된 대로 스페로이드 발아 분석을 수행합니다.
2. 고정 및 차단
   1. PBS에서 1 시간 동안 4 % PFA로 젤을 고정합니다.
      알림: 겔의 세포가 잘 고정되도록 하려면 PBS로 헹군 후 메스와 핀셋으로 웰 측면에서 겔을 조심스럽게 분리해야 합니다.
   2. PBS로 젤을 3-4회 부드럽게 세척한 다음 웰 표면에서 완전히 분리하여 새 24웰 플레이트로 옮깁니다.
   3. 오비탈 쉐이커에서 차단 용액(PBS에 5% NGS 및 0.1% Triton-X-100 포함)을 사용하여 RT에서 1시간 동안 겔을 배양합니다.
3. 얼룩
   1. 1차 항체를 차단 완충액에 희석한 상태로 4°C에서 4°C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
      참고: 이 배양 중에 겔을 돌려도 염색 품질이 향상되지 않았습니다.
   2. 다음 날, PBS로 젤을 각각 5분 동안 4-5번 부드럽게 세척합니다.
   3. Phalloidin-FITC로 희석한 해당 2차 항체를 궤도 쉐이커에서 4°C에서 밤새 차단 완충액으로 희석합니다.
   4. PBS로 4-5개의 추가 세척 단계를 수행합니다.
   5. 겔을 현미경 슬라이드에 옮기고 각 겔에 놓인 커버슬립에 DAPI 함유 장착 매체 두 방울을 떨어뜨려 장착합니다. 매니큐어로 밀봉하기 전에 샘플을 건조시키고 4°C의 어두운 곳에 보관합니다.
4. 현미경 검사 법
   1. 컨포칼 현미경으로 모든 샘플을 이미지화합니다. 20x 목표를 사용하고 관심 영역에 초점을 맞춥니다. 이미지를 Z-stack으로 획득할 수 있을 뿐만 아니라 개별 초점면 이미지도 획득할 수 있습니다.
      참고: 3D 샘플의 여러 섹션에서 Z-stack 및 초점면 이미지를 획득하는 것은 특히 두꺼운 3D 샘플의 경우 완전한 표현을 캡처하는 데 필수적입니다.

8. 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMVEC)

주의: 설명된 모든 단계는 미세혈관 내피 세포, 예를 들어 인간 망막 미세혈관 내피 세포(HRMVEC)에 대해서도 수행할 수 있습니다. 이 경우 배지를 배양 및 각 분석의 특정 단계를 위해 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 특정 미세혈관 내피 세포 배지로 전환해야 합니다. 분석 프로토콜에 대한 HRMVEC별 차이점은 다음과 같습니다.

1. 스크래치 상처 분석
   1. EGM 대신 10% FBS 미세혈관 내피 세포 배지에서 세포를 배양합니다.
   2. 20,000 세포/웰을 파종합니다.
   3. 세포를 밤새 굶기지 마십시오.
   4. 스크래치를 수행한 후 배지를 FBS가 2%인 EBM 대신 5% FBS가 포함된 기저 내피 세포 배지로 변경합니다.
2. 2D 배양 HRMVEC의 면역세포화학(Immunocytochemistry of 2D culated HRMVECs)
   1. EGM 대신 10% 미세혈관 내피 세포 배지에서 세포를 배양합니다.
   2. 세포를 밤새 굶기지 마십시오.
   3. 처리 직전의 배지를 EBM+2% FBS 대신 EBM + 5% FBS로 변경합니다.
3. 스페로이드 새싹 분석
   1. EGM 대신 10% FBS를 함유한 미세혈관 내피 세포 배지로 세포를 매달린 방울로 파종합니다.
4. 3D 콜라겐 매트릭스에서 스페로이드의 면역세포화학(Immunocytochemistry of spheroids in a 3D collagen matrix)
   1. EGM 대신 10% FBS를 함유한 미세혈관 내피 세포 배지로 세포를 매달린 방울로 파종합니다.

결과

이동 분석의 경우, 완전히 형성된 세포 단층의 존재가 시스템에서 정확하게 감지되도록 t = 0h 시점에서 캡처된 이미지를 철저히 검사하는 것이 중요합니다(그림 1B). 또한 스크래치 테두리의 선명도와 직진도를 확인해야 합니다(그림 1B). cell-free 영역에는 이물질이 거의 없어야 합니다. 분석이 끝날 때, 예를 들어 25ng/mL VEGF를 양성 대조군으로 자극한 그룹은 원래의 긁힌 영역에서 성공적인 이동을 보여야 합니다(그림 1B). 기술적 문제의 예는 고르지 못한 세포 성장, 이중 긁힘 또는 긁힘 경계의 물결 모양으로 나타날 수 있습니다(그림 1C). 또한 음성 대조군(EBM 자극 샘플)과 양성 대조군(VEGF 샘플) 사이에 상당한 동적 범위를 설정하는 것이 중요합니다(그림 1D). 실험 설정에서는 12시간 후 RWD가 25% 증가하는 것을 최적의 범위로 간주합니다(그림 1D). 기술적으로 문제가 있는 분석에서는 positive control과 negative control이 올바르게 분리되지 않아 dynamic range가 낮다는 것을 나타냅니다(그림 1E).

성공적인 염색을 검증하기 위해 형광 현미경으로 시각화한 커버슬립에 대한 HUVEC의 면역세포화학적 염색(그림 1F). 대부분의 세포를 조사하고 슬라이드의 특징적인 영역을 식별하는 것이 중요합니다. 염색 특이성은 비특이적 결합을 배제하기 위해 2차 항체로만 처리된 대조군 슬라이드를 사용하여 평가합니다(그림 1F). 특정 염색 신호는 표적 단백질의 알려진 subcellular localization에 따라 비판적으로 검사해야 합니다. 우리는 대조군 샘플에 신호가 없는 것과 함께 세포 내 국소화 패턴을 성공적인 면역염색 프로토콜의 지표로 사용합니다.

마찬가지로, 고품질 스페로이드 발아 분석을 위해서는 특정 측면을 고려해야 합니다. 이 경우 품질은 분석이 끝날 때 예를 들어 t = 24h에서 평가해야 합니다. 현미경으로 관찰된 콜라겐 매트릭스는 균질성을 보여야 하며 부서지기 쉽거나 거칠게 보이지 않아야 합니다(그림 2B). 음성 대조군으로 기저 배지만으로 자극하고 양성 대조군으로 25ng/mL VEGF를 자극한 스페로이드는 명확하게 구별할 수 있어야 합니다(그림 2B). 또한 스페로이드는 겔 속에 떠 있어야 하며 땅으로 떨어지지 않아야 하며, 땅으로 떨어져 분산되어 품질이 낮다는 것을 나타냅니다(그림 2C). 이 문제는 혼합물의 적정 중 콜라겐의 부적절한 냉각 또는 pH의 과잉 또는 과소 적정으로 인해 종종 발생합니다(그림 2C). 각 웰에 대해 웰당 최소 10개의 스페로이드를 이미지화할 수 있어야 합니다. 음성 대조군(EBM 자극 샘플)은 중간 정도의 기준선 발아 속도를 보여야 하는 반면, 양성 대조군 역할을 하는 VEGF는 대조군에 비해 RSL을 이상적으로 두 배 또는 세 배로 늘리는 것이 좋습니다(그림 2D, 왼쪽 그래프). 새싹의 수도 비슷한 동적 범위를 보여야 합니다(그림 2D, 오른쪽 그래프). 기술적 차선의 분석은 대조군 간의 이러한 동적 범위를 보여주지 않으므로 데이터를 잘못 해석할 수 있습니다(그림 2E).

아날로그에서 2D로의 염색, 형광 현미경으로 슬라이드 검사 및 염색된 구조에 대한 비판적 평가는 성공적인 염색을 위해 매우 중요합니다(그림 2F). 구조의 세포 국소화와 대조군과 비교한 신호 강도를 이해할 수 있다면 염색이 성공적이었다고 가정할 수 있습니다.

그림 1: live-cell imaging scratch wound migration assay. (A) scratch wound migration assay의 계획. (B) t = 0 h 및 t = 12 h에서 고품질 기술 복제를 보여주는 이미지. 세포는 25ng/mL VEGF로 자극되어 양성 대조군 역할을 합니다. (C) 부적절한 긁힘 또는 이중 긁힘으로 인해 t = 0 h에서 두 번의 저품질 기술 복제의 예. (D) 성공적인 긁힌 상처 이동 분석 결과. 25ng/mL VEGF로 자극된 양성 대조군과 기저 배지로 방금 처리한 음성 대조군의 올바른 분리는 t = 12h에서 바이올린 플롯에 의해 추가로 시각화되었습니다. 데이터에는 그룹당 7-8개의 기술 반복실험이 포함됩니다. (E) 실패한 Scratch Wound Migration Assay를 강조하는 예시적인 결과. 25ng/mL VEGF로 자극된 양성 대조군과 기저 배지로 방금 처리된 음성 대조군의 최적이 아닌 분리를 t = 12h에서 바이올린 플롯으로 시각화했습니다. 데이터에는 그룹당 7-8개의 기술 반복실험이 포함됩니다. (F) 커버슬립에 파종하고 DAPI, phalloidin 및 VEGF-R2에 대해 염색된 HUVEC의 예시적인 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 스페로이드 발아 분석. (A) 스페로이드 발아 분석의 계획. (B) t = 24 h에서 이상적인 기술 분석의 음성 대조군(기저 매체 자극 스페로이드) 및 양성 대조군(VEGF 25 ng/mL 자극 스페로이드)을 보여주는 이미지. (C) t = 24 h에서 두 개의 저품질 스페로이드의 예. 왼쪽 이미지는 손상된 스페로이드가 플레이트 바닥으로 떨어지면 스페로이드 몸체가 헐거워지고 싹이 비정상적으로 빨라지는 것을 시각화합니다. 오른쪽 이미지는 눈에 띄는 색상 패치로 콜라겐을 시각화하여 분석의 품질을 크게 저하시키는 매우 이질적인 환경을 만듭니다. (D) 음성 대조군과 양성 대조군 사이의 양호한 동적 범위를 가진 성공적인 분석의 RSL(왼쪽 그래프) 및 새싹 수(오른쪽 그래프) 분석. 데이터는 바이올린 플롯을 사용하여 시각화되며 그룹당 10-25개의 스페로이드를 포함합니다. (E) negative control과 positive control 사이의 최적이 아닌 동적 범위를 가진 기술적 문제가 있는 분석의 RSL(왼쪽 그래프) 및 새싹 수(오른쪽 그래프) 분석. 데이터는 바이올린 플롯을 사용하여 시각화되며 그룹당 10-25개의 스페로이드를 포함합니다. (F) DAPI, phalloidin, VEGF-R2.c에 대해 염색된 스페로이드 발아 분석에서 얻은 HUVEC의 예시 이미지

보충 파일 1: 메토셀 원액 제조 지침. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 파일 2: SpheroidCount.ijm 플러그인. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 보고서에서는 in vitro에서 혈관신생을 연구하기 위한 기능적 및 분자적 판독과 함께 다양한 기법을 제시했습니다.

마이그레이션 분석은 습식 실험실 작업의 모든 분야에서 사용되는 잘 정립된 기술을 나타냅니다. 스크리닝 및 용량 반응 실험에 적합한 96웰 형식, WoundMaker 도구로 생성된 표준화되고 재현 가능한 상처 크기, 최대 24시간 동안 타임랩스 이미징을 통해 이동 역학을 관찰할 수 있는 기회 및 자동 이미지 정량화 소프트웨어를 활용하기 위해 상업적으로 이용 가능한 라이브 셀 이미징 접근 방식을 선택했습니다. 그러나 혈관신생 분석 소프트웨어가 장착된 생명세포 이미징 시스템이 실험실이나 핵심 시설에 있어야 합니다. 특정 라이브 셀 이미징 현미경 또는 기타 특수 장비를 필요로 하지 않는 수많은 대체 실험 설정이 확립되었습니다¹⁰.

우리의 경험에 비추어 볼 때, HUVEC 및 기타 혈관 내피 세포 유형은 대비가 좋지 않아 현미경 소프트웨어의 자동 판독을 방해할 수 있으므로 분석기 설정을 최적화하는 것이 중요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 추가적인 형광 염색 단계(예: 라이브 셀 염색)를 도입할 수 있습니다. Live-cell 이미징 시스템은 이러한 염색 및 관심 단백질을 추적하기 위한 다중 색상 염색을 지원합니다. 이 분석의 주요 한계 중 하나는 세포 이동과 증식을 구별하는 것이 항상 간단하지 않고 분석 결과가 두 과정의 조합을 나타낸다는 것입니다. 이 연구에 사용된 라이브 셀 이미징 솔루션은 상대 상처 밀도(RWD)를 도입하여 이 문제를 해결하려고 합니다. 긁힌 영역에서 전통적으로 사용된 합류점과 달리 RWD는 외부 긁힌 영역을 기준으로 긁힌 영역 내의 합류점을 평가합니다. 긁힌 영역에서의 이동은 세포 이동으로 인해 긁힌 영역 외부의 합류를 감소시키는 동시에 긁힌 영역 내부의 합류도를 증가시켜 RWD를 상승시킵니다. 반대로, 세포 증식은 긁힌 영역 외부의 합류를 증가시켜 RWD를 감소시킵니다. 이를 최종 판독값에 대한 확산의 영향을 줄이기 위한 전략적 분석 접근 방식으로 인식하는 것이 중요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 보완적 증식 분석이 필요할 수 있습니다. 대안적으로, 미토마이신 C와 같은 세포주기 억제제를 분석에 추가하여 증식을 차단할 수 있습니다. 이러한 억제제에 대한 프로토콜 구현은 분석의 동적 범위를 줄이지 않고 원하는 효과를 얻을 수 있도록 각 실험실에서 신중하게 최적화해야 합니다. 또한 각 웰의 스캐닝 빈도를 증가시킴으로써 이 설정은 이러한 상세한 추적이 특히 필요한 경우 개별 수준에서 움직이는 세포를 정확하게 추적할 수 있는 쉽게 구현할 수 있는 기회를 제공합니다.

live-cell imaging migration assay는 확장성과 자동화된 편향되지 않은 분석의 이점을 보여주지만, 이전 연구에서는 혈관신생의 보다 복잡한 세부 사항을 캡처할 수 있는 spheroid srouting assay의 능력을 강조했습니다. 여기에는 팁 및 스토킹 세포 형성, 세포-매트릭스 상호 작용 및 해당작용 스위치(¹²)와 같은 기본 측면이 포함됩니다. 분석 재현성을 보장하려면 이 과정에서 pH와 온도의 변화가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 조사자는 콜라겐 매트릭스를 준비하는 데 경험이 있어야 합니다. 또한 분석은 수동으로 수행됩니다. 따라서 이미지 분석은 시간이 많이 걸리고 편향의 위험이 있습니다. 분석 중 조건을 적절하게 마스킹하는 것은 바이어스가 유입되는 것을 방지하는 데 필수적입니다. 이러한 우려를 해결하기 위해 우리는 최근 발아 분석 분석에서 잠재적 편향을 식별하고 완화하기 위한 신경망 기반 접근 방식을 제안했으며, 이는 쉽게 구현할 수 있습니다¹⁷. 결론적으로, 결과를 검증하는 가장 좋은 방법은 두 분석을 결합하는 것입니다. 그러나, 2D 및 3D 설정¹²의 뚜렷한 특성으로 인해 차이가 발생할 수 있음을 인정하는 것이 중요하다.

2D 및 3D in vitro angiogenesis assay의 선택이 다양하기 때문에 다른 방법과 비교하여 제시된 assay의 장점과 단점을 고려하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 스크래치 상처 분석은 플라스틱 접시의 2D 수평 이동에 초점을 맞추는 반면, Boyden 챔버 분석은 "외부 챔버"에서 화학 유인제가 있는 메쉬 인서트를 통한 수직 이동을 특성화합니다. 간단한 설정 및 판독을 기반으로 하는 Scratch Wound Assay는 특히 96웰 형식으로 고처리량 실험을 가능하게 하여 높은 재현성을 제공할 뿐만 아니라 실험을 시각화하고 타임랩스를 수행할 수 있는 가능성을 제공합니다. 불행히도, 스크래치 상처 분석의 단점은 증식과 이동을 구별하기 어렵고, 부착 세포가 필요하며, 상처 제조 도구가 없는 경우 불균등한 긁힘으로 인한 변동성이 높다는 것입니다. Boyden Chamber Assay의 판독은 운동성 세포¹⁸ 에 대한 용해성 물질의 화학주성 효과를 측정하는 이점이 있으며 침입 및 이동을 모두 강조합니다. 불행히도, 단점은 분석의 낮은 재현성과 높은 분산, 세포의 움직임을 시각화할 수 없음, 신호를 얻는 데 필요한 이동된 세포의 수가 많음, 상당히 길고 정교한 설정 및 판독, 타임랩스 설정의 기회 부족 등이다¹⁹.

스페로이드 발아 분석은 내피 세포가 3D 겔 매트릭스로 발아하는 것을 정량화하는 반면, 튜브 형성 분석은 겔 매트릭스²⁰ 표면에 세포관의 형성을 특성화합니다. 새싹 분석은 세포가 매트릭스로 침입하는 것뿐만 아니라 증식 및 이동을 특성화하는 장점이 있습니다. 단점은 적정된 콜라겐 겔의 더 높은 분산과 이를 기반으로 한 스페로이드의 품질입니다. 튜브 형성 분석의 장점은 뚜렷한 시간(사이토카인에 따라 다름) 후에 혈관 튜브가 형성되고 쉽게 접근할 수 있다는 것입니다. 단점은 세포의 침입이 없고 Matrigel 자체가 튜브 형성에 미치는 영향입니다²¹.

제시된 모든 실험은 HUVEC으로 수행되었습니다. 서로 다른 기원(예: 거대혈관 대 미세혈관)의 혈관내피세포의 행동에 상당한 차이가 존재한다는 것은 잘 알려져 있습니다^22,23. 따라서 다른 혈관 내피 세포주와 함께 실험 결과를 검증해야 할 수도 있습니다. 실험 설정은 HRMVEC가 더 높은 FBS 농도를 필요로 한다는 사실을 제외하고는 인간 망막 미세혈관 내피(HRMVECS)에 대해 이전할 수 있었습니다. 반면에, 일반적으로 사용되는 소 대동맥 내피 세포주(BAEC)는 과도한 기저 발아 속도로 인해 스페로이드 발아 분석에 사용할 수 없었습니다.

제시된 두 분석 모두 단일 세포 유형에 국한된다는 한계가 있습니다. in vivo 혈관신생이 복잡한 다세포 과정이라는 점을 감안할 때, 이 중요한 측면은 어느 분석으로도 정확하게 포착되지 않습니다. 두 분석에 대한 공동 배양 변형이 특히 스페로이드 발아 분석에 중점을 두고 개발되었으며 최근에는^10,24에 대해 논의되었습니다. 또는 관련 in vivo 혈관신생 모델에서 직접 데이터를 검증하는 것이 실행 가능한 옵션입니다. 이러한 목적을 위해 확립된 분석법으로는 산소 유도 망막병증(OIR)²⁵에 대한 마우스 모델, 레이저 유도 맥락막 신생혈관화(Laser-CNV) 모델(²⁶) 및 플러그 분석법⁽²⁷)이 있습니다.

전반적으로, 2D 라이브 셀 이미징 이동 분석과 3D 스페로이드 발아 분석은 제시된 분자 분석 도구와 함께 혈관 신생 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공하며 혈관 신생 커뮤니티 내에서 널리 인정받고 있습니다. 이러한 분석을 후속 in vivo 분석과 결합하여 결과를 검증하면 특정 혈관신생 관련 질문을 조사하기 위한 견고한 기반을 제공할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10x 미디엄 199	Sigma-Aldrich	M0650
Alexa Fluor 647-conjugated AffiniPure F(ab)' 2-프래그먼트	잭슨 IR	115-606-072
Axio Vert. A1	Zeiss
CapturePro 2.10.0.1	JENOTIK 광학 시스템
콜라겐 타입 1 쥐 꼬리	Corning	354236
Collagenase D	Roche
내피 세포 기초 매체	Lonza	CC-3156	EBM
내피 세포 성장 매체	Lonza	CC-3162	EGM
에틸렌디아민테트라아세트산	Serva	11290.02	EDTA
소 태아 세럼	Bio& SELL	S 0615	FBS
인간 엄빌리컬 베인 내피 세포, 풀드	Lonza	C2519A	HUVEC
IncuCyte ImageLock 96-웰 플레이트	Sartorius	4379
Incucyte S3 라이브 셀 분석 시스템	Sartorius
Methocel	Sigma	m-0512
10% FBS가 있는 미세혈관 내피 세포 배지	PB-MH-100-4090-GFP	PELOBiotech
NaOH	Carl Roth	P031.2
Phalloidin-Fluorescein Isothiocyanate 표지(0.5mg/mL 메탄올)	Sigma-Aldrich	P5282-.1MG	Phalloidin-FITC
인산염 완충 식염수	Thermo Fisher Scientfic	14190-094	PBS
1차 인간 망막 미세혈관 내피 세포	세포 시스템	ACBRI 181
ThermoFisher Scientific의 NucBlue Invitrogen	을 사용한 ProLong Glass Antifade Mountant	2260939
QIAzol Lysis Reagent	QIAGEN	79306
재조합 인간 혈관 내피 성장 인자	PeproTech	100-20	VEGF
제곱 페트리 접시	Greiner	688102
Trizol	Qiagen	79306
Trypsin	PAN-Biotec	P10-024100
VEGF-R2 (monoclonal)	ThermoFisher Scientific Inc.	B.309.4
WoundMaker	장갑	4493