고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

Summary

우리는 발광 기반 염색체 외 리포터 기질 세트를 사용하여 세포에서 이중 가닥 절단 복구 경로 숙련도를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

Abstract

DNA 이중 가닥 절단(DSB)의 복구는 게놈 안정성과 세포 생존율의 유지에 매우 중요합니다. 세포의 DSB 복구(DSBR)는 상동 재조합(HR), 비상동 말단 결합(NHEJ), 미세 호몰로지 매개 말단 결합(MMEJ) 및 단일 가닥 어닐링(SSA)과 같은 여러 메커니즘을 통해 매개됩니다. 세포 분석은 다양한 자극에 대한 반응으로 이러한 경로의 숙련도와 조절을 측정하는 데 필수적입니다.

여기에서는 세포의 4가지 주요 DSBR 경로 중 하나에 의한 나노루시페라아제 리포터 유전자의 재구성을 각각 측정하는 염색체 외 리포터 분석 제품군을 제시합니다. 관심 세포로의 일시적인 transfection시 Nanoluciferase (NanoLuc) 발광의 검출을 통해 경로 특이적 리포터 기질의 복구를 24시간 이내에 측정할 수 있습니다.

이러한 강력한 분석은 정량적이고, 민감하며, 적정이 가능하고, 고처리량 스크리닝 형식으로 조정할 수 있습니다. 이러한 특성은 DNA 복구 연구 및 약물 발견에 광범위한 응용 분야를 제공하며 현재 사용 가능한 세포 DSBR 분석 툴킷을 보완합니다.

Introduction

DNA 이중 가닥 절단(DSB)은 특히 독성이 강한^{DNA 손상1}을 나타내며, 이로 인해 세포는 이러한 병변을 복구하기 위해 다중 DSB 복구(DSBR) 경로를 진화시켰습니다. 4가지 주요 DSBR 메커니즘은 상동 재조합(HR), 비상동 말단 결합(NHEJ), 미세 호몰로지 매개 말단 결합(MMEJ) 및 단일 가닥 어닐링(SSA)^2,3입니다. DSBR 경로는 건강한 조직 발달 및 생리학적 유지에 기여하고 암과 같은 질병으로부터 보호합니다. 또한, 이러한 복구 메커니즘은 정밀 종양학에서 소분자 조절제의 개발을 위한 치료 잠재력을 가지고 있습니다. 예를 들어, MMEJ 복구 경로의 중추적 효소인 DNA Polymerase θ (Polθ)를 표적으로 하는 것은 암에서 HR 결핍에 대한 합성 치사율로 인해 관심을 끌었습니다⁴.

따라서 DSBR에 대한 이해는 광범위한 임상적 의미를 가지며 모든 주요 DSBR 경로의 활성을 측정할 수 있는 기능적 세포 분석이 필요하다⁵. 분석은 유전 및 약리학적 조사에 모두 적합해야 하며 관심 세포 모델 전반에 걸쳐 배포할 수 있어야 합니다. 저분자 약물 발견 노력을 지원하기 위해 분석은 감도가 높고, 적정 가능하고, 처리 시간이 빠르고, 화합물 스크리닝에 적합한 고처리량 형식으로 확장 가능해야 합니다.

일반적으로 DSBR은 이전에 세포 게놈에 안정적으로 통합된 형광 기반 리포터 분석 시스템을 사용하여 측정되었습니다⁶. 그러나 염색체 DSBR의 생리학적 재현은 뚜렷한 장점이지만, 이러한 분석은 리포터가 통합된 호스트 모델로 제한되고, 유세포 분석을 통한 노동 집약적인 시료 준비 및 분석을 활용하며, 약물 발견 노력에 필요한 모든 필수 기능인 처리량, 처리 시간, 견고성 및 감도가 제한됩니다.

여기에서는 4가지 주요 DSBR 경로를 평가할 수 있는 DSBR 리포터 분석 제품군에 대해 설명합니다. 리포터 분석 기판 제품군은 그림 1 에 요약되어 있으며 최근 간행물⁷에 자세히 설명되어 있습니다. 이들은 염색체 외(extrachromosom)로, 간단한 일시적인 transfection에 의해 세포에 도입될 수 있으며, 특정 DSBR 메커니즘과의 결합에 의해 재구성되어야 하는 나노루시페라아제 리포터 유전자⁸의 통합은 민감성, 견고성 및 확장성을 제공합니다. 프로토콜에는 다음과 같은 DSBR 리포터 기판 변형이 포함되어 있습니다(그림 1).

절제 독립적 MMEJ: 이 선형 기질은 절제된 DNA 말단을 모방한 단일 가닥 DNA(ssDNA) 돌출부가 있는 코어 이중 가닥 DNA(dsDNA) 영역으로 구성됩니다⁹. ssDNA 영역의 말단에 있는 4개의 뉴클레오티드 마이크로호몰로지(microhomologies)는 리포터 유전자의 시작 코돈(start codon)을 암호화합니다. MMEJ를 통해 이 기질을 복구하면 리포터 유전자 ORF(Open Reading Frame)가 복원됩니다.

절제 의존성 MMEJ: N-말단 리포터 유전자 엑손은 정지 코돈(stop codon)을 포함하는 분절에 의해 중단되며, 이 분절은 8개의 염기쌍(bp) 미세호모로지(microhomologies)로 둘러싸여 있습니다. 온전한 리포터 유전자를 복원하기 위해 MMEJ 매개 복구 전에 핵분해 말단 절제가 필요합니다.

무뚝뚝한 NHEJ: 리포터 유전자는 N- 말단 및 C-말단 부분으로 나뉘며, 그 중 C-말단 섹션은 프로모터의 상류에 배치됩니다. DSB는 EcoRV를 사용하여 생산되며, 리포터 유전자 부분을 재결합하고 리포터 ORF를 복원하기 위해 NHEJ에 의한 직접 결찰(말단 처리 없이)이 필요합니다.

무딘 NHEJ: DSB는 인트론 내에 위치하며 제한 효소의 선택에 따라 응집성 또는 비응집성 끝을 갖습니다. NHEJ에 의한 이 기질의 수리는 말단 처리가 선행되어야 합니다.

긴 템플릿 HR: 리포터 유전자의 N-말단 엑손은 원래 리포터 유전자 염기서열의 22bp를 대체하는 제한 부위를 포함하는 DNA 세그먼트에 의해 중단됩니다. 이 염기서열을 복원하기 위해 HR의 수리는 C-말단 엑손의 다운스트림에 배치된 2.5킬로베이스(kb) 상동성 템플릿을 사용합니다.

짧은 템플릿 HR: DSB를 생성하는 데 필요한 제한 부위는 네이티브 리포터 유전자 염기서열의 일부를 대체하고 프레임 내 정지 코돈을 도입합니다. 긴 템플릿 버전과 마찬가지로 이 HR 기판은 리포터 ORF의 정확한 수리 및 복원을 위해 다운스트림 상동성 템플릿(360bp)이 필요합니다.

특수: 이 기질은 리포터 유전자의 N-말단 엑손(exon) 내에 위치한 조기 정지 코돈(premature stop codon)을 함유하고 있습니다. 이 정지 코돈을 제거하고 온전한 리포터 유전자 염기서열을 복원하려면 SSA에 의한 복구가 필요하며, 여기에는 상동성의 정렬 전에 양방향 장거리 절제가 포함됩니다.

DSB 생성을 위해 일부 리포터 기판은 I-SceI로 분해할 수 있습니다(그림 1). 이렇게 하면 반전 방향의 탠덤 I-SceI 사이트가 있는 절제 의존성 MMEJ, 비평활 NHEJ, 긴 템플릿 HR 및 SSA 리포터에서 응집력이 없는 끝을 가진 선형 기판이 생성됩니다. 짧은 템플릿 HR 리포터 기판에서 단일 I-SceI 사이트의 소화는 응집력 있는 끝을 생성합니다. non-blunt NHEJ, resection-dependent MMEJ, long template HR 및 SSA plasmid는 HindIII로 절단할 수 있으며, 이는 상호보완적인 응집력 말단을 생성합니다.

당사는 리포터 분석 기질의 생성을 위한 프로토콜을 제공하고 분석을 수행할 수 있는 방법을 설명하며, 소분자에 대한 적정 반응, 세포 효능, 표적 활성 및 경로 선택성 평가를 포함하여 DSBR을 정량화하는 데 사용할 수 있는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다.

Protocol

1. 리포터 기판의 준비 및 품질 관리(QC)

참고: 리포터 기질을 인코딩하는 플라스미드는 표준 대장균 균주(예: DH5α 및 유도체)에서 증식되고 플라스미드 분리에 의해 회수될 수 있습니다. 플라스미드 세부 정보(크기 및 항생제 내성)는 표 1 및 그림 1에 설명되어 있습니다.

그림 1: 염색체 외 NanoLuc 기반 DSBR 리포터 분석의 개략도. DSBR reporter substrate의 개략도적 표현(각 source plasmid 내 위치, main sequence feature 및 pathway-specific repair 후 최종 레이아웃 포함). 절제에 독립적인 MMEJ 기질 코어는 XhoI/HindIII로 분해하여 소스 플라스미드에서 절제된 후 MMEJ에 대한 기질을 생산하기 위해 양쪽 끝에 캡을 접합해야 합니다. 뭉툭한 NHEJ 리포터 기질은 EcoRV를 사용하여 소스 플라스미드를 절제하여 생성됩니다. 절제 의존성 MMEJ, 비평활 NHEJ, 긴 템플릿 HR 및 SSA 리포터 기질은 I-SceI(비응집성 말단 생성) 또는 HindIII(응집성 말단 생성)를 사용하여 소스 플라스미드의 선형화에 의해 생성됩니다. short template HR reporter substrate는 I-SceI(응집력 있는 말단 생성)을 사용하여 소스 플라스미드의 선형화에 의해 생성됩니다. 표적 DSBR 경로에 의한 각 리포터 기질의 복구는 기능성 NanoLuc을 인코딩하는 온전한 나노루시페라아제 ORF를 재구성합니다. 이 그림은 Rajendra et ^al.7에서 발췌한 것입니다. 약어: DSBR = 이중 가닥 파손 수리; 나노루크 = 나놀루시페라아제; MMEJ = 마이크로 호몰로지 매개 말단 접합; NHEJ = 비상동성 말단 접합; HR = 상동 재조합; SSA = 단일 가닥 어닐링; ORF = 열린 읽기 프레임. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 절제에 독립적인 MMEJ 리포터 기질의 제조(그림 1 그리고 그림 2A-씨)
   1. ssDNA/dsDNA 캡 준비(그림 2A)
      1. 표 2에 나열된 4개의 올리고뉴클레오티드를 어닐링 버퍼(분자 생물학 등급 물에서 20mM Tris pH 7.5, 50mM NaCl)에 개별적으로 재현탁하여 100μM에서 원액을 생성합니다.
      2. ss/dsDNA 캡의 어닐링
         1. 0.2mL 튜브에 1.1.1.1단계의 왼쪽 캡에 대해 길고 짧은 올리고뉴클레오티드(100μM 원액) 각각 50μL를 혼합합니다.
         2. 오른쪽 캡 올리고뉴클레오티드에 대해 반복합니다.
         3. thermocycler를 사용하여 각 올리고뉴클레오티드 혼합물을 99°C에서 5분 동안 배양한 다음 1°C/min에서 10°C로 낮춥니다.
            알림: 이렇게 하면 어닐링된 왼쪽 및 오른쪽 캡이 생성됩니다.
      3. (QC, 선택 사항) 전기영동에 의한 올리고뉴클레오티드 어닐링 검증
         1. 1.1.1.2 단계의 각 산물 100 ng를 1.1.1.1 단계의 개별 올리고뉴클레오티드 및 저분자량 DNA ladder와 함께 200V에서 200V에서 80분 동안 전기영동합니다.
         2. ssDNA와 dsDNA의 시각화를 위해 적절한 형광 DNA 염료가 포함된 TBE 러닝 버퍼로 겔을 최소 10-15분 동안 염색합니다.
         3. 겔 문서화 시스템에서 형광을 시각화합니다(그림 2A).
            참고: 1.1.1.3.1에서 1.1.1.3.3까지의 단계는 캡이 올바르게 어닐링되었는지 확인하는 데 사용됩니다. 왼쪽 캡과 오른쪽 캡의 겉보기 크기는 각각 ~120bp 및 ~175bp여야 합니다.
   2. 리포터 기판 코어의 정제(그림 2B)
      1. 리포터 코어 플라스미드 100 μg을 HindIII 4 μL 및 XhoI 4 μL(각 효소당 4 U/μg 플라스미드) 및 20 μL의 10x buffer와 혼합합니다. 이중 증류수(ddH₂O)로 총 부피를 200 μL로 만들고 37°C에서 2시간에서 밤새 배양하여 플라스미드를 분해합니다.
         참고: 더 많거나 더 적은 양의 분해를 위해 반응을 비례적으로 확장하십시오.
      2. 분해 반응을 80°C에서 20분 동안 배양하여 제한 효소를 가열 비활성화합니다.
      3. 40 μL의 알칼리 인산가수분해효소(2 U/μg 플라스미드)와 27 μL의 10x 완충액을 1.1.2.2단계의 반응 혼합물에 추가합니다. 37°C에서 2시간 동안 배양하여 플라스미드를 탈인산화합니다.
         알림: 필요에 따라 반응을 확대 또는 축소합니다.
      4. 1.1.2.3 단계의 반응에 6x 로딩 염료 60μL를 추가합니다. 형광 dsDNA 염색을 포함하는 1.5 % (w/v) agarose-Tris-Acetate-EDTA (TAE) 겔에서 2.5시간 동안 또는 밴드가 충분히 분해될 때까지 고분자량 DNA ladder와 함께 전기영동합니다.
      5. 겔 문서화 시스템에서 형광을 시각화합니다(그림 2B).
      6. 깨끗한 메스를 사용하여 겔에서 리포터 코어 조각(~1.5kb)을 절제하고 벡터 백본(~2.5kb)으로 오염되지 않도록 주의합니다.
      7. 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 리포터 코어 단편을 추출합니다.
      8. 분광광도계로 DNA 농도 및 품질(A_260/280)을 측정합니다.
   3. 리포터 기질 코어와 ssDNA/dsDNA 캡의 결찰 및 최종 리포터 기질 정제(그림 2C)
      1. 1.1.2.7 단계의 리포터 코어 단편 30 μg을 1.1.2 단계에서 어닐링된 각 좌우 캡 3.85 μL(캡:코어 DNA의 약 6:1 몰비), 30 μL의 10x 리가아제 완충액 및 1.5 μL의 T4 DNA 리가아제(20 U/μg DNA)를 혼합합니다. ddH₂O를 사용하여 반응의 총 부피를 300 μL로 만들고 16 °C에서 밤새 배양하여 캡을 리포터 코어 단편에 결찰합니다.
         알림: 필요에 따라 반응을 확대 또는 축소합니다.
      2. (QC, 선택 사항) 1.1.3.1 단계에서 생성된 생성물의 200ng를 리포터 기판 코어 및 고분자량 DNA 사다리와 함께 120V에서 최소 1.5시간 동안 형광 dsDNA 염색을 포함하는 0.7%(w/v) 아가로스-TAE 겔에 넣습니다. 결찰된 제품에 해당하는 대역이 결찰되지 않은 리포터 기판 코어보다 약간 느린 속도로 이동하는지 확인합니다(그림 2C).
         참고: 이 QC 단계는 리포터 코어 조각에 대한 캡의 결찰이 올바르게 이루어졌는지 확인하는 것입니다.
      3. 1.3.1 단계에서 분해 반응에서 DNA를 정제합니다. 선호하는 방법(예: 비드 기반 또는 컬럼 기반 방법)을 사용하여 제조업체의 지침을 따릅니다.
         참고: 정제 단계 1.1.3.3은 연결되지 않은 캡의 존재를 크게 줄입니다.
   4. 분광광도계로 DNA 농도 및 품질(A_260/280)을 측정합니다.
2. 뭉툭한 NHEJ 리포터 기판의 준비(그림 1 및 그림 2D,E)
   1. 리포터 코어 플라스미드 100 μg을 5 μL의 EcoRV (5 U/μg plasmid) 및 20 μL의 10x buffer와 혼합합니다. ddH₂O로 총 부피를 200 μL로 만들고 37 °C에서 2시간에서 밤새 배양하여 플라스미드를 분해합니다.
      참고: 더 많거나 더 적은 양의 분해를 위해 반응을 비례적으로 확장하십시오.
   2. 분해 반응을 65°C에서 20분 동안 배양하여 제한 효소를 가열 비활성화합니다.
   3. 1.2.2 단계의 반응에 50μL의 6x 로딩 염료를 추가합니다. 120V에서 2시간 동안 또는 밴드가 충분히 분해될 때까지 형광 dsDNA 염색을 포함하는 1.5%(w/v) agarose-TAE 겔에서 고분자량 DNA ladder와 함께 전기영동합니다.
   4. 겔 문서화 시스템에서 형광을 시각화합니다(그림 2D).
   5. 깨끗한 메스를 사용하여 겔에서 리포터 기판(~1.7kb)을 절제하고 벡터 백본(~2.6kb)으로 오염되지 않도록 주의합니다.
   6. 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 리포터 코어 단편을 추출합니다(그림 2E).
   7. 분광광도계로 DNA 농도 및 품질(A_260/280)을 측정합니다.
3. I-SCEI 기반 리포터 기판 준비(그림 1)
   참고: 이러한 기판에는 절제 의존성 MMEJ(그림 2F), 비평활 NHEJ(그림 2G), 긴 템플릿 HR(그림 2H), 짧은 템플릿 HR(그림 2I) 및 SSA(그림 2J)가 포함됩니다.
   1. 리포터 코어 플라스미드 100 μg을 50 μL의 I-SceI (5 U/μg plasmid) 및 60 μL의 10x buffer와 혼합합니다. ddH₂O로 총 부피를 600 μL로 만들고 37 °C에서 2시간에서 밤새 배양하여 플라스미드를 분해합니다.
      참고: 더 많거나 더 적은 양의 분해를 위해 반응을 비례적으로 확장하십시오. Non-blunt NHEJ, resection-dependent MMEJ, long template HR 및 SSA plasmids는 HindIII로 절단할 수 있으며, 이는 상보적인 응집성 말단을 생성합니다.
   2. 분해 반응을 65°C에서 20분 동안 배양하여 I-Sce I을가열 비활성화합니다. HindIII가 분해에 대신 사용된 경우 이 단계에서 온도를 80°C로 설정합니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 선호하는 방법(예: 비드 기반 또는 컬럼 기반 방법)을 사용하여 단계 1.3.2의 비활성화된 분해 반응에서 DNA를 정제합니다.
   4. 분광광도법으로 DNA 농도 및 순도 A_260/280)을 측정합니다.
4. 리포터 기판의 품질 관리
   1. 120V에서 2시간 동안 또는 밴드가 충분히 분해될 때까지 형광 dsDNA 염색을 포함하는 0.7%(w/v) 아가로스-TAE 겔에서 고분자량 DNA ladder와 함께 리포터 기판 200ng를 전기영동합니다. 원래의 uncut reporter plasmid를 대조군으로 함께 로드합니다.
   2. 각 리포터 기판에 대해 올바른 크기의 정의된 대역이 관찰되는지 확인합니다(표 1 및 그림 2F-J 참조).

그림 2: DSBR 리포터 기판 생성의 겔 전기영동 분석. (A-C) 절제 독립적 MMEJ 리포터 기판 생성에 필요한 중간체 및 최종 구성물의 겔 전기영동 분석의 대표 이미지. 패널 (A) 및 (C) 의 인접 이미지는 동일한 겔에서 가져온 것입니다. 관련 없는 차선은 생략되었습니다. (D,E) source plasmid, EcoRV-digested products 및 gel-extracted final construct에 대한 gel 전기영동 분석의 대표 이미지는 blunt NHEJ reporter substrate의 생성에 필요합니다. (F-J) I-SceI-digested reporter 기질에 대한 소스 플라스미드 및 선형화된 DSBR 구조체의 겔 전기영동 분석의 대표 이미지: 절제 의존성 MMEJ, 비평활 NHEJ, 긴 템플릿 HR, 짧은 템플릿 HR, SSA. 약어: DSBR = 이중 가닥 파손 수리; MMEJ = 마이크로 호몰로지 매개 말단 접합; NHEJ = 비상동성 말단 접합; HR = 상동 재조합; SSA = 단일 가닥 어닐링. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. DSBR 리포터 기판의 과도 transfection

참고: 분석의 실험적 워크플로우에 대한 개요와 일부 잠재적인 순열은 그림 3에 요약되어 있습니다. 아래 프로토콜은 HEK-293 세포를 사용한 실험을 설명하며, 이 세포는 리포터 기질로 역형질주입됩니다. 아래 숫자는 플레이트당 사용할 웰의 수에 따라 확장하거나 축소할 수 있습니다. 다음 단계는 하나의 96웰 플레이트에서 수행된 분석에 대해 계산됩니다. 추가 고려 사항에 대해서는 토론을 참조하십시오.

그림 3: DSBR 리포터 분석을 위한 실험적 워크플로우. 관심 세포는 linearised DSBR substrate(특정 DNA 복구 이벤트를 통해 복구해야 하는 NanoLuc ORF에 대한 코딩) 및 Firefly plasmid(transfection control)로 transfection합니다. 그런 다음, transfection 6-24시간 후에 Nano-Glo Dual-Luciferase 시약을 첨가한 후 Firefly 발광 및 NanoLuc 발광을 순차적으로 판독할 수 있습니다. 핵심 단계(연한 파란색 상자 안에 표시)에 대한 순열의 예는 유전적 조절(knockout, knockdown 또는 과발현) 또는 약리학적 치료가 세포의 DSBR 경로 숙련도에 어떤 영향을 미치는지 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 약어: DSBR = 이중 가닥 파손 수리; 나노루크 = 나놀루시페라아제; WT = 야생형; KO = 녹아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. (선택 사항) 리포터 분석에 대한 화합물의 영향을 평가하는 경우, 차량에 용해된 화합물(예: 디메틸 설폭사이드[DMSO])을 사전 정의된 실험 레이아웃에 따라 96웰 플레이트의 웰에 분주합니다. 모든 유정에서 차량 집중도를 정상화합니다.
   참고: 기술 복제가 권장됩니다. 컨트롤 웰(control well)을 포함합니다(예: 차량 전용).
2. 1.5mL 튜브에서 1.1, 1.2 또는 1.3단계에서 생성된 Firefly control plasmid(control luciferase) 및 NanoLuc DSBR reporter substrate(reporter luciferase)를 500μL의 transfection buffer에 희석합니다. 1 × 10⁶ cells당 0.66 μg의 control luciferase plasmid를 사용합니다. 사용할 NanoLuc DSBR 리포터 기판의 수량은 표 3 을 참조하십시오.
   참고: 리포터 루시페라아제를 구성적으로 발현하는 positive control plasmid는 기기 설정 및 transfection 조건을 검증하거나 리포터 루시페라아제 자체에 대한 비특이적 효과를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 시작점으로 1 × 10⁶ cells당 0.1 μg의 리포터 루시페라아제 플라스미드와 0.66 μg의 대조군 루시페라아제 플라스미드를 권장합니다.
3. 2.2단계에서 희석된 DNA에 제조업체의 권장 비율(예: 재료 표에 설명된 시약의 경우 1:2, μg DNA:μL 시약)로 지질 기반 transfection 시약을 추가하고, 짧게 볼텍싱하여 잘 혼합한 다음 실온에서 10분 동안 배양합니다.
4. 트립신화로 세포를 채취하고, 10% 소 태아 혈청(FBS)이 함유된 신선한 배지에 재현탁하고, 계수합니다.
5. 3 × 10⁶ 세포를 15 mL 튜브에 옮기고 8.5 mL의 배지에 재현탁시킵니다.
6. 2.3단계의 DNA transfection mix를 세포 현탁액에 넣고 inversion으로 여러 번 혼합합니다.
7. 웰당 80μL의 셀 현탁액(약 2.7 × 10⁴ 셀)을 플레이트합니다.
   참고: 세포 및 DNA transfection 혼합물을 함유한 현탁액은 수동으로 피펫팅하거나 고처리량 실험을 위해 자동 액체 핸들러를 사용하여 플레이트에 분주할 수 있습니다.
8. 37 °C/5% CO₂ 에서 24시간 동안 배양합니다.

3. 발광 감지

1. 시약의 준비
   1. 두 루시페라아제(각각 Furimazine 및 5'-Fluoroluciferin)에 대한 기질을 제공하는 리포터(NanoLuc) 및 대조군(Firefly) 루시페라아제 시약의 준비 및 추가에 대한 제조업체의 지침을 따르십시오.
   2. 대조군 루시페라아제 시약을 준비합니다. 제조업체의 지침에 따라 재구성하고 루시페라아제 기질이 완전히 용해될 때까지 반전으로 혼합합니다.
   3. 제조업체의 지침에 따라 신선한 리포터 루시페라아제 시약을 준비합니다. 80 μL/well을 추가하고 1:100 비율로 적절한 부피의 분석 완충액에 기질을 추가하는 데 필요한 시약의 양을 계산합니다(luciferase substrate:buffer). 하나의 96웰 플레이트의 경우 88μL의 루시페라아제 기질을 8,800μL의 완충액에 희석하고 반전으로 혼합합니다.
      알림: 이러한 수량에는 약 10%의 초과분이 포함됩니다. 재구성이 완료되면 대조군 루시페라아제 시약은 향후 사용을 위해 제조업체의 지침에 따라 보관할 수 있습니다. 리포터 루시페라아제 시약은 각 용도에 맞게 신선하게 준비해야 합니다.
2. control 및 reporter luciferases에서 발광의 연속 검출(96-well plate)
   1. 플레이트와 루시페라아제 시약이 실온에 도달하도록 합니다.
   2. 웰당 80μL의 대조군 루시페라아제 시약을 추가합니다.
   3. 450rpm의 오비탈 셰이커에서 플레이트를 3분 동안 흔듭니다.
   4. 발광 플레이트 리더로 control luciferase 발광 신호를 측정합니다.
      참고: 580nm(80nm 대역 통과 필터)에서 방출 또는 웰당 총 발광을 읽습니다. 이 발광은 transfection 효율 및 세포 밀도의 척도로 사용되며 테스트 처리로 인한 세포 독성에 대해서도 알려줄 수 있습니다.
   5. 웰당 80μL의 리포터 루시페라아제 시약을 추가합니다.
      참고: 이 시약은 대조군 루시페라아제를 억제합니다. 또한 리포터 루시페라아제(reporter luciferase)의 기질도 포함되어 있습니다.
   6. 450rpm의 오비탈 셰이커에서 플레이트를 3분 동안 흔듭니다.
   7. 접시를 실온에서 7분 동안 그대로 두십시오.
   8. 발광 플레이트 리더로 리포터 lucifererase 발광 신호를 측정합니다.
      참고: 470nm(80nm 대역 통과 필터)에서 방출을 읽거나 웰당 총 발광을 읽습니다. 이 발광은 관심 DSBR 경로에 의해 수리된 리포터 기판의 양에 대한 정보를 제공합니다.
   9. 다운스트림 분석을 위해 발광 판독값을 내보냅니다.

4. 데이터 분석

1. 리포터 루시페라아제(NanoLuc) 발광 신호를 동일한 웰에서 발생하는 대조군 루시페라아제(Firefly) 발광 신호로 나누어 분석 신호를 계산합니다. 이 계산을 방정식 (1)과 같이 모든 웰에 적용합니다.
   (1)
2. control well에 대한 분석 신호의 평균을 계산합니다(예: 차량 전용).
3. 방정식 (2)를 사용하여 테스트 웰에 대한 분석 신호를 제어 웰 평균으로 정규화하여 웰당 수리(%)를 계산합니다.
   (2)
4. (선택 사항, 곡선 피팅) 여러 화합물 투여량을 테스트하는 경우 화합물 농도에 대해 계산된 Repair(%)를 플롯하고 비선형 회귀 모델을 사용하여 투여량-반응 곡선을 피팅합니다. 후속 EC₅₀ 보간에 이 곡선을 사용합니다.

Results

각 리포터 분석의 수리는 동일한 절차를 사용하여 검출하고 정량화할 수 있습니다. 세포의 동족 복구 경로에 의한 기질의 올바른 복구는 NanoLuc을 인코딩하는 온전하고 기능적인 ORF를 재구성합니다. 이 발광 신호는 플레이트 리더를 사용하여 감지할 수 있습니다.

Firefly luciferas아제를 인코딩하는 intact plasmid와의 co-transfection은 transfection control 역할을 합니다. 이 컨트롤은 두 가지 용도로 사용됩니다. 첫째, 유전적 또는 약리학적 수단에 의한 DSBR의 변조에 의해 방해받지 않아야 하는 NanoLuc 신호를 정규화하기 위한 표준을 제공합니다. 둘째, 세포주기 조절, 전사/번역에 대한 영향 또는 일반적인 독성과 같이 루시페라아제 신호에 영향을 미치는 off-target cellular perturbations의 징후를 제공할 수 있습니다.

NanoLuc와 Firefly의 비율은 수리의 대리 판독 값입니다. 발광 값은 동일한 웰 내에서 두 개의 루시페라아제 신호를 정규화하여 내보내고 분석할 수 있습니다. 유전적 섭동 연구(예: 야생형과 KO 또는 비표적 siRNA와 표적 siRNA 비교)의 경우, 복구는 일반적으로 부모 샘플(야생형 세포 또는 비표적 대조군 siRNA로 처리된 세포)로 정규화됩니다. 약리학적 조절의 경우, 화합물 처리된 샘플의 값은 차량 처리에 의해 생성된 값으로 정규화됩니다.

설명된 기자 스위트에 대한 완전한 검증이 최근에 발표되었습니다⁷. DSBR의 유전적 및 약리학적 조절의 특성을 보여주는 데이터가 그림 4에 나와 있습니다(⁷에서 수정). Polθ는 MMEJ의 주요 매개체이며 이 효소의 손실 또는 억제는 세포 MMEJ ^3,10을 특이적으로 제거하는 것으로 예측됩니다. Polθ를 암호화하는 유전자인 POLQ가^{knock-out 된} 세포주를 사용하여 11 절제-독립적 MMEJ 리포터 분석은 MMEJ가 실제로 거의 완전히 억제되었음을 보여줍니다. 구성 요소인 NanoLuc 및 Firefly 발광 신호의 평가는 관찰된 수리 결함이 Firefly 신호(대조군)가 교란되지 않는 동안 NanoLuc 신호(리포터 기판에 의해 인코딩됨)의 감소에 의해 주도됨을 보여줍니다(그림 4A-C). 이와는 대조적으로, 뭉툭한 말단 NHEJ 리포터를 사용한 NHEJ 숙련도 평가는 POLQ knockout이 리포터 기판의 수리를 방해하지 않는다는 것을 보여줍니다(그림 4D-F). 이러한 유전 데이터는 MMEJ 매개 복구에서 Polθ의 특정 역할을 뒷받침합니다. 이러한 관찰은 최근에 보고된 Polθ의 중합효소 도메인(그림 4G)의 매우 강력하고 특이적인 억제제인 ART558^12,13으로 약리학적으로 완전히 요약되며, 여기서 MMEJ의 적정 억제가 관찰되며, 이는 Firefly 신호가 아닌 NanoLuc의 특정 감소에서 비롯됩니다(그림 4H). 더욱이, 유전 데이터와 일치하게, NHEJ에 미치는 영향은 없다(그림 4I,J). 이러한 데이터는 이러한 리포터를 사용하여 DSBR 경로의 유전적 조절을 특성화하고 소분자의 세포 효능 및 표적/경로 특이성을 보여주는 방법을 강조합니다.

그림 4: MMEJ 및 NHEJ 리포터 신호에 대한 Polθ의 유전적 knockout 및 약리학적 억제의 효과. eHAP1 WT 및 POLQ^(-) 세포는 Firefly control plasmid와 (A-C) resection-independent MMEJ reporter 또는 (D-F) blunt end NHEJ reporter로 transfection했습니다. MMEJ 또는 NHEJ 복구의 비율은 Transfection 후 24시간 동안 DMSO 처리된 대조군으로 정규화된 Firefly 발광에 대한 NanoLuc 발광의 비율입니다. 데이터는 3개의 생물학적 복제± 대한 평균 SEM을 나타내며, 각 복제는 평균 8개의 기술적 복제입니다. HEK-293 세포를 Firefly control plasmid와 (G,H) resection-independent MMEJ reporter 또는 (I,J) blunt end NHEJ reporter로 transfection하고 Polθ polymerase inhibitor ART558로 처리했습니다. 수리 비율은 Firefly 발광에 대한 NanoLuc 발광의 비율로, transfection 후 24시간 동안 DMSO 처리된 대조군으로 정규화됩니다. (G) 및 (I)에서 개별 발광 신호의 억제 비율은 DMSO 처리된 대조군에 대해 계산되었으며 각각 (H) 및 (J)에 표시되었습니다. 데이터는 2개의 생물학적 복제의 평균 ± SEM을 나타내며, 각 복제는 평균 4개의 기술적 복제입니다. 이 그림은 Rajendra et ^al.7에서 발췌한 것입니다. 약어 : NanoLuc = Nanoluciferase; MMEJ = 마이크로 호몰로지 매개 말단 접합; NHEJ = 비상동성 말단 접합; WT = 와일드 타입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: RAD51 억제제 CAM833에 의한 HR 리포터 신호의 억제. (A) HEK-293 세포는 Long template HR reporter substrate, Firefly luciferase control plasmid로 transfection하고, RAD51 inhibitor CAM833¹⁴로 처리하였다. NanoLuc 및 Firefly 발광은 형질주입 후 16시간 후에 판독되었습니다. HR 수리 비율은 DMSO 처리된 대조군으로 정규화된 Firefly 발광에 대한 NanoLuc 발광의 비율입니다. 점선은 곡선 EC₅₀에서 HR 억제 및 CAM833 농도 백분율을 표시합니다. 데이터는 2개의 생물학적 복제의 평균 ± SEM을 나타내며, 각 복제는 평균 4개의 기술적 복제입니다. (B) (A)에서 개별 발광 신호의 백분율 억제는 DMSO 처리된 대조군에 대해 계산되었습니다. 점선은 3.33μM CAM833(EC₅₀)에서 NanoLuc 및 반딧불이 억제 비율을 강조합니다. CAM833 농도 ≥ 10μM에서 반딧불 신호의 감소는 고용량에서 화합물 독성을 나타냅니다. 그러나 반딧불 신호가 영향을 받지 않는 농도에서 NanoLuc 신호 감소가 관찰되며, 이는 CAM833이 표적 내 HR 억제를 유도한다는 것을 시사합니다. 이 그림은 Rajendra et ^al.7에서 발췌한 것입니다. 약어 : NanoLuc = Nanoluciferase; HR = 상동 재조합. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

리포터 기판		소스 플라스미드 (크기(kb), 저항)	DSB 생성			최종 리포터 기판의 예상 크기(kb)
절제술 독립적 MMEJ		4.0, 칸	캡 결찰을 통해 절제된 3' 꼬리			1.6
절제 의존성 MMEJ		6.5, 칸	I-SceI(비응집성), HindIII(응집성)			6.5
무뚝뚝한 NHEJ		4.3, 칸	EcoRV에 의한 플라스미드 절제 시 무딘 끝			1.7
무딘 NHEJ		6.7, 칸	I-SceI(비응집성), HindIII(응집성)			6.5
긴 템플릿 HR		9.2, 칸	I-SceI(비응집성), HindIII(응집성)			9.2
간단한 템플릿 HR		9.3, 앰프	SceI(응집력)			9.3
특수		칸 9.5	I-SceI(비응집성), HindIII(응집성)			9.5

표 1: 리포터 기질 플라스미드. 약어: DSB = 이중 가닥 끊기; MMEJ = 마이크로 호몰로지 매개 말단 접합; NHEJ = 비상동성 말단 접합; HR = 상동 재조합; SSA = 단일 가닥 어닐링; 칸 = 카나마이신; Amp = 암피실린.

시퀀스(5'-3')			공급 업체	정화	기능
5'[포스]TCGAGGACTTGGTCCAGGTT GTAGCCGGCTGTCTGTCGCCAGTCC CCAACGAAATCTTCGAGTGTGAAGACCAT			시그마	페이지	왼쪽 캡, 긴 올리고뉴클레오티드
5'[Phos]GCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCC			시그마	페이지	왼쪽 캡, 짧은 올리고뉴클레오티드
5'[Phos]AGCTTTATTGCGGTAGTTTTATTA 캅타아아아 GCCTCGGCGGCCAAGCTAGGCAATCC GGTACTGTTGGTAAAGCCACCATGG			시그마	페이지	오른쪽 캡, 긴 올리고뉴클레오티드
5'[Phos]CGAGGCCCACTGACTGCGTTA 갯아챠뱃타액트가타아아아			시그마	페이지	오른쪽 캡, 짧은 올리고뉴클레오티드

표 2: 절제술 독립적인 MMEJ 리포터 기질 생성을 위한 캡용 올리고뉴클레오티드. 약어: ssDNA = single-stranded DNA; dsDNA = 이중 가닥 DNA; MMEJ = 마이크로 호몰로지 매개 말단 접합; PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. 마이크로 호몰로지에는 밑줄이 그어져 있습니다.

리포터 분석	NanoLuc 리포터 기질 DNA(μg DNA/1x106 세포)	반딧불이 대조군 루시페라아제 플라스미드 (μg DNA/1x106 cells)
절제술 독립적 MMEJ	0.5	0.66
절제 의존성 MMEJ	1	0.66
무뚝뚝한 NHEJ	0.5	0.66
무딘 NHEJ	0.5	0.66
긴 템플릿 HR	1	0.66
간단한 템플릿 HR	2	0.66
특수	1	0.66

표 3: NanoLuc 리포터 기질 및 Firefly control luciferase 플라스미드(HEK-293, 96-well plate format)의 일시적 transfection에 대한 DNA 수량. 약어: MMEJ = microhomology-mediated end joining; NHEJ = 비상동성 말단 접합; HR = 상동 재조합; SSA = 단일 가닥 어닐링.

Discussion

여기에서는 4가지 주요 DSBR 경로(HR, NHEJ, MMEJ 및 SSA⁾⁷의 세포 숙련도를 측정하기 위한 염색체 외 발광 기반 리포터 제품군의 생성 및 구현을 위한 프로토콜에 대해 설명했습니다. 리포터 기질은 일시적인 transfection에 의해 세포에 도입될 수 있으며, 동족 세포 DSBR 경로와의 결합에 따라 재구성되는 NanoLuc 발광의 민감하고 견고한 플레이트 기반 판독을 사용하여 DSBR 활성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

리포터 기판 생성, 기판을 세포로 transfection, 데이터 해석의 여러 단계는 이러한 분석의 성공적인 실행에 매우 중요합니다. 리포터 기질을 생성하기 위해 표준 분자 생물학 기법이 사용되지만, 겔 전기영동으로 공정을 시각화하면 transfection 전에 기질의 최고 품질과 순도를 보장할 수 있습니다. 이러한 분석은 일시적인 transfection에 의존하기 때문에 이러한 방법에 대한 일반적인 고려 사항이 적용됩니다. 여기에는 seeding 밀도, transfection 조건(시약 및 DNA 수량 포함) 최적화, forward 및 reverse transfection 형식의 적합성 평가가 포함됩니다. 이러한 리포터 분석은 다양한 전기천공법 및 지방추출 프로토콜로 성공적으로 수행되었으며, 이러한 분석을 수행하기 전에 옵션을 완전히 탐색해야 합니다. 또한 NanoLuc 신호(리포터 기판)를 Firefly 신호(대조군)로 정규화하여 파생된 복합 복구 신호뿐만 아니라 구성 요소인 NanoLuc 및 Firefly 신호를 검사하는 데 주의를 기울여야 합니다. 아티팩트는 Firefly 신호의 변화에 의해 구동되는 비율에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어, 매우 특이적인 화합물을 사용하여 용량-반응 모드에서 억제를 평가하면 반딧불 신호를 교란하지 않고 적정 가능한 방식으로 NanoLuc 신호를 억제해야 하며, 이는 안정적으로 유지되어야 합니다(그림 4G,H). 그러나 Firefly 신호가 교란되는 경우에도 Firefly 신호가 영향을 받지 않는 투여 창을 식별하여 수리에 대한 유용한 영향을 결정할 수 있습니다(그림 5).

가장 자주 사용되는 DSBR 리포터 분석과 비교할 때 이러한 염색체 외 발광 기반 리포터 분석에는 몇 가지 뚜렷한 장점이 있습니다. DSBR 경로가 매우 보존되어 있기 때문에 세포 모델마다 세포 메커니즘이 다르더라도 분석은 여전히 DSBR 숙련도 및 경로 선택에 대해 보고할 수 있습니다. 이는 최적의 과도 transfection 조건이 사전에 확립되어 있는 한 사용자가 관심 있는 모든 모델에 대해 DSBR을 평가할 수 있도록 합니다.

나노루시페라아제를 리포터 유전자로 사용하면 DSBR 리포터 분석에서 전통적으로 사용되어 온 형광 옵션에 비해 이점이 있습니다. NanoLuc은 빠르게 성숙하며 플레이트 리더⁸을 사용하여 고감도로 발광을 감지합니다. 기질 복구 속도(리포터 기질이 바로 수리 가능한 DSB 말단이 있는 세포로 transfection됨)와 결합된 이 형식의 DSBR 리포터 분석은 산업용 약물 발견 캐스케이드의 일부로 소분자를 스크리닝하는 데 필요한 빠른 처리 시간과 정량적 견고성에 이상적입니다. 실제로, 우리는 최근에 Polθ 중합효소 도메인¹³의 소분자 억제제의 식별에 사용되는 디스커버리 캐스케이드에서 절제-독립적 MMEJ 리포터 분석의 구현에 대해 설명했습니다.

또한 DSBR의 유전적 및 약리학적 섭동에 대한 특정 질문을 해결하기 위해 리포터 분석을 유연하게 구현할 수 있습니다(그림 3). 예를 들어, 리포터 기질의 transfection에 앞서, 세포는 48-72시간 동안 관심 유전자에 대해 siRNA로 transfection할 수 있습니다. 대안적으로, DSBR 경로에 대한 유전자 과발현의 영향은 리포터 기질의 transfection보다 24-48시간 전에 plasmid transfection을 수행하여 테스트할 수 있습니다. 약리학 연구의 경우, 본 프로토콜은 이미 소분자의 사용을 표준 워크플로우에 통합할 수 있는 방법을 설명하고 있지만, 대체 형식에는 사전 배양 또는 세척과 같은 화합물 처리 체제의 변경이 포함될 수 있습니다.

transient transfection의 확장성은 또한 스크리닝 전에 reporter substrate의 batch transfection을 수행하는 대규모 스크리닝 접근법을 지원할 수 있습니다. 또한, transfection에서 판독까지의 분석 기간도 다양할 수 있습니다. 표준 지속 시간은 16-24시간일 수 있지만 일부 분석은 6시간⁷ 이내에 판독될 수 있습니다. 세포 생존력을 손상시킬 수 있는 작은 분자 또는 siRNA의 독성에 대한 우려도 분석 기간을 결정할 때 고려해야 합니다.

요약하면, 이 연구에서 요약되고 최근 간행물⁷ 에 자세히 설명된 분석법은 세포 DSBR 숙련도에 대한 빠르고 강력한 평가를 제공합니다. 이 성분은 매우 민감하고 적정이 가능하여 유전자 및 약리학적 연구에 모두 적용할 수 있습니다. 결정적으로, 리포터 기질은 일시적인 transfection에 의해 세포에 도입될 수 있기 때문에, 염색체 DSBR 리포터의 경우와 같이 안정적인 통합에 의해 특정 세포주에 국한되지 않고 관심 있는 모든 transfectable 세포 모델에서 활용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그러나 이러한 리포터 염색체 외 분석의 뚜렷한 한계는 게놈으로의 통합 부족으로 인해 DNA 복구의 생리학적, 염색질 맥락과 관련 조절 단서 및 조정을 완전히 요약하지 못할 수 있다는 것입니다¹⁵. 이를 위해 염색체 외 리포터 분석은 기존 DSBR 평가 방법을 보완하고 기초 연구와 약물 발견 모두에 적합한 리소스 툴킷을 확장합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x TBE 완충액	Thermo Fisher	AM9863
20% TBE-아크릴아미드 겔	Invitrogen	EC6315BOX
50x TAE 완충액	Fisher Scientific	BP13321
6x 겔 로딩 염료, 보라색	NEB	B7024S
96웰 흰색 플레이트(투명 바닥 및 뚜껑 포함)	Porvair	204012
Agarose	Cleaver Scientific	CSL-AG500
AMPure XP 비드	Beckman Coulter	A63881	의 비드 기반 정제용
	NEB	M0289L
CLARIOstar	BMG Labtech	430-101	플레이트 리더
Countess II 자동 세포 계수기	Thermo Fisher	AMQAX1000	세포 계수기
맞춤형 올리고뉴클레오티드:	Sigma-Aldrich	절	제술 독립적인 MMEJ 기질의 경우 맞춤형 주문. 표 2를 참조하십시오.
D300e	Tecan	30100152	DMSO 기반 화합물 디스펜서
D300e D4+ 카세트	Tecan	30097371	D300e 화합물 디스펜서용 대용량 카세트
D300e T8+ 카세트	Tecan	30097370	D300e 화합물 디스펜서용 저용량 카세트
디메틸 설폭사이드, 세포 배양 등급	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	화합물용 차량, 그림 4에 사용됨 및 그림 5
DSBR 기자 출처 플라스미드	Artios		요청 시 학계에 제공
EcoRV-HF 및 10x CutSmart 버퍼	NEB	R3195M
에탄올 절대	VWR	20821.365
태아 소 세럼	PAN-Biotech	P30-3031
GeneRuler 초저범위 DNA 사다리	Thermo Fisher	SM1211	저분자량 DNA 사다리
HEK-293 세포	ATCC	CRL-1573	프로토콜
HindIII-HF 및 10x CutSmart 완충액	NEB	R3104M
HyClone 분자 생물학 등급 수성	Fisher Scientific	10275262
I-SceI 및 10x Tango 완충액	Invitrogen	ER1771
Isopropanol	VWR	20842.33
JetPRIME 시약 및 완충액	PolyPlus	114-15	지질 기반 형질주입 시약
MegaStar 1.6	VWR	521-1749	15 또는 50 mL 튜브용 원심분리기
MEM Eagle	PAN-Biotech	P04-08056	HEK-293 세포용 배양 배지
마이크로플레이트 shaker	Fisherbrand	15504070	Microplate orbital shaker
MicroStar 17R	VWR	521-1647	1.5 또는 2 mL 튜브용 원심분리기
MultiDrop	Thermo Fisher	5840300	세포 또는 수성 시약 디스펜서
MultiDrop 표준 카세트	Thermo Fisher	24072670	Cassette for MultiDrop 시약 디스펜서
NanoDLR Stop & Glo Buffer and Substrate	Promega	N1630 또는 N1650	Reporter luciferase(NanoLuc) 시약은 반딧불이 발광을 소멸시키고 NanoLuc 발광을 검출합니다. Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay 시스템 키트의 일부
로, ONE-Glo EX Luciferase 분석 버퍼 및 기판	Promega	N1630 또는 N1650	Control luciferase(Firefly) 분석 시약으로 Firefly를 검출합니다. Nano-Glo Dual-Luciferase Reporter Assay 시스템 키트의 일부
PBS (칼슘 또는 마그네슘 제외)	PAN-Biotech	P04-36500
pGL4 Firefly 플라스미드 (또는 유사)	Promega	E1310 (또는 동급)	Firefly control plasmid
pNL1.1 NanoLuc plasmid (또는 유사)	Promega	N1091 (또는 equivalent)	NanoLuc control plasmid, 장비 설정 / 최적화 실험 조정
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28706
Quick-Load Purple 1 kb DNA Ladder	NEB	N0552S	고분자량 DNA 래더
아세테이트나트륨 (3 M), pH 5.5	Thermo Fisher	AM9740	QIAquick Gel Extraction Kit
SYBR Gold (10,000x)	Invitrogen	S11494	ssDNA 및 dsDNA의 시각화
SYBR Safe (10,000x)	Invitrogen	S33102	dsDNA 전용
T4 DNA 리가아제 및 10x 리가아제 버퍼	NEB	M0202L
Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282	세포 계수 중 생존력 측정용
Trypsin-EDTA 용액; 0.25% Trypsin 및 0.53 mM EDTA	Sigma-Aldrich	T4049-100ML
XhoI 및 10x CutSmart 버퍼	NEB	R0146M