정확도 향상을 위한 마우스 요역동학 기술 최적화

Summary

이 프로토콜은 털과 피부에 의한 소변 흡수를 방지하기 위해 시아노아크릴레이트로 피부를 방수하는 가이드를 제공합니다. 여기에는 접착제를 피부에 바르고, 방광 카테터를 이식하고, 깨어 있는 쥐에서 방광 측정 및 외부 요도 괄약근 전기 조영 기록을 위한 전극에 대한 지침이 포함되어 있습니다.

Abstract

깨어 있는 쥐의 요로 매개변수를 정확하게 측정하는 것은 특히 신경인성 방광 외상 후 척수 손상(SCI)과 같은 상태에서 하부 요로(LUT) 기능 장애를 이해하는 데 중요합니다. 그러나 생쥐에서 방광경 분석을 수행하는 것은 주목할 만한 도전 과제를 제시합니다. 생쥐가 기록 세션 동안 엎드려 제한된 위치에 있을 때 소변은 털과 피부에 흡수되는 경향이 있어 공극량(VV)이 과소평가됩니다. 이 연구의 목표는 깨어 있는 쥐에서 방광 측정 및 외부 요도 괄약근 전기검사(EUS-EMG) 기록의 정확도를 향상시키는 것이었습니다. 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 요도와 복부 주변에 방수 피부 장벽을 형성하여 소변 흡수를 방지하고 정확한 측정을 보장하는 독특한 방법을 개발했습니다. 결과는 시아노아크릴레이트를 적용한 후 VV와 RV의 합이 주입된 식염수 부피와 일관되게 유지되었으며 실험 후 습한 영역이 관찰되지 않았음을 보여주며, 이는 소변 흡수를 성공적으로 예방했음을 나타냅니다. 또한 이 방법은 외부 요도 괄약근(EUS)과 연결된 전극을 동시에 안정화하고, 안정적인 근전도(EMG) 신호를 보장하며, 깨어난 마우스의 움직임과 실험자의 조작으로 인한 아티팩트를 최소화했습니다. 방법론적 세부 사항, 결과 및 시사점에 대해 논의하고 전임상 연구에서 요역동학 기법 개선의 중요성을 강조합니다.

Introduction

소변의 저장과 배출은 방광과 외부 요도 괄약근(EUS)의 조정된 활동에 달려 있습니다. 신경인성 방광과 같은 일부 병리학에서는 방광 배뇨근과 괄약근이 모두 기능 장애를 일으켜 특히 외상성 척수 손상(^{SCI) 후} 심각한 방광 문제를 일으킬 수 있습니다1.

작은 설치류는 일반적으로 하부 요로(^LUT)의 전임상 기능을 연구하기 위한 실험 모델로 사용됩니다2. 충전 방광경법(FC) 및 EUS 근전도(EUS-EMG) 기록 기법은 방법 선택, 정확한 측정 및 결과 해석에 따라 정밀하고 객관적인 정보를 제공할 수 있습니다³. 요역동학 검사는 일반적으로 배뇨량(VV), 배뇨 효율(VE) 및 방^{광 용량4}을 평가하는 데 사용됩니다. VE는 방광이 얼마나 효과적으로 스스로를 비울 수 있는지를 측정합니다. 공극 부피를 공극 부피와 잔류 부피의 합(VV+RV)으로 나누어 계산합니다. 한편, 방광 용량은 VV(배뇨 중 배출되는 소변의 ^양)에 RV(배뇨 후 방광에 남아 있는 소변의 양)에 더하여 계산합니다5. 따라서 VV 및 RV의 측정은 다른 매개 변수를 추론하는 열쇠입니다.

요역동학 검사 중 마우스의 VV를 정확하게 측정하는 것은 다양한 과제를 제시합니다. 설치류의 소변은, 엎드린 자세로 물리적으로 제지될 때, 중력의 영향으로 인해 복부 복벽을 통해 아래쪽으로 빨려 들어가는 경향이 있다⁶. 이 현상은 복부 털과 피부에 의해 소변이 흡수되는 원인이 될 수 있으며, 이는 차례로 배설되는 소변의 양을 과소 평가합니다. 마우스에 의해 생성되는 소량의 소변을 고려할 때, 이러한 흡광도가 결과의 정확성에 미치는 영향은 훨씬 더 두드러진다⁷. 더욱이, SCI의 모델에서, VV는 배뇨근 괄약근 시너지아(detrusor sphincter dyssynergia, DSD)의 영향으로 인해 일반 마우스보다 낮은 경우가 많으며, 이는 누설점 압력 및 모피에 의한 소변 흡수의 위험을 증가시킨다⁸. 이러한 요인은 결과에 상당한 영향을 미칩니다. 따라서 생쥐의 말기 요역추학 연구에서 VV와 RV를 정확하게 측정하는 것이 매우 중요하다⁹. 현재 마우스 모델에서 소변량을 정확하게 측정하는 방법에 대해 출판된 문헌에 제공된 방법론에는 세부 사항이 부족합니다.

시아노아크릴레이트 접착제는 빠르고 효과적인 접착 특성으로 인해 인간 및 동물 모델의 외과 절차에 일반적으로 사용되는 접착제 유형입니다^10,11,12. 이 접착제는 피부에 도포할 때 강하고 유연한 결합을 형성하기 때문에 상처와 열상을 봉합하는 데 특히 유용합니다¹³. 또한, 털과 상처에 닿을 수 있는 소변과 습기에 대한 큰 장벽이 될 수 있다¹¹.

이 기사에서는 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 깨어 있는 마우스의 방광 분석 및 EUS-EMG 기록에서 정확한 결과를 얻을 수 있는 새롭고 비용 효율적인 기술을 개발했습니다. 이 방법은 방광 기능 장애의 근본적인 원인을 이해하고 LUT 장애에 대한 보다 효과적인 치료법을 고안하는 데 도움이 될 것입니다.

Protocol

동물 연구 프로토콜은 인디애나 대학교 의과대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 승인 코드: 21098MD/R/MSS/HZ 승인 날짜: 2021년 9월 29일.

1. 카테터의 준비

1. 30cm 폴리에틸렌 PE-30 튜브(.017인치 x .030인치)를 자릅니다. 라이터를 사용하여 튜브의 한쪽 끝을 플레어하여 화염에 닿지 않도록 하고 튜브가 적절하게 둥근 종 모양의 팁을 형성하면 라이터를 빼냅니다.
2. 3G 바늘의 약 4/25을 튜브의 다른 쪽 끝에 조심스럽게 삽입합니다. 1mL 주사기를 준비하고 멸균 0.9% NaCl로 채웁니다. 주사기를 25G 바늘에 연결합니다.
3. 식염수를 부드럽게 주입하여 바늘 끝이 적절하게 둥글고 바늘 끝에서 누출되지 않는지 확인합니다. 압력이 느껴지지 않고 식염수가 카테터를 통해 원활하게 흐르는지 확인하십시오.

2. 전극의 준비

1. 길이가 20cm 인 강선 2 개를 준비합니다. 강선을 잡고 코팅 영역의 양쪽 끝에 샌드 폴리시를 바르고 와이어의 5mm를 벗겨냅니다.
2. 25G 바늘을 가져 와서 와이어의 한쪽에 삽입하십시오. 와이어가 손상되지 않도록 바늘을 조심스럽게 삽입해야 합니다. 와이어의 벗겨진 부분을 후크처럼 구부립니다. 후크는 와이어를 EUS 근육에 연결하는 데 도움이 됩니다.
3. 땜납을 사용하여 핀을 스트라이프 와이어의 다른 쪽 끝에 부착합니다. 납땜은 핀을 와이어에 고정하고 강력한 연결을 보장하는 데 도움이 됩니다. 주석-납 납땜이 녹아 와이어와 핀을 덮을 때까지 가열해야 합니다.

3. 동물의 준비

1. Institutional Animal Care에 따라 동물 시설에 암컷 C57BL/6 마우스(생후 8주, 체중 18-20g)를 12시간 연암주기로 두고 물과 표준 식품 알갱이에 무제한으로 접근합니다.

4. 수술 중 마취

1. 동물을 2% 이소플루란과 순수한 산소(1L/분) 챔버에 넣습니다. 마스크로 옮기기 전에 음성 발가락 꼬집기 검사를 사용하여 동물의 완전한 마취를 확인하십시오. 확인이 완료되면 가스 상태를 마스크로 변경합니다.
2. 마취 마스크가 멸균 수술 필드의 적절한 위치에 고정되었는지 확인하십시오. 흡입 소형 마스크(2% 이소플루란이 포함된 0.8-1L/min)에 코를 두고 멸균 드레이프에 동물을 앙와놓고 마취를 계속합니다.

5. 수술 준비

1. 테이프로 동물의 팔다리를 고정하십시오. 전기 면도기를 사용하여 하복부와 요도 고기(생식기 부위) 주변의 털을 면도합니다.
2. 눈의 잠재적인 건조를 방지하기 위해 눈 연고를 바르십시오. 포비돈-요오드 용액을 사용하여 면도 부위를 준비하고 70% 에탄올로 용액을 닦아냅니다. 수술 부위에 멸균 드레이프를 씌웁니다.

6. 수술 절차

1. 방광 카테터 이식
   1. 수술용 현미경에서 Metzenbaum의 직선적이고 뭉툭한 가위를 사용하여 복부 골반 피부의 정중선에 1-2cm를 절개합니다. 정중선의 근막과 근육을 절개하여 절개 상처를 통해 방광을 노출시킵니다.
   2. 절개 상처를 통해 방광이 보이면 수술 부위를 명확하게 볼 수 있도록 필요에 따라 주변 장기나 조직을 집어넣습니다. 방광에 불필요한 조작이나 긴장이 가해지면 소변 누출이나 주변 구조물의 손상과 같은 합병증이 발생할 수 있으므로 주의하십시오.
   3. 블래더 돔을 잡고 테이퍼 팁 바늘이 있는 5-0 비흡수성 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 지갑 끈을 놓습니다.
   4. 마이크로 가위를 사용하여 지갑 끈 안에 작은 방광루를 만들고 소변이 나올 때까지 구멍을 뚫습니다.
   5. 카테터의 둥근 끝 끝을 잡고 구멍을 통해 삽입합니다. 튜브의 끝이 구멍을 통과하면 튜브 주위의 지갑 끈을 봉합합니다. 그런 다음 팁이 봉합사 아래에서 느껴질 때까지 튜브를 바깥쪽으로 부드럽게 당깁니다.
   6. 튜브의 다른 쪽 끝에서 식염수 1mL를 천천히 주입하여 방광을 팽창시킵니다. 카테터 주변에 누출이 있는지 확인하십시오. 누출이 있는 경우 추가 봉합사를 배치합니다.
   7. 식염수가 요도에서 나오면 식염수를 빼내어 방광의 감압을 제거합니다.
2. EUS 전극 주입(그림 1)
   1. 수술용 가위를 사용하여 복부 절개 부위를 골반저까지 확장합니다.
   2. 방광과 일직선상에 있도록 근육과 막을 음부관으로 이동시키고 요도와 외괄약근을 찾습니다. 장골과 중간 꼬리 혈관 및 음부 신경을 다치지 않도록 주의하십시오.
   3. 전극이 들어있는 바늘을 사용하여 요도 고기에서 1cm 떨어진 양측으로 피부를 찔렀습니다.
   4. 집게로 후크 팁을 조심스럽게 잡고 바늘을 피부에서 부드럽게 잡아당깁니다.
   5. 전극의 끝을 사용하여 EUS 근육을 양측으로 조심스럽게 연결합니다. 너무 깊게 펀칭하면 근육에 해를 끼쳐 소변이 누출될 수 있으므로 피하십시오.
   6. 3-0 비흡수성 모노필라멘트를 사용하여 골반과 복부 근육과 피부를 봉합합니다.
3. 피부 방수
   1. 전극이 나오는 피부에 시아노아크릴레이트 접착제를 얇게 바르고 전극을 제자리에 고정합니다.
   2. 시아노아크릴레이트 접착제를 요도 고기를 둘러싸고 복부와 봉합 부위까지 3cm 더 뻗어 바릅니다. 접착제와의 접촉을 피하려면 집게로 고기를 조심스럽게 잡으십시오.
   3. 0.5-10 μL 마이크로 피펫을 사용하여 촉진액을 빼내어 접착제를 건조시킵니다.
      주의: 촉진액은 가연성 액체입니다.
   4. 적절한 접착 반응을 보장하기 위해 촉진액을 첨가하십시오. 이렇게 하면 접착제를 더 빨리 건조시키고 단단히 고정하는 데 도움이 됩니다.
4. 요역동학 준비
   1. 길이, 너비, 깊이가 4.5cm인 역폴리스티렌 계량 보트를 준비합니다. 밑면이 4cm인 삼각형 모양으로 잘라 이 공간에 쥐의 요도 고기를 넣습니다. 소변을 모을 수 있는 공간 아래에 37mm x 24mm x 5mm의 일회용 기본 몰드를 놓습니다.
   2. 마우스를 엎드린 위치로 재배치하고 방독면이 장착된 맞춤형 플레이트 위로 조심스럽게 이동합니다.
   3. 요도 고기가 홈 내에 적절하게 위치했는지 확인하십시오. 쥐의 머리와 팔다리를 테이프로 부드럽게 고정하고 쥐가 완전한 의식을 회복할 때까지 플레이트를 가열 패드에 놓습니다(그림 2).
   4. 쥐가 완전히 깨어 있을 때, 즉 마취에서 회복된 후 최소 40분 후에만 방광 검사를 수행하십시오.

7. 방광경 검사 및 EUS-EMG 기록 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 주입 펌프를 설정하고 보정합니다.
2. 직경이 19.05mm인 20mL 주사기를 실온에서 멸균 0.9% NaCl로 채웁니다. 주입 펌프에 주사기를 고정합니다. 주입 속도를 0.01mL/분으로 설정합니다.
3. PE-30 튜브로 주사기를 3방향 커넥터의 한쪽에 연결합니다. 반대쪽에 있는 방광 카테터를 압력 변환기에 연결합니다. 방광 카테터를 연결하기 전에 모든 기포를 제거해야 합니다.
4. 압력 변환기를 마우스 블래더와 동일한 높이에 고정합니다. 압력 트랜스듀서는 증폭기를 통해 데이터 수집 시스템에 연결됩니다.
5. 접지선 후크 하나를 피부에 연결하고 다른 하나를 전극 커넥터 위치에 연결합니다. 소프트웨어에 압력을 기록하십시오.
6. 소프트웨어를 시작한 후 방광 내 압력(IVP) 및 EUS-EMG 신호를 확인합니다. 샘플 이름을 저장하고 시간을 설정합니다.
7. 펌프 주입을 시작합니다. 신호를 기록합니다.

Results

방광경 측정 및 EUS-EMG 활동 추적을 사용하여 데이터를 분석했습니다. 연속 방광경 분석 방법은 방광에 식염수를 주입하는 동시에 방광의 압력과 부피 변화를 측정하는 것입니다. VV를 측정하기 위해 0.4mL의 식염수를 0.01mL/분의 속도로 주입하고 캡에서 40분 동안 소변을 수집했습니다. PVR(post-void residual)은 카테터를 통해 식염수를 흡인하여 얻을 수 있습니다. 접착제가 없는 일반 마우스에서 VV와 RV의 합은 종종 0.4mL 미만이었습니다. 실험 후, 복부와 고기를 둘러싼 털은 소변의 흡수로 인해 젖어 있었습니다(그림 3A). 작은 모피를 덮기 위해 접착제를 얇게 바른 후 VV와 RV의 합은 0.4mL로 나타났으며 습한 영역이 없었습니다(그림 3B, C).

그 결과 방광 측정 추적은 최대 배뇨 방광 수축 압력(27.2cmH₂O), 수축 기간(16.26초) 및 수축 간격(4.48분)을 포함한 다양한 매개변수에 대한 자세한 분석을 제공했습니다. 동시에, 그림 4와 같이 생쥐에서 방광 내 압력과 EUS-EMG 신호를 잘 기록했습니다.

많은 마우스 요역동학 측정은 마취 하에 수행된다¹⁴. 이는 동물의 움직임으로 인한 전기 신호의 소음과 소변 손실을 줄이는 편리한 방법처럼 보일 수 있지만, 마취제가 소변 흐름에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 부정확하거나 신뢰할 수 없는 결과가 발생할 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요하다¹⁵. 따라서 깨어 있는 동물에서 요역동학 기록은 생리학적 상태에 더 가까운 결과를 얻기 위해 더 인기가 있습니다. 깨어 있는 동물에서의 요역동학 기록은 일반적으로 이소플루란¹⁶으로부터 40-50분의 회복 기간 후에 시작된다. 이 과정에는 쥐를 면밀히 모니터링하여 마취 없이 편안하고 편안하게 지낼 수 있도록 하는 것이 포함됩니다. 여러 실험을 통해 의식이 있는 마우스의 움직임이 요역동학 신호 ^5,14에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 누설점 압력, VV 및 VE⁽¹⁷)와 같은 특정 매개변수의 부정확한 측정이 발생할 수 있음이 관찰되었습니다. 그 결과, 보다 신뢰할 수 있는 요역동학 결과를 보장하기 위해 의식이 있는 쥐를 부분적으로 억제하는 방법을 구현했습니다. 그러나 제한된 구속에도 불구하고 의식이 있는 마우스는 마취에서 즉시 깨어날 때 여전히 어려움을 겪으며, 이는 또한 전극 후크와 EUS 사이에 박리 또는 불안정한 접촉을 유발할 수 있으며 EUS-EMG 신호에 상당한 노이즈를 생성할 수 있습니다. 그림 3B에서 볼 수 있듯이 이러한 아티팩트를 최소화하기 위해 피부의 출구 지점에 접착제로 전극을 고정하는 접근 방식을 취했습니다. 이 방법은 전극의 움직임과 전극이 생성할 수 있는 후속 아티팩트를 최소화하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다.

그림 1: 근전도 전극의 변위. 전극(노란색 별표)을 외부 요도 근육(EUS, 검은색 화살표)에 양측으로 이식합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 깨어 있는 마우스의 구속. 카테터와 전극을 이식한 후, 요역동학 기록 중 안정성을 위해 마우스를 플레이트에 고정했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 요역동학 기록 후 복부 및 육류 부위. (A) 복부와 생식기 부위에서 큰 젖은 부위(빨간색 점선으로 윤곽이 잡혀 있음)가 관찰되었습니다. (B) 건조하고 방수가 되는 복부 및 생식기 부위는 녹음 후 시아노아크릴레이트 접착제(빨간색 점선으로 윤곽이 잡힌)로 만들었습니다. (C) 요역동학 기록 중 고기에 형성된 소변 방울(노란색 화살표)이 피부와 털에 흡수되지 않고 오랫동안 방울로 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 깨어 있고 억제된 암컷 쥐에서 방광암 측정 및 외부 요도 괄약근 전기(EUS-EMG)의 대표적인 흔적. (A) 추적 A: 연속 방광조영술(CMG) 및 EUS-EMG(각각 상부 및 하부 미량)의 동시 기록. (B) 트레이스 B는 트레이스 A의 확장된 부분으로, 시간 척도가 다른 직사각형 상자로 표시됩니다. 배뇨 단계 동안, 간헐적 배뇨는 CMG 기록에서 방광 내 압력의 감소(상단 추적, 화살표)와 일치했으며, 이는 낮은 강장제 및 EUS-EMG 활성의 감소 기간(하단 추적, 화살표) 동안 발생했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 요역동학 기법은 깨어 있고 억제된 마우스에서 소변량과 EUS-EMG 신호를 측정하기 위한 개선된 절차를 설명합니다. 요도 및 복부 주변에 털이 있으면 소변을 흡수하여 VV 측정의 정확성을 방해할 수 있습니다. 요도와 복부를 둘러싼 털은 수술 전에 조심스럽게 면도되었지만, 이 부위와 피부에 남아 있는 작은 털은 여전히 소변을 흡수하여 기록 후 복부에 젖은 부분을 남겼습니다. 이 문제는 요도 고기와 주변 피부 사이의 거리가 매우 짧기 때문에 여성 설치류에서 특히 두드러진다¹⁸. 이 기법에서는 시아노아크릴레이트 접착제를 복부 및 주변 요도 피부에 도포하여 방수 피부 표면을 만들고 요역동학 기록 중에 소변량을 정확하게 평가하여 방광 기능을 더 잘 이해할 수 있도록 했습니다. 접착제는 정밀하게 도포되어 고기 주변과 그 근처의 피부를 덮었습니다. 접착제를 바르는 목적은 모피가 소변을 흡수하는 것을 방지하는 방수 장벽을 만드는 것이 었습니다. 접착제는 요도 고기가 뭉치거나 막히지 않도록 주의하면서 고르게 펴 바릅니다. 절차의 기록 된 결과는 VV와 RV의 합이 주입 부피에서 일정하게 유지되고 더 이상의 습윤 영역이 관찰되지 않았기 때문에 우리의 목표가 완전히 달성되었음을 확인했습니다. 측정의 정확성을 보장하기 위해 실험 후 방광을 확인한 결과 방광이 비어 있는 것으로 확인되었습니다. 방광을 확인하는 이 추가 단계는 소변 정체 가능성을 제거하여 주사기를 통해 빼낸 양과 실제 RV 양 사이에 불일치를 일으키기 때문에 매우 중요합니다.

이 방법은 한계가 있습니다 : 1) 종단 및 다중 시점 연구에 적합하지 않습니다. 2) 자유롭게 움직이는 마우스에는 적용할 수 없습니다. 3) EUS에서 전극이 분리되는 경우 복부를 열고 다시 설치하기 어렵습니다. 4) 시아노아크릴레이트 접착제는 사용 편의성과 효과로 인해 많은 수술 환경에서 유용한 도구이지만, 잠재적인 위험을 최소화하기 위해 신중하게 사용하고 적절한 안전 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다. 시아노아크릴레이트는 일반적으로 피부에 안전하지만 잦은 접촉은 피해야 하며 연구자는 적절한 개인 보호 조치를 취해야 합니다. 시아노아크릴레이트 접착제는 흡입 시 독성 증기를 방출할 수 있습니다. 이러한 증기를 흡입할 위험을 최소화하기 위해 연구원은 작업 환경에서 더 높은 수준의 습도를 유지하고 실내 환기를 최적화해야 합니다¹⁹. 특수 에어컨 필터를 사용하여 증기의 독성을 더욱 줄일 수도 있습니다.

전반적으로, 이 실험은 요역동학 기록 중 배뇨 측정의 정확성에 대한 중요한 통찰력을 제공했으며 주입 후 VV 및 RV의 총량에서 불일치를 유발할 수 있는 잠재적인 오류 원인을 식별하는 데 도움이 되었습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
가속기	BOB SMITH INDUSTRIES	BSI-152
시아노아크릴레이트	TED PELLA, Inc	14478
일회용 베이스 몰드	TED PELLA, Inc	27147-4
주입 펌프	Harvard Apparatus PHD ULTRA	70-3006
Isoflurane	Henry Schein Inc	1182097
PIN	World Precision Instruments	5482
폴리에틸렌 튜빙 30	Braintree Scientific Inc	PE30
멸균 계량 보트	HEATHROW SCIENTIFIC	797CK2
Windaq/Lite	DATAQ INSTRUMENTS	249022