심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

Summary

이 기사에서는 인간 플라즈마 유래 세포외 소포체(EV)의 분리, 특성화 및 정량화를 위한 방법론을 설명하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 EV 단백질체의 무표지 분석을 위한 워크플로우를 제시합니다.

Abstract

세포외 소포체(EV)는 세포 유래, 지질 이중층으로 둘러싸여 있으며 복제할 수 없는 나노 입자입니다. EV는 현재 심혈관 질환에 대한 귀중한 바이오마커 역할을 할 수 있는 세포 간 통신을 조절하는 역할로 인해 심혈관 연구에서 주목받고 있습니다. 그러나 EV 단백질체와 심혈관 진단에서 바이오마커로서의 잠재력은 여전히 잘 알려져 있지 않습니다. 이 프로토콜은 대형 대학 병원의 흉통 병동에 내원한 환자의 혈장 샘플을 사용하여 혈장 유래 EV의 분리 및 정량화와 단백질 화물을 분석하기 위한 표준화된 방법을 제시합니다. 일상적인 정맥 절제술 후 EV는 차등 초원심분리에 의해 혈장에서 분리됩니다. EV 분리물에서 특정 EV 마커 단백질의 농축은 면역 블로팅으로 시각화되며, 평균 크기 분포 및 혈장 EV 농도는 나노 입자 추적 분석을 통해 정량화됩니다. 마지막으로, 초고성능 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법은 EV 단백질체의 무표지 분석을 위해 사용됩니다. 따라서 이 프로토콜은 플라즈마 유래 EV를 중요한 생물학적 정보의 잠재적 운반체로 연구 및 사용하고 새로운 바이오마커로서의 잠재력을 탐구하기 위한 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.

Introduction

균일하게 정의되지 않은 명명법에 의해 세포외 소포체(EV)는 지질 이중층으로 둘러싸여 있고 다양한 세포 유형에 의해 방출되는 나노 입자로,¹을 복제할 수 있는 능력이 부족합니다. 이 다양한 그룹에는 엔도솜 기원의 EV의 하위 집단인 엑소좀이 포함되며, 일반적으로 직경이 약 40nm에서 160nm에 이릅니다². 수많은 체액^{3에서 검출}할 수 있는 EV는 단백질, mRNA, microRNA 및 지질과 같은 다양한 활성 생체 분자를 전달하여 세포 간 통신을 촉진합니다. 따라서 EV는 세포 특이적 표면 마커와 생체 분자를 통해 기원 세포에 대한 정보를 제공하며, 그 특성은 모 세포와 환경⁴의 상태에 큰 영향을 받습니다. 이러한 특성으로 인해 특히 심혈관 질환의 맥락에서 바이오마커로서 EV의 잠재적인 역할에 대한 관심이 높아졌습니다.

수많은 체외 및 생체 내 연구에서 심근 저산소 스트레스가 EV 방출을 증가시킨다는 사실이 입증되었습니다 ^5,6,7. EV 화물에 대한 현대 연구는 주로 다양한 심혈관 질환 진단에서 바이오마커 역할을 할 수 있는 잠재력을 가진 EV 결합 microRNA에 중점을 두었습니다 ^8,9,10. 반면, 순환하는 EV 단백질체에 대한 근거는 상대적으로 부족하며, 심혈관 환자에서 혈장 EV를 조사한 연구는 훨씬 더 적습니다. 심근경색을 앓고 있는 환자의 혈장 유래 EV에 대한 두 가지 포괄적인 연구에서 저자는 잠재적인 진단 관련성이 있는 특정 허혈 유발 EV 단백질체 프로파일을 확인했습니다 ^6,11.

EV의 방법론적 처리는 역사적으로 어려운 것으로 입증되었으며, 현재로서는 EV 분리, 특성화 및 정량화에 대한 최적의 접근 방식에 대한 확실한 권장 사항은 없습니다. EV 분리에 일반적으로 사용되는 방법에는 차등 초원심분리, 밀도-구배 원심분리 및 크기 배제 크로마토그래피¹과 같은 여과 방법이 포함됩니다. 현재 합의된 지침에 따르면, EV 분리물의 특성화에는 이미징 양식¹과 결합된 테트라스파닌 또는 아넥신과 같은 최소 3개의 일반적인 EV 표면 단백질 마커의 증거가 포함되어야 합니다. EV 화물을 단백질 수준에서 검사하기 위해 웨스턴 블롯 또는 ELISA와 같은 항체 기반 방법이 가장 많이 사용됩니다.

순환 EV의 분리 및 처리와 관련된 방법론적 문제를 감안할 때, 이 프로토콜은 환자 모집 및 샘플 수집에서 후속 EV 분리, 특성화 및 혈장 EV 분리에 이르는 포괄적인 경로를 제시합니다. 또한 이 연구는 독일 남서부의 3차 진료 센터의 응급실(흉통 병동)에 내원한 환자로부터 혈장 유래 EV를 즉시 분리하는 워크플로를 선보인 후 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 사용하여 질병 특이적 플라즈마 EV 단백질체를 무표지 분석합니다. 목표는 초기 진단과 질병 진행 및/또는 해결 전반에 걸쳐 다양한 허혈성, 선천성 또는 (자가)면역 심혈관 질환을 앓고 있는 대규모 환자 코호트에서 차등적으로 농축된 EV 결합 단백질을 식별하기 위해 고처리량 분석을 용이하게 하는 것입니다. 이 단백질체학 스크리닝 접근법은 심혈관 질환의 현재 진단 및 치료 모니터링을 강화하기 위해 새로운 EV 결합 단백질 바이오마커를 발견하는 것을 궁극적인 목표로 뚜렷한 질병 경로와 관련된 EV 특이적 단백질 농축 패턴을 식별하고자 합니다.

Protocol

이 프로토콜을 위해 명백하거나 기저가 있는 심혈관 질환의 징후가 없는 3명의 건강한 대조군 환자와 비ST 상승 심근경색(NSTEMI)이 있는 2명의 환자로 구성된 모범적인 환자 코호트를 모집했습니다. 하이델베르크 대학교 의학부 기관 검토 위원회(IRB 승인 #S-351/2015)에서 사전 승인을 받았으며 모집 전에 모든 환자로부터 서면 동의를 얻었습니다. 환자는 하이델베르크 대학병원 심장학과의 흉통 병동에서 초기 임상 증상, 병력 및 진단 검사 결과를 기반으로 모집되었습니다.

건강한 대조군 환자에 대한 포함 기준에는 비정형 또는 비특이적 임상 증상, 정상 범위 내의 심장 바이오마커 수준, 심혈관 질환 병력 없음, 추가 진단 검사에서 정상 소견이 포함되었습니다. 제외 기준에는 지난 5년 이내의 악성 종양 또는 종양 증식 요법 병력, 혈액 투석, 가족성 고지혈증 증후군 및 심혈관 질환 병력이 포함되었습니다. NSTEMI는 현행 가이드라인¹²에 따라 진단되었으며, 관상동맥 조영술로 혈역학적으로 관련된 관상동맥 협착증이 확인되었다. 각 환자에 대해 표준 정맥 절개술¹³을 통해 최대 36mL의 혈액을 큐큐부 전정맥에서 구연산염이 보충된 수집 튜브로 수집하고, 추가 처리를 위해 혈액 샘플을 즉시 4°C에서 운반했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 차동 원심분리를 사용한 EV 절연

참고: 인간 혈장 샘플에서 EV를 분리하기 위해 차등 원심분리 프로토콜이 사용되었습니다. 생성된 EV 펠릿의 순도를 최대화하기 위해 원심력이 증가하는 두 번의 초원심분리(UC) 사이클을 수행했습니다.

1. 플라즈마 격리
   1. 혈장 EV 무결성을 보장하기 위해 채취 후 120분 이내에 4°C에서 냉각된 전혈 샘플 처리를 시작합니다. 구연산염이 보충된 채혈 튜브(0.106 mol/L 구연산염)를 사용하여 응고를 예방하십시오.
   2. 구연산 전혈 9mL를 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)에 1:1로 희석하여 점도를 줄입니다. 원심분리 중 분리를 위해 5mL의 밀도 구배 배지(1.077g/mL)를 추가합니다.
   3. 600 × g 에서 4 °C에서 25-30 분 동안 원심 분리기. 각 컬럼 상단의 혈장 분획을 특수 원심분리 튜브에 조심스럽게 피펫팅합니다. 다음 단계로 진행하거나 -80 °C에서 동결하십시오.
2. 세포 파편과 세포사멸체(apoptotic body)의 제거
   1. 20,000 × g 의 플라즈마를 4°C에서 15분 동안 고정각 로터가 있는 초원심분리기를 사용하여 제동 없이 원심분리합니다. 세포 파편과 세포사멸체의 눈에 보이는 펠릿이 튜브 바닥에 형성되어야 합니다.
3. EV 절연
   1. 상등액을 새 튜브로 옮깁니다. 100,000 × g에서 4 °C에서 2시간 동안 제동 없이 초원심분리기를 사용하여 EV를 분리하여 튜브 벽에 눈에 띄는 펠릿을 형성합니다.
   2. 전자 피펫을 사용하여 상등액을 조심스럽게 피펫으로 분리하여 약 1mL의 EV가 고갈된 혈장을 남깁니다. 나머지 플라즈마에 대해 1000 μL 피펫으로 전환하고 EV 펠릿을 방해하지 않도록 천천히 피펫팅합니다. 피펫팅하는 동안 튜브를 서서히 기울여 튜브에 플라즈마가 남아 있지 않도록 합니다.
4. 다운스트림 분석을 위한 준비
   1. 다운스트림 분석 요구 사항에 따라 분리된 EV 펠릿을 재현탁합니다: 나노 입자 추적을 위해 200μL의 PBS에 9mL의 전혈에서 EV 펠릿을 재현탁합니다. LC-MS/MS의 경우, 1% 프로테아제/포스파타아제 억제제가 포함된 50μL의 1x RIPA 완충액에 36mL의 전혈에서 분리한 EV를 재현탁합니다.
   2. 재현탁된 EV 펠릿을 1.5-2mL 튜브로 옮깁니다. 추가 분석이 있을 때까지 -80°C에서 보관하거나 필요에 따라 진행하십시오.

2. 나노 입자 추적 분석

참고: 인간 플라즈마 샘플의 평균 EV 크기 분포 정량화는 나노 입자의 브라운 운동을 분석하는 레이저 기반 검출 방법인 NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)를 사용하여 수행되었습니다.

1. NTA를 위한 작업 희석
   1. EV 원액(200μL PBS에 재현탁된 EV 펠릿)을 1:10, 1:50, 1:100, 1:200의 비율로 얼음처럼 차가운 PBS로 희석합니다. 나노 입자 추적 중에 프레임당 10-100개의 나노 입자의 최종 개수를 달성하는 데 가장 적합한 희석을 결정하기 위해 다양한 작업 희석액을 생성합니다.
2. NTA 실행
   1. NTA 기기를 켜고 연결된 컴퓨터에서 해당 소프트웨어를 실행합니다. 챔버를 레이저 상자 안에 놓고 카메라 시작을 클릭하여 활성화합니다.
   2. PBS 1mL를 주사기에 넣습니다. 주사기를 전면 튜브에 꽂고 튜브 시스템을 철저히 세척하여 챔버에 공기가 남아 있지 않도록 합니다. 카메라를 모니터링하여 기포나 오염 입자를 감지합니다.
   3. 준비된 EV 작업 희석액을 1mL 주사기에 꺼내 챔버에 주입합니다.
   4. Capture(캡처) 및 Process(프로세스) 탭에서 모니터의 밝기와 일치하도록 Screen Gain(화면 게인)을 조정합니다. 카메라 레벨을 수정하여 화면에서 나노 입자를 명확하게 구별할 수 있습니다.
   5. Process 탭에서 적절한 Detection Threshold를 설정하여 배경 소음과 입자를 구별하기 위한 감도를 조정합니다. 동일한 실험 내의 모든 측정에 대해 이 값을 일정하게 유지합니다.
   6. 나노 입자가 화면에 선명하게 나타날 때까지 기기의 양쪽에 있는 휠을 사용하여 카메라의 초점을 맞춥니다.
   7. 브라운 운동은 온도에 따라 달라지므로 하드웨어 설정의 모든 측정에 대해 일정한 온도(이상적으로는 22°C)를 설정합니다.
   8. 실행 버튼을 클릭하여 측정을 시작합니다. 팝업 창에 시료 ID와 용매를 입력합니다.
   9. 각 샘플 실행에 대해 최소 3개의 30초 비디오를 녹화합니다. 나노 입자 용액의 대표 샘플을 캡처하기 위해 측정 사이에 샘플을 진행시킵니다. 주사기 펌프를 사용할 수 있는 경우 일정한 속도로 설정하고 지속적으로 기록하십시오.
   10. 기록 후 소프트웨어는 나노 입자의 농도와 크기 분포를 자동으로 계산합니다. Change 를 클릭하여 샘플에 사용된 희석 계수를 입력한 다음 Export를 클릭하여 결과를 저장합니다.
3. 데이터 분석
   1. 통계 소프트웨어 프로그램에서 출력 파일을 사용하여 결과를 분석합니다.

액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS)을 사용한 EV 단백질체의 무표지 분석

메모: Label-free EV 단백질체 분석은 멤브레인 용해 후 EV 단백질의 겔 전기영동을 통한 초기 단백질 분리를 사용하여 수행되었습니다. 트립신을 사용한 겔 내 단백질 분해 후, 펩타이드는 인간 단백질체 데이터베이스와 일치하는 개별 스펙트럼으로 LC-MS/MS를 사용하여 분석되었습니다. 특히, EV 용해물의 비표적 분석이 필요한 경우 특정 분자량 범위를 미리 선택하지 않은 샷건 단백질체학이 권장되므로 이 프로토콜의 3.1.1-3.1.7 단계가 필요하지 않습니다.

1. 인젤 트립신 분해
   1. 제조업체의 지침에 따라 Laemmli 로딩 버퍼를 추가하여 1x RIPA 버퍼에 재현탁된 EV 용액을 준비합니다( 재료표 참조). 샘플을 95°C에서 5분 동안 끓입니다.
   2. 로딩 버퍼가 보충된 EV 샘플을 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 위한 4%-12% Bis-Tris 겔에 단백질 래더와 함께 로드합니다¹⁴. Coomassie Blue로 겔을 1-4시간 동안 염색하여 단백질 띠를 시각화합니다. 밤새 배양하여 젤을 물로 얼룩을 제거합니다.
   3. 관심 단백질을 포함하는 겔 영역에서 Coomassie로 염색된 밴드를 메스 블레이드를 사용하여 절제합니다.
   4. 60μL의 1:1(v/v) 50mM 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액(TEAB) 및 아세토니트릴(ACN), pH 8.5로 10분 동안 젤 조각을 세척합니다. 60μL의 ACN에 겔 조각을 각각 10분 동안 3회 수축시킵니다. 60 μL 50 mM TEAB, pH 8.5로 다시 세척합니다.
   5. 57°C에서 100mM TEAB에 10mM 디티오트레이톨(DTT)을 10mM 디티오트레이톨(DTT)로 30분 동안 환원시키고 겔 조각을 탈수합니다.
   6. 어둠 속에서 20분 동안 25°C에서 100mM의 TEAB에 10mM 요오드아세트아미드(IAA)로 단백질을 알킬레이트합니다.
   7. 60μL의 100mM TEAB로 젤 조각을 세척하고 60μL의 ACN에서 각각 10분 동안 두 번 수축합니다.
   8. 그에 따라 농축된 50mM의 TEAB 트립신 용액을 건조 젤 조각에 추가합니다. 37 °C에서 4 시간 동안 배양합니다. 20μL의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 반응을 소멸시킵니다.
   9. 30μL의 1:1(v/v) 0.1% TFA 및 ACN을 30분 동안 배양하여 생성된 펩타이드를 추출합니다. 20μL의 ACN으로 20분 동안 겔을 탈수한 다음 30μL의 100mM TEAB로 20분 동안 다시 세척합니다.
   10. ACN 20μL로 겔을 각각 20분씩 두 번 수축시킵니다.
   11. 각 추출 단계에서 수집된 상등액을 진공 원심분리기에 농축하고 샘플을 15μL의 0.1% TFA에 용해시킵니다.
2. LC-MS/MS 분석
   1. 정전기 이온 트랩 분석기에 연결된 고분해능 액체 크로마토그래피 질량 분석기를 사용하여 나노 흐름 LC-MS/MS 분석을 수행합니다.
   2. 용매 A로 0.1% 포름산(FA)/1% ACN을 사용하고 용매 B로 0.1% FA/89.9% ACN을 사용합니다.
   3. 25분 선형 그래디언트로 펩타이드를 분리합니다: 3% 용매 B에서 시작하여 21분 동안 B를 23%로 증가시킨 다음 4분 동안 38%로 증가한 다음 95% B에서 세척을 진행합니다.
   4. 질량분석기를 데이터 종속 수집 모드에서 작동하여 MS와 MS2를 자동으로 번갈아 가며 사용할 수 있습니다. m/z 400에서 60,000의 해상도로 MS 스펙트럼(m/z 400-1600)을 획득하고, 정규화된 충돌 에너지 27과 1.4m/z의 격리 폭을 사용하여 최대 15개의 전구체에 대한 MS2 스펙트럼을 생성합니다.
3. 단백질 데이터베이스 검색
   1. Proteome Discoverer 2.5와 Sequest HT를 사용하여 Swiss-Prot Homo sapiens(UP000005640, 2020년 6월) 단백질 데이터베이스 및 맞춤형 오염 물질 데이터베이스(MaxQuant, MPI Martinsried ^15,16의 일부)에 대한 MS/MS 스펙트럼을 검색합니다.
   2. 프로그램 설정을 다음과 같이 구성합니다: fragment ion mass tolerance를 0.02 Da로 설정하고 parent ion mass tolerance를 5 ppm으로 설정합니다. 트립신을 소화에 사용되는 효소로 지정하고, 카르바미도메틸을 시스테인에 대한 고정 변형으로 설정하고, 산화(메티오닌) 및 탈아미드화(아스파라긴, 글루타민)를 가변 변형으로 설정합니다. 아세틸화(acetylation), 메티오닌 손실(methionine loss) 및 이들의 조합을 단백질 말단의 다양한 변형(variable modification)으로 포함합니다.
   3. 단백질 존재량 계산을 위해 Top N Average (n = 3) 방법을 사용하여 전구체 이온 정량화 모드를 사용하여 펩타이드를 정량화합니다¹⁷.

Results

EV는 확립된 차등 초원심분리 프로토콜을 사용하여 명백한 심혈관 질환이 없는 환자의 혈장 샘플(n = 3)과 비ST 상승 심근 경색(NSTEMI; n = 2) 환자로부터 분리되었습니다. 혈장 EV의 적절한 분리는 동일한 환자의 EV 고갈 혈장과 비교하여 EV 분리물에서 EV 농축 단백질 TSG-101, Annexin 5(Anx5) 및 CD9의 면역 블로팅에 의해 확인되었습니다(그림 1A). 음성 대조군 역할을 하는 트랜스페린은 EV가 고갈된 혈청 샘플에서 발견되었지만 EV 분리물에서는 검출되지 않아 구획의 적절한 분리를 확인했습니다. 분리된 혈장 샘플에서 일반적인 혈소판 마커인 인테그린 β3와 지단백질 오염 마커인 아포지단백 A1(ApoA1)에 대한 면역 블로팅은 혈액 처리 후 심각한 오염을 나타내지 않았습니다(보충 그림 1).

나노입자 추적 분석을 사용하여 브라운 운동을 기반으로 EV를 식별하고...

Discussion

이 프로토콜은 플라즈마 EV의 분리 및 특성화를 위한 즉시 사용 가능한 실제 단계별 방법론을 제공할 뿐만 아니라 일상적인 임상 실습에 통합하기에 적합한 표지되지 않은 단백질체 분석에 대한 소개를 제공합니다. 플라즈마 샘플에서 EV 분리를 위한 자세한 설명과 통합 방법론에 대한 엄격한 준수는 얻은 결과의 재현성을 보장하는 데 중요합니다. 현재 문헌에 따르면 사전 분석 조건은 EV 절연체의 후속 측정 및 다운스트림 분석에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 혈장 유래 EV 분리 프로세스를 적시에 시작하는 것이 중요하며, 이상적으로는 채혈 후 120분 이내에 시작하는 동시에 최소한의 동요로 샘플을 처리하는 것이 중요합니다¹⁸. 수집된 혈액의 단기 보존은 4°C에서 달성할 수 있습니다. 그러나 시간과 동요 외에도 낮은 온도는 혈소판 활성화를 촉진하여 혈소판 유래 EV의 방출로 이어질 수 있습니다^1...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4x Laemmli 시료 버퍼	Bio-rad	1610747
10x RIPA-Buffer	Abcam	ab156034
26.3 mL 폴리카보네이트 병(초원심분리용 캡 어셈블리 포함	) Beckman Coulter	355654
5810R 벤치탑 원심분리기	Eppendorf	5811000015
Acetonitrile (ACN)	Biosolve	0001204101BS
디티오트레이톨(DTT)	시그마-알드리치	43816-10ML
둘베코의 인산염 완충 식염수(PBS)	시그마-알드리치	D8537
포름산 99% ULC/MS 100	Biosolve	0006914143BS
히스토파크 - 1077	시그마-알드리치	10771
요오도아세트아미드(IAA)	시그마-알드리치	I6125-5G
질량분석기 Orbitrap Q Exactive HF	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
MOPS SDS 러닝 버퍼	Thermo Fisher	B0001
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300
Nanosight NTA 3.2 소프트웨어	Malvern Panalytical
누페이지 4  bis 12 %, Bis-Tris 단백질 겔	Invitrogen	NP0323
Optima XPN-80 플로어스탠딩 초원심분리기	Beckman Coulter	521-4180
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder	Thermo Fisher Scientific	26619
프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일 (100X)	Cell Signaling Technology	5872S
단백질 마커	Thermo Fisher	26616
Proteom Discoverer 2.5	Thermo Fisher
Q Exactive Plus 하이브리드 사중극자-Orbitrap 질량분석기	Thermo Fisher Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBDK
빠른 염색 coomasssie	Serva	35081.01
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 1.9 &마이크로; m 1 g	Dr. Maisch	r119.aq.0001
SDS-PAGE 상업용 젤	Thermo Fisher	NW00100BOX
S-Monovette  Citrat 9NC 0.106 mol/l 3,2%	Sarstedt	02.1067.001
Speed vac concentrator	Savant
Swiss-Prot (Uniprot) Homo sapiens (UP000005640, 2020년 6월) 단백질 데이터베이스	UniProt	https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640
Triethylammonium bicarbonate buffer (TEAB)	Sigma-Aldrich	T7408
Trifluoroacetic acid (TFA) HPLC >99%, 100mL	Sigma-Aldrich	302031-100ML
Trypsin MS 등급	Thermo Fisher	90058
유형 50.2 Ti 고정각 로터	Beckman Coulter	337901
UHPLC Dionex Ultimate 3000	Thermo Fisher Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Water	Biosolve	0023214102BS