방법 논문

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

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DOI:

10.3791/66986

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2024년 9월 27일

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1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University, 3Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 4Institute for Quantitative Health Science and Engineering, Michigan State University, 5Henry Ford Health, 6Transcode Therapeutics Inc.

이 논문에서

요약

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

초록

다형 교모세포종(GBM)은 치료법이 없는 원발성 뇌 악성 종양 중 가장 흔하고 공격적인 형태입니다. 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)은 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 있어 중요한 장애물입니다. 여기에 보고된 것은 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양 영역에 축적되어 페이로드를 전달할 수 있는 이미지 유도 산화철 기반 치료 전달 나노 플랫폼입니다. 이 25nm 나노 플랫폼은 Cy5.5 형광 염료로 표지되고 안티센스 올리고뉴클레오티드를 페이로드로 포함하는 가교 결합된 덱스트란 코팅 산화철 나노입자로 구성됩니다. 자성 산화철 코어는 생체 내 자기 공명 이미징을 통해 나노 입자를 추적할 수 있으며, Cy5.5 염료는 광학 이미징으로 추적할 수 있습니다. 이 보고서는 정맥 주사 후 orthotopically 이식된 교모세포종 종양에서 이 나노입자 플랫폼(MN-anti-miR10b라고 함)의 축적 모니터링에 대해 자세히 설명합니다. 또한 RNA 치료제의 임상으로의 번역을 방해하는 문제인 RNA 올리고뉴클레오티드의 생체 내 전달에 대한 통찰력을 제공합니다.

서론

다형성 교모세포종(GBM)은 사실상 치료법이 없는 최고 등급의 성상세포종입니다. 매년 약 15,000명이 교모세포종 진단을 받고 있으며, 평균 생존 기간은 약 15개월, 5년 생존율은 5%입니다1. 지난 수십 년 동안 치료 옵션을 발전시키기 위한 여러 노력에도 불구하고 예후가 미미하게 개선되었습니다. 현재 교모세포종에 대한 치료 표준은 가능한 경우 최대한의 외과적 절제술을 시행한 후 방사선 요법과 화학요법을 시행하는 것이다2. 선택된 화학 요법인 테모졸로마이드(TMZ)는 현저한 임상적 효능을 보여주는 것으로 밝혀진 교모세포종에 대한 최신 치료법이었습니다. 그러나 교모세포종 종양의 최소 50%는 TMZ 내성을 보인다3. 이러한 엄격한 치료 요법에도 불구하고 개선된 교모세포종 치료에 대한 임상적 필요성은 여전히 상당합니다.

교모세포종(GBM) 및 기타 뇌 관련 질환에 대한 치료제 개발은 혈액뇌장벽(BBB)의 선택적인 특성으로 인해 크게 방해받고 있습니다. BBB는 내피세포(endothelial cell), 주위세포(pericyte), 성상세포(astrocyte)로 구성된 생리적 장벽으로, 순환계와 뇌 사이에 반투과성막을 만들어 분자와 세포가 뇌로 자유롭게 들어가는 것을 제한한다4. BBB는 정상적인 생리학을 보호하고 뇌 항상성에 중요하지만, 많은 치료제가 뇌에 도달하는 것을 막아 교모세포종의 치료를 복잡하게 만듭니다. 교모세포종에 대한 치료제의 전달을 향상시키기 위한 노력은 나노입자 기반 전달 수단, 집중 초음파 약물 전달 증진 및 수용체 매개 약물 전달의 개발로 이어졌습니다 5,6.

나노 입자는 암을 포함한 수많은 질병에 대한 치료법을 개발하기 위한 유망한 매체로 부상했습니다. 교모세포종에서 이미징 및 치료 목적을 위한 나노입자의 적용은 다양한 나노입자 구조체를 사용하여 시도되었습니다 7,8. 전달의 생체 내 이미징과 함께 GBM에 약물을 전달하는 데 중점을 두고 제안된 접근 방식은 산화철 코어로 구성되고 안정성을 위해 덱스트란으로 덮인 자성 나노입자(MN)를 활용합니다. 이러한 나노 입자의 자기 특성은 자기 공명 (MR) 이미징으로 검출 할 수 있으며, 아미네이트 덱스트란 코팅에 대한 간단한 접합 화학은 RNA 분자, 추가 표적 부분 또는 이미징 부분 (예 : Cy5.5 근적외선 광학 염료)과 같은 치료 부분의 접합을 허용합니다 9,10. 이미징 기능 외에도 나노 플랫폼은 내인성 뉴클레아제로부터 올리고뉴클레오티드를 보호하여 치료제 전달을 개선함으로써 RNA 치료제의 반감기를 연장할 수 있습니다. 여기에서는 in vivo imaging으로 모니터링되는 치료용 올리고뉴클레오티드(MN-anti-miR10b라고 함)를 교모세포종에 전달하기 위한 이 나노 플랫폼의 응용 프로그램을 제시합니다. 이전에는 이 나노 플랫폼의 축적 능력이 시험관 내 교모세포에서 입증되어 종양 세포의 생존력이 크게 손실되었습니다11. 치료적 in vivo 연구를 수행하기 전에 동물 모델에서 이 nano 플랫폼을 GBM 종양에 대한 in vivo 전달을 입증해야 합니다. 이를 위해 orthotopic GBM 동물 모델을 제작하고, 구조체의 정맥 투여 후 in vivo imaging을 수행했습니다. 다음은 in vivo imaging 및 ex vivo microscopy에 의해 확인된 종양 영역의 축적을 보여주는 이러한 연구의 프로토콜입니다.

프로토콜

동물을 대상으로 하는 모든 절차는 Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 암컷 외래교배된 흉선성 누드 마우스는 생후 7주에 Jackson Labs(균주 #007850)에서 구입하고 착상 수술 전에 1주일 동안 적응하도록 허용했습니다. 마우스는 이식 당시 약 21-25g이었습니다. 반딧불이 루시페라아제를 발현하는 U251 세포는 Ana deCarvalho12 박사에 의해 생성되고 제공되었습니다.

1. 세포 배양 및 이식 준비

  1. D-포도당, L-글루타민 및 피루브산나트륨을 함유하고 37°C에서 5% CO2로 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 보충한 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 루시페라아제 표지된 인간 교모세포종 세포, U251 배양.
  2. 세포가 70% 밀도에 도달하면 37°C에서 1-2분 동안 0.25% 트립신/EDTA로 트립신화합니다. T-75 플라스크의 경우 2-4mL, T-175 플라스크의 경우 4-6mL를 사용합니다.
  3. 플라스크에서 세포가 분리된 후 보충된 DMEM을 2:1 비율로 사용하여 반응을 소멸시키고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 세포를 원뿔형 튜브로 옮기고 300 x g 에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.
  4. 상층액을 조심스럽게 흡입하고 세포 펠릿을 1x 인산염 완충 식염수(PBS)에 재현탁시킵니다. trypan blue 염색을 사용하여 혈구계로 세포를 계수하여 죽은 세포를 배제하고 살아있는 세포의 총 수를 계산합니다. 위에서 설명한 대로 세포를 다시 펠렛합니다.
  5. PBS에서 세포 펠릿을 1 x 108 cells/mL 농도로 재현탁시키고 두개내 이식을 위해 세포 현탁액을 얼음에 보관합니다.

2. 자유형 교정 종양 이식

참고: 이 프로토콜은 Irtenkauf et al. (Dr. Ana deCarvalho의 절차; Henry Ford Health Hermelin 뇌종양 센터)12. 모든 단계는 피험자와 연구자 모두의 안전을 보장하기 위해 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. 자유형 주입 방법을 사용하면 두개내 이식의 품질을 유지하면서 더 큰 샘플 크기를 얻을 수 있는 더 빠른 절차를 수행할 수 있습니다. 대안적으로, 입체탁스 장치를 사용하여 후술하는 것과 동일한 좌표에 종양을 이식할 수 있다.

  1. 누드, 흉선증 마우스의 무게를 측정하고 케타민/자일라진(100mg/kg/10mg/kg)의 마취액을 28G 주사기로 복강 내 주사합니다. 마우스를 가열 패드 위의 회수 케이지에 넣어 체온을 유지합니다. 페달 반사를 확인하여 마취를 확인합니다.
  2. 안과 연고를 바르고 케토프로펜(5mg/kg)을 28G 주사기로 피하 투여하고 귀에 펀치를 날립니다.
  3. 머리 꼭대기의 수술 부위를 70% 에탄올로 소독한 다음 베타딘 스크럽을 하고 3회 반복합니다. 그런 다음 머리 정중선 오른쪽에 작은 수술 가위로 5-7mm를 절개하고 미세한 집게로 피부를 수축시켜 두개골과 두개골의 봉합선을 노출시킵니다.
  4. 면봉으로 두개골을 문질러 골막을 제거하여 뼈에 접근할 수 있도록 합니다. 새 면봉을 사용하여 3% 과산화수소 용액을 바르고 뼈를 건조시킵니다. 새 면봉을 사용하여 과도한 과산화수소와 형성될 수 있는 거품을 닦아냅니다. 브레그마가 두개골에 보이고 뼈가 드릴링할 수 있을 만큼 충분히 건조될 때까지 이 단계를 3번 반복합니다. 충분히 건조한 두개골은 봉합 라인이 뚜렷하게 하얗게 변하고 시작 부위의 발적이 감소합니다.
  5. 브레그마와 관련하여 자로 -2.5mm 내측/외측 및 -1mm 전방/후를 측정하고 드릴 위치를 마커로 표시합니다. 마크가 올바른 위치에 있는지 확인하기 위해 드릴링하기 전에 다시 측정하십시오.
  6. 0.5mm 드릴 버가 있는 전기 미세 수술 드릴(11,000RPM)을 사용하여 이전에 표시한 두개골에 조심스럽게 구멍을 뚫습니다. 드릴 현장에 쌓일 수 있는 혈액이나 체액을 새 면봉으로 흡수하십시오.
  7. 33mm의 노출된 바늘 길이에 바늘 슬리브가 장착된 3G 마이크로리터 주사기를 준비합니다. 피펫으로 잠시 재현탁한 후 이전에 준비된 1 x 108 cell/mL cell suspension 5 μL를 끌어올리고 주입 용액에 기포가 없는지 확인합니다. 70% 이소프로판올 물티슈로 바늘과 바늘 슬리브 외부에 남아 있는 과도한 세포 현탁액을 조심스럽게 닦아냅니다.
  8. 바늘 슬리브가 바늘의 추가 삽입을 멈출 때까지 바늘을 드릴 부위에 수직으로 삽입합니다. 주입된 세포가 축적될 수 있는 공간을 만들기 위해 바늘을 약 0.5mm 조심스럽게 집어넣습니다.
  9. 1분에 걸쳐 세포 현탁액을 천천히 주입합니다. 전체 부피가 주입되면 주입 용액의 유출을 줄이기 위해 바늘을 1분 더 깊이 유지합니다. 그런 다음 바늘을 조심스럽게 집어넣으십시오.
  10. 깨끗한 면봉으로 주사 부위에 고인 액체를 닦아내고 본왁스를 바르고 구멍을 막습니다.
  11. 수의학 본드로 절개 부위를 봉합하고 건조시킵니다. 깨끗한 면봉으로 국소 리도카인을 진통제로 바릅니다.
  12. 완전히 회복되어 보행할 수 있을 때까지 마우스를 모니터링하십시오. 통증 관리를 위해 이식 후 2일 동안 케토프로펜(5mg/kg)을 피하로 투여합니다.

3. 나노입자 플랫폼 합성

  1. 앞서 설명한 바와 같이 나노 입자를 Cy5.5 및 올리고뉴클레오티드(anti-miR10b)와 합성하고 접합시킵니다11.

4. MN-anti-miR10b 투여

참고: 이 연구에서 주입은 이식 후 7일부터 6주 동안 일주일에 한 번 시행되었지만 다양한 주사 빈도에 대해 동일한 프로토콜을 사용할 수 있습니다.

  1. 마우스의 무게를 측정하고 마우스에 투여할 MN-anti-miR10b의 부피를 계산합니다. MN-anti-miR10b의 용량은 쥐 교모세포종 모델에서 20mg Fe/kg으로 투여됩니다. 예를 들어, 20g 마우스는 5mg Fe/mL MN-anti-miR10b의 80μL 투여량을 받습니다. 대조군 마우스는 이 투여 계획과 일치하는 동일한 양의 PBS를 받습니다.
  2. MN-anti-miR28b가 함유된 10G 주사기를 준비하고 주사액에 기포가 없는지 확인합니다.
  3. 인덕션 박스에서 1.5L/min 유속으로 유도를 위해 2%-4% 이소플루란, 유지 관리를 위해 1.5%-2% 미만으로 마우스를 마취합니다. 마우스를 노즈콘으로 이동하고 마취를 계속합니다. 마취 깊이를 확인하고 수의사 연고를 바릅니다.
  4. 70% 이소프로판올 물티슈로 꼬리를 소독하고 과도한 알코올을 건조시킵니다.
  5. 꼬리를 회전하여 측면 꼬리 정맥을 꼬리 위쪽에 배치합니다. 그런 다음 정맥을 조준하여 바늘을 꼬리에 삽입하고 플런저를 뒤로 당겨 진공을 설정합니다.
  6. 혈액이 주사기에 들어갈 때까지 바늘을 삽입하면 정맥에 성공적으로 진입했음을 나타냅니다.
  7. MN-anti-miR10b를 천천히 주입하고 완전 전달 후 바늘을 집어넣습니다. 출혈이 멈출 때까지 거즈로 주사 부위를 압박합니다.
  8. 노즈콘에서 마우스를 제거합니다. 완전히 회복되어 보행할 수 있을 때까지 마우스를 모니터링하십시오.
    참고: 나노 입자의 볼루스 투여는 호흡 곤란을 유발할 수 있습니다. 마우스를 주의 깊게 관찰하고 호흡 곤란의 징후가 있는 경우 즉시 가벼운 흉부 압박을 가하십시오.

5. In vivo bioluminescence 및 fluorescence 이미징

참고: In vivo bioluminescence 및 형광 이미징은 나노 입자가 주입되기 전과 주입 후 24시간 후에 In Vivo Imaging System(IVIS)에서 수행됩니다.

  1. Mg2+ 및 Ca2+가 없는 PBS에서 30mg/mL 농도로 멸균 여과된 D-루시페린을 준비합니다.
  2. IVIS 운영 소프트웨어를 열고 초기화를 시작하여 기계를 준비합니다. 시스템이 초기화되는 동안 Acquisition > Auto-Save To를 선택하여 이미지를 저장할 폴더를 선택하고 저장할 파일의 폴더를 정의합니다.
  3. 이미징 시점에서 마우스의 무게를 측정하고 150mg/kg의 용량으로 투여할 D-루시페린의 부피를 계산합니다. 직사광선으로부터 용액을 보호하기 위해 부피가 있는 28G 주사기를 준비합니다. 이 연구는 파종을 확인하기 위해 이식 수술 2일 후 이미징을 포함했으며, 주간 치료 직전에 임플란트 후 7일째부터 주간 이미징을 시작했습니다.
  4. 유도 챔버에서 1.5L/min 유속으로 유도를 위해 2%-4% 이소플루란, 유지를 위해 1.5%-2% 미만으로 마우스를 마취합니다. 마취가 끝나면 수술 부위가 더 이상 손상되지 않도록 마우스의 목덜미를 부드럽게 긁어내고 D-루시페린을 복강 내에 주입합니다. 마우스가 회복될 때까지 기다렸다가 이미징하기 전에 10분 동안 기다렸다가 생물 발광 신호가 발생하고 안정화될 수 있도록 합니다.
  5. 생물 발광 신호가 발생하는 동안 생물 발광 이미징을 위해 IVIS 스캐너를 준비합니다. 이미징 스테이지에 검은색 저형광 매트를 놓고 이미징할 피사체 수에 맞게 노즈 콘 어레이를 구성합니다.
  6. 소프트웨어에서 이미징 마법사를 클릭합니다. Bioluminescence Imaging(생물발광 이미징 )을 선택한 다음 Open Filter(필터 열기)를 선택합니다. 다음 화면에서 Imaging Subject and Field of View(이미징 피사체와 시야)를 선택합니다. IVIS는 이제 생물 발광 이미징을 위해 설정되었습니다.
  7. 이미징 3분 전에 이소플루란/산소 혼합물이 상자를 채우도록 하여 인덕션 상자를 프라이밍하기 시작합니다. 이미징 2분 전에 마취를 위해 마우스를 인덕션 상자에 넣습니다.
  8. 마취가 완료되면 이미징을 위해 마우스를 유도 상자에서 IVIS로 옮기고 각각을 엎드린 자세로 눕힙니다. 이미징 중 2% 이소플루란을 사용하여 유지 마취를 제공합니다.
  9. 마우스를 IVIS 스캐너에 넣었으면 Acquire Sequence를 클릭합니다. 최소 신호 임계값이 3,000 카운트인 자동 노출 설정을 사용하여 이미지를 촬영합니다. 생물발광 이미징은 루시페라아제 표지된 U251 교모세포종 세포의 국소화를 시각화합니다. 자동 노출은 사용자가 정의한 최대 길이인 5분까지 시야에서 가장 밝은 신호를 기반으로 계산된 노출 길이로 이미지를 캡처합니다.
    참고: 일반적인 마우스 케이지에는 파종이 일반적으로 균일하기 때문에 단일 이미지가 필요합니다. 하나 이상의 밝은 마우스가 있는 경우, 마우스를 제거할 수 있으며, 희미한 마우스로부터 신호를 더 잘 포착하기 위해 반복 획득을 취할 수 있습니다.
  10. 생물 발광 이미징 후 IVIS 설정을 변경하여 epi-fluorescence 이미징을 준비하고 형광 스캔을 수행합니다.
    1. Imaging Wizard에서 Fluorescence > Filtered Pair with Epi-Illumination을 선택합니다. 다음 화면에서 이미징할 프로브(예: Cy5.5)를 선택합니다. 이미징 피사체와 시야를 선택합니다. 이제 IVIS 스캐너가 이전 화면에서 선택한 프로브의 형광 이미징을 위해 설정되었습니다.
  11. 최소 신호 임계값이 6,000 카운트인 자동 노출 설정을 사용하여 이미지를 촬영합니다. Cy5.5 형광 이미징은 MN-anti-miR10b의 국소화를 시각화합니다. 자동 노출은 사용자가 정의한 최대 길이인 5분까지 시야에서 가장 밝은 신호를 기반으로 계산된 노출 길이로 이미지를 캡처합니다.
    참고: 형광 이미징은 대조군 PBS 주입 마우스에서도 1분 이상 노출되는 경우가 거의 없습니다. 처리된 마우스 간의 신호 편차가 작기 때문에 단일 이미지로 항상 충분합니다.
  12. 이미징 후 IVIS에서 마우스를 제거합니다. 마취 및 외래에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.

6. 생체 내 자기 공명 영상

참고: MR 이미징은 나노입자 주입 전과 24시간 후에 수행되며 광학 및 생물 발광 이미징을 받는 동일한 동물에서 수행할 수 있습니다.

  1. 1.5L/min 유속으로 유도를 위해 2%-4% 이소플루란, 1.5%-2% 유지 관리를 위해 1.5%-1.5% 미만의 유도 상자에 대상 마우스를 마취합니다. 마취가 완료되면 호흡 모니터링 풍선 위의 MRI 침대에 엎드린 쥐를 놓습니다. 노즈콘을 주둥이에 꼭 맞게 끼워 이미징 중 마취를 전달하고 안과 연고를 바릅니다.
  2. 바이트 바와 이어 바를 사용하여 스캔을 위해 머리를 고정하고 배치합니다.
  3. 윤활된 직장 온도 프로브를 설치하고 호흡 및 온도 모니터링이 작동하는지 확인합니다. 마우스 베드의 못을 코일의 구멍에 끼워 마우스 브레인 코일을 머리 위에 놓고 코일을 테이프로 제자리에 붙여 스캔 중 움직임을 줄입니다.
  4. 마우스 위에 작은 따뜻한 물 순환 패드를 놓아 마취된 상태에서 체온을 유지합니다. 물 간섭으로 인한 이미지 왜곡을 제한하기 위해 코일과 가열 담요 사이에 약간의 거리를 두십시오.
  5. 마우스와 이미징 베드를 스캔할 위치로 이동합니다.
  6. 수집 소프트웨어에서 Wobble 설정 단계를 시작하여 MRI 코일을 조정하고 일치시킵니다. MRI의 서비스 끝에서 코일의 조정 및 일치 노브를 사용하여 트레이스가 중앙에 위치하고(조정) 가능한 한 깊은(일치) 되도록 합니다.
  7. 3면 로컬라이저 스캔을 획득하고 필요한 경우 뇌를 자석의 등중심에 배치하도록 이미징 베드를 조정합니다.
  8. 반복 시간(TR) = 2500ms, 에코 시간(TE) = 25ms, 시야(FOV) 20 x 20mm, 18개의 코로나 슬라이스, 0.2mm 슬라이스 갭, 150 x 150μm 평면 내 해상도, 0.5mm 슬라이스 두께.
  9. Mapshim 유틸리티를 사용하여 국소화된 shim을 계산하기 위해 전체 뇌의 B0 맵을 획득합니다. 그런 다음 3D T2 가중 이미지를 사용하여 TR = 30ms, TE = 10ms, FOV 20 x 15 x 12mm, 분해능 100μm 등방성으로 나노 입자를 시각화합니다.
  10. 2D T2 가중 이미지를 종양에 대한 위치 스캔에 대한 참조로 사용하여 추가 나노 입자 이미징을 위한 T2* 맵을 획득합니다. TR = 800 ms, TE = 3.5 ms. FOV 20 x 20 mm, 5개의 코로나 슬라이스, 슬라이스 갭 없음을 사용합니다. 평면에서의 해상도 평면에서 100μm. 5 ms 에코 시간 간격으로 10개의 포지티브 에코 이미지를 획득합니다.
  11. 이미징 시퀀스 전반에 걸쳐 호흡과 체온을 모니터링하고 필요한 경우 이소플루란과 수온을 조정합니다.
  12. 이미징 후 MRI 스캐너에서 마우스를 제거하고 가열된 회수 케이지에 넣습니다. 마우스가 마취 및 보행에서 완전히 회복될 때까지 모니터링합니다.

7. Ex vivo bioluminescence 및 형광 이미징

  1. in vivo imaging과 유사하게 IVIS에서 ex vivo bioluminescence 및 fluorescence imaging을 수행합니다. 위에서 설명한 대로 IVIS 초기화 및 스캔 설정 단계를 수행합니다.
  2. 실험 종점에서 마우스의 무게를 측정하고 150mg/kg의 용량으로 투여할 D-루시페린의 부피를 계산합니다. D-루시페린을 투여하고 앞서 설명한 대로 주사 후 10분 후에 실시간 이미징을 수행합니다.
  3. 최종 생체 내 생물 발광 및 형광 이미징 후 마취 상태에서 자궁 경부 탈구로 쥐를 신속하게 안락사시키고 쥐를 절개하고 뇌를 포함한 주요 장기를 페트리 접시에 채취합니다.
  4. 절제된 장기가 있는 Petri 접시를 IVIS 스캐너에 놓고 in vivo 이미징과 동일한 획득 설정을 사용하여 생물 발광 및 형광 양식으로 장기를 이미징합니다.
  5. OCT가 완전히 하얗게 될 때까지 OCT의 표본이 있는 냉동 두드를 긴 겸자가 있는 얕은 액체 질소 풀로 천천히 내려 OCT에서 추가 분석에 필요한 모든 장기를 급속 동결합니다. OCT의 기포가 발생하므로 액체 질소가 액체 OCT에 닿거나 금형을 너무 빨리 내리지 않도록 하십시오. 냉동 시료는 -80 °C에서 보관하십시오.
  6. 종양이 있는 뇌를 OCT에 보관하고 냉동 절개를 위해 급속 동결합니다. 분석에 필요할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

8. 형광 현미경 검사

  1. 냉동 절개를 위해 냉동 유지 장치를 준비합니다. 챔버와 시편 헤드 온도를 -15 °C에서 -20 °C 사이로 설정합니다.
  2. OCT의 급속 냉동 뇌를 -80°C 보관에서 꺼내 저온 유지 장치 챔버 안에 넣습니다. 절단하기 전에 샘플을 챔버 온도(-20°C)로 데우십시오.
  3. 한쪽 날 면도기를 사용하여 주사 부위의 뇌를 관상동맥으로 절개합니다. 이것은 일반적으로 뇌 표면에 보조개로 보입니다. 소량의 OCT를 사용하여 샘플을 표본 디스크에 장착하여 절단할 뇌의 절단면을 배치합니다. 시료의 안정적인 장착을 보장하기 위해 챔버 내부의 냉각된 무게로 충분한 압력을 가하십시오.
  4. 절단을 준비하기 위해 장착된 샘플과 시편 디스크를 시편 헤드 위로 이동합니다. 20μm 절편을 취하여 원하는 깊이로 조직을 자르고 샘플의 각도를 조정하여 조직을 가능한 한 조직과 수평이 가깝게 절단합니다.
  5. 원하는 조직 깊이에 도달하면 저온 유지 장치를 조정하여 샘플의 5 - 7 μm 절편을 취합니다. 현미경 슬라이드의 충전된 면을 섹션 위로 빠르게 내려 마우스 ID, 조직 절편 및 슬라이드 번호와 같은 설명이 미리 표시된 유리 슬라이드에 섹션을 장착합니다.
  6. 신선한 4% 파라포름알데히드(PFA)를 만드십시오. PFA 용액에 티슈가 있는 슬라이드를 15분 동안 담가 티슈를 고정합니다. 고정 후 DPBS로 슬라이드를 3번 헹굽니다.
  7. 유리 슬라이드의 이제 고정된 조직 섹션에 세포핵을 염색하는 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)을 포함하는 장착 매체 40μL 방울을 추가합니다. 24mm x 50mm 유리 커버슬립을 장착 미디어 위에 조심스럽게 놓고 전체 조직이 장착 미디어에 싸여 있는지 확인합니다.
  8. DAPI(359 nm에서 방출(em), 457 nm에서 여기(ex)) 및 Cy5.5(예: 683 nm, em 703 nm) 형광 현미경을 사용하여 조직을 시각화합니다.

결과

MN-anti-miR10b는 앞서11에서 설명한 바와 같이 합성되고 특성화되었다. MN-anti-miR10b의 투과 전자 현미경은 나노 플랫폼의 형태와 다분산성을 보여줍니다(그림 1B). 이 나노 플랫폼은 평균 크기가 25.12 ± 0.34nm이고 제타 전위는 13.18 ± 1.47mV입니다(그림 1C, D). 이 연구에서, 누드 흉선성 마우스는 위에서 설명한 프로토콜에 따라 U251 인간 교모세포종 세포를 orthotopically 이식했습니다. MN-anti-miR10b의 전신 정맥 주사는 20mg Fe/kg에서 수행되었습니다. 마우스는 안락사시켰고, 나노약물의 최종 투여 후 7일 후에 조직을 채취하였다. MN-anti-miR10b 주입 마우스의 Cy5.5 형광 및 생물 발광 신호는 명확한 공동 국소화(그림 2A,B)를 보여 나노 입자가 종양에 전달되었음을 나타내는 반면, 대조군 마우스는 형광 신호를 나타내지 않았습니다. Ex vivo 형광 이미징은 간 및 신장과 같은 주요 청소 기관에서 나노 입자의 국소화를 보여주었으며, 이는 이러한 유형의 나노 입자에 대해 예상됩니다(그림 2C). 별도의 연구에서는 위와 같이 마우스에 교모세포종(GBM) 세포를 orthotopically 이식하고 in vivo MR imaging을 실시했습니다. T2 * 가중 이미지 및 T2 * 맵은 나노 입자의 투여 전과 20 mg Fe / kg의 단일 투여 후 24 시간 후에 얻었다. T2 가중 MRI 신호의 특징적인 감소는 MRI 조영제로서 MN-anti-miR10b가 혈액-뇌장벽을 통과하고 종양 영역에 축적될 수 있는 잠재력을 보여줍니다(그림 3). in vivo imaging에 이어 형광 현미경을 사용하여 나노 입자가 종양에 전달되는지 추가로 확인했습니다. 상술한 바와 같이, 조직을 절편하고 DAPI 염색을 이용하여 현미경 검사를 위해 준비하였다. Cy5.5 형광 신호가 종양 부위에 표시되어 전달을 확인했습니다(그림 4).

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그림 1. MN-anti-miR10b의 특성화. (A) MN-anti-miR10b의 개략도 구조. 나노 플랫폼은 덱스트란으로 덮인 산화철 코어로 구성되며, Cy5.5 광학 염료로 라벨링되고, 치료용 올리고뉴클레오타이드(anti-miR10b)와 결합됩니다. BioRender.com 로 만들어졌습니다. (B) MN-anti-miR10b의 투과 전자 현미경. (C) 상기 구조체의 유체역학적 크기는 25.12 ± 0.34 nm이다. (D) MN-anti-miR10b의 제타 전위는 13.18 ± 1.47 mV입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2. 교모세포종 모델의 In vivo 및 ex vivo 연구.(A) In vivo bioluminescence imaging(왼쪽)과 fluorescence imaging(오른쪽)은 종양 영역에서 자성 나노입자 신호의 공동 국소화를 보여줍니다. (B) 절제된 뇌의 생체 외 생물 발광 및 형광 이미징은 신호의 공동 국소화를 확인합니다. (C) 장기의 생체 분포는 주요 청소 기관에 대한 축적을 보여줍니다. B: 뇌; H: 심장; Lu: 폐; Li: 간; S: 비장; K: 신장; M: 근육; (모든 그룹의 경우 n=6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3. 생체 내 교모세포종 모델의 MRI. T2* 가중(윗줄) 및 T2* 는 MN-anti-miR10b의 주입 전(왼쪽) 및 주입 후 24시간 후(오른쪽)에서 얻은 이미지(하단)를 매핑합니다. 주입 후 이미지에서 신호 강도의 감소는 산화철 축적(n=3)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4. 종양 조직의 생체 외 형광 현미경 검사. 대표적인 현미경 이미지는 나노 입자 축적을 보여줍니다. 파란색 - DAPI, 마젠타 - Cy5.5. 눈금 막대 = 100 μm; (모든 그룹의 경우 n=6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

BBB에 걸쳐 나노 입자의 축적을 검증하는 다양한 방법에 걸친 몇 가지 중요한 단계는 프로토콜의 성공에 결정적인 역할을 할 수 있습니다. 교모세포세포의 정형외피(orthotopic) 이식을 시작으로, 뼈를 건조시킨 후 두개골의 봉합선이 보이도록 하는 것이 중요합니다. 이는 종양 세포의 정확한 배치에 도움이 됩니다. 두개골을 뚫으려면 드릴 부위에 가벼운 압력을 가하고 뼈에 얕은 인상을 남기기 위해 드릴을 시작하는 것이 가장 좋습니다. 초기 표시가 만들어지고 올바른 위치에 있으면 드릴 미끄러짐을 최소화하면서 드릴링이 더 쉬워집니다. 두개골을 뚫은 후에는 즉시 드릴링을 중단하여 뇌 손상을 최소화하십시오. 나노 입자 및 기타 제제를 정맥 주사하는 동안 잠재적으로 치명적인 정맥 공기 색전증을 피하기 위해 주입 용액에 기포가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라 꼬리 정맥으로 성공적으로 진입하는 몇 가지 지표는 혈액이 주사기로 유입되는 것과 바늘 끝 주위의 꼬리 정맥에서 색이 사라지는 것입니다. 절제된 조직의 체외 생물 발광 및 형광 이미징의 경우, 생체 발광 신호가 시간이 지남에 따라 감소하기 시작하므로 신속하게 작업하는 것이 가장 좋습니다. 생물발광 신호 동역학은 세포주마다 다를 수 있으므로 특정 모델을 이해하는 것이 중요합니다.

특정 단계는 나노 입자 국소화 검출을 돕기 위해 수정할 수 있습니다. in vivo bioluminescence 이미징 중에 종양 세포 주입 및 종양 성장 속도의 변화로 인해 bioluminescence 신호의 차이가 발생할 수 있습니다. 특정 상황에서 BLI 신호가 가장 높은 마우스는 스캔의 노출 시간을 단축하여 다른 마우스에서 감지되는 신호를 감소시킬 수 있습니다. 이 경우 BLI 및 FLI 공동 국소화를 위해 마우스가 동일한 위치에 유지되도록 형광 스캔을 계속하는 것이 좋습니다. 그런 다음 초기 BLI 스캔에서 신호를 보인 마우스를 제거한 후 생물 발광을 위해 다시 이미지화합니다. 이로 인해 이러한 저신호 마우스를 기반으로 노출 시간 계산이 이루어지고 궁극적으로 종양이 검출됩니다. in vivo 형광 이미지를 촬영하는 동안 꼬리 정맥 주입으로 인한 잔류 나노 입자 존재로 인해 높은 형광 신호를 가질 수 있는 꼬리를 검은 종이로 덮음으로써 신체의 나노 입자 국소화를 더 잘 확인할 수 있습니다. 유사한 추론에서, 장기의 생체 외 형광 스캐닝 중에 뇌를 이미징하는 것만으로도 뇌 및 종양 영역에서 나노 입자의 국소화를 더 잘 보여줄 수 있습니다. 이는 망상내피계 장기에 나노 입자가 축적되어 신호 감지를 모호하게 할 수 있기 때문입니다.

치료용 RNA 전달을 위한 이 방법의 한계는 체내 나노입자의 전신 분포입니다. 다른 모든 전신 주사의 경우와 마찬가지로 치료제는 간, 신장 및 비장과 같은 장기에 의해 혈류에서 제거되어 궁극적으로 관심 영역으로의 나노 입자 전달을 감소시킵니다. 이 문제를 해결하기 위해, MN-anti-miR10b는 체내 순환 시간을 증가시키기 위해 가교 결합된 덱스트란 코팅으로 합성되었다13. 나노입자 구조를 최적화하여 순환 시간과 축적을 늘리려는 노력에도 불구하고, 특정 모델 및 질병 상태에 따라 종양 영역에 상당한 축적을 위해 나노입자를 여러 번 주입해야 할 수 있습니다.

교모세포종에서 치료용 분자를 전달하는 것은 매우 선택적인 BBB로 인해 상당한 도전이 됩니다. 많은 연구에서 나노 입자 기반 전달 차량을 테스트했으며, 이는 궁극적으로 크기와 전하 5,6,7로 인해 BBB의 침투에 비효율적입니다. 여기에 설명된 25nm 나노입자 구조체인 MN-anti-miR10b는 이 생리적 장벽을 통과하여 전신 주입 시 종양 부위에 축적될 수 있습니다. 이 나노입자 플랫폼은 RNA 분자가 교모세포종으로 전달되는 것을 매개할 수 있는 잠재력을 가지고 있으며 이미징을 사용하여 전달 수단의 축적을 모니터링할 수 있습니다. 산화철 나노 입자의 생체 분포는 예상되는 패턴을 따르며, 여기서 청소를 위해 망상 내피 시스템 기관에 축적됩니다. 이미징 또는 치료 목적으로 사용되는 유사한 나노 입자에 대해서도 유사한 생체 분포가 보고되었습니다. 중요한 것은 이러한 이전 연구에서 주요 장기에서 관련 off-target 독성의 징후가 없었다는 것입니다., 심지어 30 mg Fe/kg14,15의 투여량에서도.

이 나노입자 플랫폼 시스템의 장점은 비침습적 축적 추적이 가능한 in vivo 이미징 기능입니다. 덱스트란 코팅에 접합된 Cy5.5 근적외선 형광 염료는 신속한 광학 이미징을 통해 그 존재를 감지할 수 있습니다. 이러한 양식 외에도 MN-anti-miR10b의 초상자성 산화철 나노입자 코어는 이 구조를 MRI 조영제로 적합하게 만들고 테라노스틱스(theranostics)16의 개발 영역을 나타냅니다. MRI의 해부학적 해상도와 산화철 나노입자 대비는 나노입자가 뇌에서 축적되는 위치를 정확하게 보여줄 수 있습니다. 이 두 가지 방식을 함께 사용하면 나노 플랫폼의 전임상 in vivo 추적을 통해 BBB를 가로지르는 RNA 또는 기타 페이로드의 전달을 모니터링할 수 있습니다.

공개 사항

Z.M.과 A.M.은 TransCode Therapeutics Inc.의 공동 창립자이자 주주입니다. 나머지 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구를 위한 자금은 Henry Ford Health Systems, Michigan State University Health Sciences Alliance, A.M. 및 A.D.에 대한 보조금으로 부분적으로 제공되었습니다. 미시간 주립 대학의 동물 연구를 감독하고 이 비디오를 승인해 주신 다니엘 R. 퍼거슨 박사님께 감사드립니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Athymic nude "J : NU"마우스Jackson LaboratoryRRID : IMSR_JAX : 007850면역 저하 마우스 모델
0.25 % TrypsinGibco25200-056
1.7 mL 마이크로 원심 분리기 튜브용 세포RN1700-GMT조직 수집
10 µ L, Neuros 주사기, 모델 1701 RN, 33 게이지, Point Style 4Hamilton65460-06종양 세포의 두개내 이식용 주사기
3M Vetbond3M1469SB수술 부위 폐쇄용 조직 접착제
4% 파라포름알데히드 Thermo ScientificJ199943-K2조직 고정 용액
70% 이소프로포일 알코올 와이프CardinalMW-APL종양 이식 및 꼬리 정맥 주입을 위한 국소 소독 와이
Aperio VersaLeica염색된 조직 단면 슬라이드 스캔용
Betadine SurgicalScrub Purdue6761815101종양 이식
용 국소 소독제BioSpec 70/30Bruker자기 공명 영상 스캐너
Bone WaxMedlineDYNJBW25이식 부위 밀봉용 뼈 왁
Micro drillF.S.T.19007-05종양 이식을 위해 두개골에 구멍을 뚫는 데 사용되는 드릴 버
DAPI Fluoromount-GSouthernBiotech0100-20DAPI 염색
Dulbecco를 포함하는 조직 장착 매체 s DMEM(Modified Eagle Medium)Gibco11995-065U251
Extra Fine Graefe FoundpsF.S.T.11150-10종양 이식 용 Sugical 도구
태아 소 혈청Corning35-010-CVU251 미세 가위 용 세포 배양 배지 보충제
- 날카로운 10.5cmFST14060-10종양 이식 용 Sugical 도구
Glydo (Lidocaine)Sagent673-76수술 부위 용 국소 진통제
이상적인 마이크로 드릴CellPoint Scientific67-1200A종양 이식을 위해 두개골에 구멍을 뚫는 데 사용되는 드릴
인슐린 주사기 1CC 29G X 1/2 "Becton, Dickinson324704D-Luciferin 주입 및 꼬리 정맥 주입 용 주사기 나노 입자
이소플루란코베트루스11695067772마취
이소플루란 기화기솜니 사이언티픽VS6002마취 장치
IVIS SpectrumCT 생체 내 이미징 시스템PerkinElmer/Revvity128201생물 발광 및 형광 이미징 스캐너
IVISbrite D-Luciferin 칼륨 염PerkinElmer/Revvity122799-100MG생물 발광 이미징용 기질
Ketaset (Ketamine)Zoetis10004027종양 이식 수술용 마취제
Ketofen (Ketoprofen)Zoetis10004031종양 이식 수술용 진통제
Leica CM1950 LeicaCM1950OCT 내장 샘플의 동결 절편용
PBSGibco14190-144U251
페니실린-스트렙토마이신Gibco15140-122배양 배지용 항생제
MWI 수의학27505종양 이식 중 보호를 위한 안과 연고
RulerF.S.T.18000-30임플란테이션을 위한 드릴 사이트를 측정하는 데 사용됨
Tissue-Tek Cryomold  중간 15 x 15 x 5 mmSakura4566수집 조직 샘플 수집용 금형
Tissue-Tek O.C.T. 화합물Sakura4583조직 샘플 수집을 위한 동결 화합물
U-251 MG 세포주 인간Millapore Sigma9063001인간 교모세포종 세포주
Xylazine 주사 용액, 100 mg/mlCovetrus1XYL006종양 이식 수술을 위한 마비
U251 배양 시약 DOT Scientific 프 스 용 버용 세포 배양 배지 U251 Puralube 수의사 연고용 세포 이식용 세포 배양 시약 및 세포 현탁액

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