방법 논문

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

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DOI:

10.3791/67125

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2024년 12월 13일

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1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2College of Dental Medicine, Division of Periodontics, Columbia University, 3Department of Pharmaceutical Sciences, University at Buffalo, The State University of New York

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 혈관 오가노이드는 인간 혈관 네트워크의 세포 유형 다양성과 복잡한 구조를 요약합니다. 이 3차원(3D) 모델은 혈관 병리학 모델링 및 체외 약물 스크리닝에 상당한 잠재력을 가지고 있습니다. 최근의 발전에도 불구하고 일관된 품질의 오가노이드를 재현성 있게 생성하는 것이 주요 기술적 과제로 남아 있으며, 이는 다운스트림 분석 및 응용 분야에 매우 중요합니다. 여기에서는 혈관 오가노이드 생성의 균질성과 재현성을 모두 향상시키는 수정된 프로토콜이 제시됩니다. 수정된 프로토콜은 배아체 형성 및 세포 생존을 개선하기 위해 마이크로웰과 CEPT 칵테일(크로만 1, 엠리카산, 폴리아민 및 통합 스트레스 반응 억제제, 트랜스-ISRIB)의 사용을 통합합니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 분화되고 성숙한 혈관 오가노이드는 전체 장착 3D 면역형광 현미경으로 특성화되어 형태 및 복잡한 혈관 구조를 분석합니다. 이 프로토콜은 확장 가능한 방식으로 고품질 혈관 오가노이드를 생산할 수 있도록 하여 잠재적으로 질병 모델링 및 약물 스크리닝 응용 분야에서 사용을 용이하게 할 수 있습니다.

서론

지난 10년 동안 오가노이드(organoid) 및 티슈온칩(tissue-on-a-chip) 시스템을 포함한 체외 미세생리학적 모델이 등장했습니다 1,2,3. 이러한 3차원(3D) 인간 세포 유래 시스템은 생리적 미세환경에 많은 구성 요소가 부족하고 종 간 유전적 차이와 같은 기존 2차원(2D) 세포 배양 및 동물 모델의 한계를 각각 해결합니다. 기존 모델보다 더 많은 생리학적 통찰력을 제공하고 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 더 적합합니다. 미세생리학적 모델 중 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)에서 유래한 오가노이드는 천연 인간 조직의 구조적 특징을 효과적으로 재현하는 것으로 입증되었으며 뇌 4,5, 신장6, 간 7,8 및 망막9를 포함한 다양한 인간 장기를 모방하도록 개발되었습니다. 여기에서는 특히 hiPSC에서 혈관 오가노이드 생성에 중점을 두고 서로 다른 오가노이드 샘플과 배치 간의 변동을 최소화하여 전반적인 재현성을 개선하는 것을 목표로 하는 간소화된 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

혈관은 모든 인체 장기에서 생리적 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 혈관 형성은 혈관 형성 및 혈관 형성 과정을 포함하며, 내피 세포와 벽화 (예 : pericyte 및 vascular smooth muscle cells) 세포 간의 상호 작용을 통해 조정되고 다양한 자극의 영향을받습니다10. Penninger, Wimmer 및 동료들은 이 두 가지 과정을 모방한 최초의 혈관 오가노이드 생성 방법11,12을 개발했습니다. 이 방법에서 생성된 오가노이드를 통해 그룹12 및 us13,14는 질병의 혈관 기능 장애를 모델링하기 위한 혈관 오가노이드의 잠재력을 입증했습니다. 예를 들어, 우리의 최근 연구13,14에서는 질병을 모방하는 혈관 오가노이드와 야생형 오가노이드 간에 혈관 발아 및 벽화 세포 구성 변화와 같은 뚜렷한 표현형이 관찰되었습니다. 이러한 예는 혈관 오가노이드 모델이 질병 관련 혈관 기능 장애를 모방하여 약물 스크리닝을 위한 플랫폼 역할을 할 수 있음을 강조합니다.

초기 혈관 오가노이드 생성 작업11,12를 기반으로 구축된 수정된 프로토콜은 동일한 오가노이드 생성 배치 내에서 종종 볼 수 있는 변동을 최소화하는 데 중요한 요소인 균질한 배아체(EB) 형성을 촉진하기 위한 마이크로웰의 사용을 포함하는 것으로 제시됩니다. 또한 크로만 1, 엠리카산, 폴리아민 및 통합 스트레스 반응 억제제(trans-ISRIB)15의 조합인 CEPT 칵테일은 EB 형성 과정에서 hiPSC 및 분화된 세포의 생존력을 향상시키는 데 사용됩니다. 이 수정은 주로 서로 다른 오가노이드 샘플과 배치 간의 변동을 줄이기 위한 것입니다. 이 약 2주간의 프로토콜로 균일한 혈관 오가노이드를 생산할 수 있으며, 여기서 혈관 형성을 유도하여 1일차에 내피가 원시 세관 네트워크로 조직화되도록 돕고, 5일차에 혈관 신생 유도를 통해 오가노이드에서 복잡한 혈관 네트워크를 발달시킵니다. 12-15일째에 생성된 오가노이드는 내피 세포와 벽화 세포로 구성된 성숙한 혈관 네트워크를 보여야 합니다.

프로토콜

그림 1 은 이 프로토콜과 관련된 단계의 개요를 보여줍니다. 이 프로토콜에 사용되는 시약 및 재료에 대한 자세한 정보는 재료 표에 나와 있습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 매체는 사용하기 전에 37°C에서 예열하는 것이 좋습니다. 모든 세포 배양 물질 및 공급품은 고압멸균 또는 멸균 상태여야 하며, 세포 취급은 생물안전 작업대에서 이루어져야 합니다. 또한 콜라겐 I 혼합물의 pH 값은 가능한 응고 문제를 피하기 위해 pH 7.3으로 신중하게 조정해야 합니다.

1. 인체 iPSC 유지 관리

  1. 기저막 매트릭스 추출물을 얼음에 해동하고 병을 부드럽게 흔들어 용액을 섞은 다음 P1000 피펫과 사전 냉장 팁을 사용하여 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 0.5mL 분취액을 만듭니다. 부분 표본을 -20 °C에서 최대 1년 동안 보관하십시오.
  2. 매트릭스 추출물 1분취액(0.5mL)을 얼음에 해동합니다. 50mL 튜브에 49.5mL의 사전 냉각된 DMEM/F12 배지와 혼합합니다. 혼합물을 6웰 플레이트의 각 웰(1.5mL/웰)에 분배한 다음 플레이트를 부드럽게 흔들어 액체 용액이 전체 웰을 덮도록 합니다. 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉하고 4°C에서 최대 1주일 동안 보관합니다.
  3. 표 1에 설명된 대로 hiPSC 확장 매체를 준비합니다. 전체 배지(40mL/튜브)의 부분 표본을 만들고 -20°C에서 최대 1년 동안 보관합니다.
  4. 사전 코팅된 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣고 hiPSC 배양 1시간 전에 넣습니다.
  5. 37°C에서 hiPSC 팽창 배지(40mL)를 사전 데우고 표 2에 설명된 대로 hiPSC 파종 배지를 준비합니다.
  6. 코팅된 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 생물안전 작업대로 옮깁니다. 코팅된 플레이트의 배지를 hiPSC 파종 배지(1mL/웰)로 교체합니다.
  7. 극저온 탱크에서 hiPSC의 냉동 보존된 바이알을 37°C 수조에서 1분 동안 해동합니다.
  8. 세포를 15mL 튜브에 옮긴 다음 5mL의 DMEM/F12 배지를 첨가한 다음 실온에서 3분 동안 100 x g 에서 원심분리하여 세포를 수집합니다.
  9. 상층액을 흡인하고 1.5mL의 hiPSC 파종 배지로 세포를 재현탁시킵니다. 15mL 튜브의 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.
  10. 세포 현탁액 10μL를 분취하고 10μL의 트리판 블루 용액과 혼합합니다. 10μL 혼합물을 혈구계 슬라이드로 옮기고 커버슬립으로 덮습니다.
  11. 슬라이드를 홀더에 장착하고 자동 셀 카운터에 삽입합니다. 측량기가 초점을 찾을 때까지 기다리거나 화면의 초점 +/- 버튼을 눌러 수동으로 초점을 조정합니다. 그런 다음 기본 설정을 사용하고 캡처 버튼을 누릅니다. LIVE 세포 밀도 판독 값을 1.9단계에서 준비한 hiPSC 현탁액의 농도로 사용합니다.
  12. 각 웰에 2 × 105 개의 세포를 파종하고 세포가 웰에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
  13. 37°C에서 5%CO2 로 세포를 배양하고 24시간 후에 배지를 hiPSC 팽창 배지(1.5mL/웰)로 교체합니다.
  14. 세포가 80%의 밀도에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하십시오. 세포 형태와 콜로니 크기를 정기적으로 확인하여 자발적인 분화가 발생하지 않도록 합니다. 배양액을 폐기하고 광범위한(>5%) 자발적 분화가 관찰되는 경우 새로운 hiPSC 배치로 다시 시작합니다.

2. EB 형성 (Day 0)

  1. 0일차에 DMEM/F12 배지, hiPSC 파종 배지 및 세포 분리 용액을 준비하고 37°C에서 20-30분 동안 사전 예열합니다.
  2. 6-웰 플레이트에서 배양 배지를 제거하고 예열된 세포 분리 용액(1.5mL/웰)을 추가합니다. 37°C에서 5-7분 동안 플레이트를 배양합니다.
  3. 플레이트를 생물안전 작업대로 옮기고 플레이트를 두드려 hiPSC 콜로니를 분리하고 응집체를 분해합니다.
  4. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮깁니다. DMEM/F12 배지 4.5mL를 추가합니다. 10mL 혈청학적 피펫을 사용하여 혼합물을 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리합니다. 거품이 발생하지 않도록 합니다.
  5. 실온에서 100 x g 으로 3분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다.
  6. 상층액을 흡입하고 P1000 피펫을 사용하여 1mL의 hiPSC 파종 배지로 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다.
  7. 세포 계수를 위해 10μL의 세포 현탁액과 10μL의 트리판 블루 용액을 혼합합니다. 혼합물 10μL를 혈구계 슬라이드로 옮기고 커버슬립으로 덮습니다. 슬라이드를 홀더에 장착하고 자동 셀 카운터에 삽입합니다. 기기가 초점을 찾은 후 Capture 버튼을 누르고 LIVE 세포 밀도 판독 값을 사용하여 hiPSC 현탁액의 농도를 측정합니다.
  8. 밀도가 2.7 × 105 cells/well인 초저 부착 원형 바닥 마이크로웰 플레이트에 세포를 파종하여 EB당 500-1,000개의 세포를 생성합니다.
  9. 각 웰에 2mL의 hiPSC 파종 배지를 추가하고 용액을 부드럽게 혼합하여 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
  10. 37 ° C에서 24 시간 동안 5 % CO2 로 세포를 배양합니다.

3. 혈관 분화(Day 1 - 5)

  1. 1일차에 표 3 및 표 4 에 기재된 바와 같이 중배엽 유도 매체(MIM)를 준비하고 37°C에서 20분 동안 예열한다. MIM 매체는 새로 만들어야 합니다.
  2. P200 피펫을 사용하여 하단의 EB를 방해하지 않고 마이크로웰 플레이트에서 매체를 조심스럽게 흡입합니다.
  3. P2.5 피펫을 사용하여 200mL의 MIM을 천천히 추가합니다. 37 ° C에서 2 일 동안 5 % CO2 로 MIM의 EB를 배양합니다.
  4. 3일째에는 마이크로웰 바닥의 EB를 방해하지 않고 미리 따뜻하게 만든 갓 만든 2.5mL의 혈관 분화 배지 1(VDM1, 표 5)로 배지를 부드럽게 교체합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 로 2 일 더 세포를 배양합니다.

4. 하이드로겔 임베딩(5일차)

  1. 표 6에 기재된 바와 같이 콜라겐 I 혼합물을 제조한다. 얼음 위에 50mL 튜브를 놓고 콜라겐 I 용액, H2O, 10× DMEM / F12 매체, 중탄산 나트륨 및 HEPES를 첨가합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 잘 섞는다. 혼합 용액을 흔들면서 1M NaOH 용액을 적가하여 pH 값을 7.3으로 조정하고 pH 측정기로 혼합물의 pH 값을 확인합니다.
    알림: 모든 용액은 사용하기 전에 얼음으로 미리 냉각해야 합니다. 항상 생물 안전 캐비닛의 얼음 위에서 절차를 수행하십시오. NaOH 용액을 추가하는 것이 중요하며, 콜라겐 I의 국소 경화를 피하기 위해 균질한 용액을 만들기 위한 빠른 분산이 필요합니다. NaOH의 부피는 사용된 콜라겐 I 용액의 로트 수에 따라 달라질 수 있습니다. 전단 응력으로 인해 원치 않는 사전 경화가 발생할 수 있으므로 혼합을 위해 세게 피펫하지 마십시오.
  2. 표 7에 기재된 바와 같이 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물을 준비한다. 1.25 mL의 기저막 매트릭스를 4.1 단계에서 준비한 5mL 콜라겐 I 혼합물에 첨가합니다. 튜브를 흔들어 용액을 부드럽게 섞습니다.
  3. 12웰 플레이트를 얼음 위에 2분 동안 놓습니다.
  4. 와이드 보어 팁을 사용하여 콜라겐 I-basement membrane matrix 혼합물을 12-well plate(1.5mL/well)에 천천히 추가합니다. 혼합물이 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.
  5. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 2시간 동안 넣어 하이드로겔의 첫 번째 층을 응고시킵니다.
  6. 나중에 사용할 수 있도록 남은 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물을 얼음에 보관하십시오.
  7. ~60개의 세포 응집체를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 옮기고 튜브를 얼음으로 5분 동안 냉각합니다. P200 피펫 팁으로 배지를 조심스럽게 제거합니다.
    알림: 1.5단계 후 4.5시간 후에 이 단계를 시작합니다.
  8. 골재에 1.5mL의 콜라겐 I-기저막 혼합물을 넣고 구경이 넓은 P200 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.
  9. 인큐베이터(단계 4.5)에서 하이드로겔의 첫 번째 층이 있는 플레이트를 생물안전 작업대로 옮깁니다.
  10. 경화된 층에 1.5mL의 응집체 현탁액을 추가합니다. 골재가 고르게 분포되도록 플레이트를 부드럽게 흔듭니다. 거품이 발생하지 않도록 합니다.
  11. 37 ° C에서 5 % CO2 로 플레이트를 2 시간 더 배양합니다.
  12. 혈관 분화 배지 2(VDM2; 표 8) 사용하기 전에 37°C 수조에서 20분 동안 매체를 예열합니다.
  13. 각 웰에 2mL의 VDM2를 추가하고 37 ° C에서 5 % CO 2 로 세포를 배양합니다.
  14. 미리 따뜻해진 갓 만든 VDM2로 3일마다 매체를 교체합니다.
    참고: (선택 사항) 혈관 오가노이드는 주사기 바늘로 겔을 제거하여 겔 혼합물에서 방출할 수 있습니다. 겔에서 회수한 혈관 오가노이드는 VDM2(200 μL/well)가 있는 96웰 플레이트에서 개별적으로 유지할 수 있습니다. 2-3일마다 매체를 교체하십시오.

5. 3D Immunofluorescent assay (면역형광 분석)

  1. 혈관 오가노이드는 대략 13일째에 성숙해야 합니다. 하이드로겔에 내장된 오가노이드의 경우 배지를 조심스럽게 흡입하고 2mL PBS로 3회(매회 10분) 세척합니다. 겔에서 회수한 오가노이드의 경우(4.14단계 후) 2mL 미세 원심분리기 튜브에 6-10개의 오가노이드를 수집하고 배지를 흡입한 다음 2mL PBS로 3회(각 10분) 세척합니다.
  2. 4% 파라포름알데히드(PFA) 2mL를 샘플에 넣고 파라핀 필름 밀봉으로 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  3. PFA 용액을 제거하고 샘플을 2mL PBS로 4회(매회 15분) 세척합니다.
  4. 차단 완충액 2mL(표 9)를 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
  5. 차단 완충액을 제거하고 1.5mL의 1차 항체를 추가합니다(항체 정보는 재료 표 참조, 항체는 차단 완충액에 희석해야 함). 4 °C에서 2 일 동안 부드럽게 흔들어 1 차 항체가 있는 샘플을 배양합니다.
    참고: 1차 항체(CD31, PDGFRβ, ERG1)는 차단 완충액에 1:400의 비율로 희석하는 것이 권장됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조).
  6. 1차 항체 용액을 제거하고 2mL PBST로 1시간 동안 6회 세척합니다.
  7. 2mL의 2차 항체(항체 정보는 재료 표 참조, 항체는 PBST에 희석해야 함)를 샘플에 추가합니다. 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸고 4°C에서 부드럽게 흔들어 2일 동안 배양합니다.
    참고: 2차 항체는 PBST에 1:1000의 비율로 희석하는 것이 권장됩니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 배양하는 동안 접시를 빛으로부터 유지하고 나중에 이 단계에서 세척하십시오.
  8. 2차 항체 용액을 제거하고 2mL TBST로 6회(매회 1시간) 세척합니다. 핵 염색이 필요한 경우 마지막 세척 단계에 사용된 세척 버퍼에 DAPI(1μg/mL)를 추가합니다.
  9. 이러한 겔 포매 오가노이드의 경우 겔을 4조각으로 자르고 주걱으로 2mL 미세 원심분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 검색된 오가노이드의 경우 세척 버퍼를 제거합니다.
  10. 물티슈를 사용하여 겔이나 오가노이드를 건드리지 않고 남은 용액을 흡수하십시오.
  11. 각 튜브에 수용성 조직 투명화 시약 2mL(굴절 지수 = 1.49)를 추가합니다. 오가노이드가 투명해질 때까지(보통 하룻밤) 어두운 어두운 곳에서 투명화 시약으로 샘플을 배양합니다. 샘플을 흔들지 마십시오.
  12. 투명화 시약이 있는 오가노이드를 주걱을 사용하여 유리 바닥 접시의 중앙으로 조심스럽게 옮깁니다.
  13. 오가노이드 또는 젤 조각을 24mm × 24mm 커버슬립으로 덮습니다.
  14. 커버슬립이 평평하게 놓일 때까지 부드럽게 아래로 누르고 샘플을 유리 바닥에 끼웁니다.
  15. 접시에 있는 여분의 투명화 시약을 제거하고 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.
  16. 3D 이미징의 경우 10× 대물렌즈가 있는 컨포칼 현미경을 사용하십시오. 타일 스캔 및 Z-스택 스캔을 사용하여 오가노이드의 전체 마운트 이미지를 얻을 수 있습니다.

결과

그림 1A는 각 단계에서 사용되는 주요 구성 요소를 포함하여 이 프로토콜의 체계를 보여줍니다. 분화는 EB 형성으로 시작하여 중배엽 유도 및 혈관 계통 사양이 뒤따랐습니다(그림 1B-D). 응집체는 시간이 지남에 따라 더 커지고 구형이 줄어들었습니다. 오가노이드는 5일째에 거친 가장자리를 보이기 시작했습니다. 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물에 매립된 후 혈관 내피 세포와 주위 세포가 싹을 틔우고 성장하여 빠르면 7일째에 복잡한 혈관 네트워크를 형성했습니다(그림 1E). 이 수정된 방법의 주요 목적은 서로 다른 세대 배치 간의 변동을 최소화하는 것이므로 두 개의 독립적인 배치에서 EB 크기를 측정했으며 크기 측정과 통계 분석 모두 이 방법과의 일관성과 균일성을 확인했습니다(그림 1F).

혈관 분화를 검증하기 위해 CD31, ERG1 및 PDGFRβ를 포함한 혈관 마커로 염색하고 임베딩하기 전에 5일차에 오가노이드를 수집했습니다. 오가노이드는 CD31, ERG1 및 PDGFRβ를 발현했으며(그림 2), 이는 혈관 내피 세포와 주위 세포의 존재를 나타냅니다.

조직 제거 후, 혈관 네트워크는 전체 장착 면역형광 현미경으로 분석되었습니다(그림 3A). 성숙한 오가노이드는 17일째(그림 3B, 겔 블록의 샘플) 및 28일째(그림 3C, 겔 블록에서 샘플을 채취하여 96웰 플레이트에서 개별적으로 배양했습니다. 가장자리의 혈관 네트워크는 겔 블록에서 회수한 후 방사상으로 팽창하는 대신 스페로이드를 감쌌습니다).

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그림 1: 혈관 오가노이드 생성. (A) 혈관 오가노이드 생성을 위한 단계 및 타임라인 계획. (B-E) 다양한 단계에서 혈관 오가노이드의 대표적인 명시야 이미지. 스케일 바: 100 μm. (F) 이 연구에서 제시된 마이크로웰 방법을 사용하여 두 개의 서로 다른 EB 생성 배치에서 EB 크기의 통계 분석. EB 생성의 경우 마이크로웰당 1,000개의 셀이 사용되었으며 배치 1 및 2의 경우 각각 n = 42 및 n = 40이었습니다. 유의성은 유의하지 않고 ns로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 겔 임베딩 전 혈관 오가노이드의 면역염색. 내피 마커 (A) CD31(녹색) 및 (B) ERG1(녹색)과 (C) pericyte 마커 PDGFRβ(녹색)로 각각 염색된 오가노이드의 대표적인 형광 이미지. 핵을 DAPI(파란색)로 대조염색하였다. 스케일 바: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 혈관 오가노이드의 혈관 네트워크에 대한 면역형광 특성화. (A) 대표적인 이미지는 조직 투명화 후 유리 접시에 겔이 내장된 혈관 오가노이드를 보여줍니다. 오가노이드는 투명했지만 385nm 자외선 아래에서 볼 수 있었습니다. (B) 17일째 혈관 오가노이드의 대표적인 3D 전체 마운트 이미지. 혈관 오가노이드는 DAPI(파란색), 혈관 내피 세포 마커인 CD31(녹색) 및 주세포 마커인 PDGFRβ(자홍색)로 염색되었습니다. (C) 내피 마커 CD31(빨간색) 및 ERG1(녹색)로 염색된 28일에 회수된 혈관 오가노이드의 대표적인 전체 마운트 3D 이미징. 스케일 바: 150 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

hiPSC 확장 매체500mL
mTeSR Plus 기초 배지400mL
mTeSR Plus 보충제100mL
겐타마이신(50mg/mL)1mL

표 1: hiPSC 팽창 매체의 구성.

hiPSC 파종 배지20mL
PSC 확장 매체20mL
크로만 1 (100 μM)10 μL
엠리카산(1mM)30 마이크로리터
폴리아민 서플리먼트(×1000)20 μL
트랜스-ISRIB (1 mM)14 μL

표 2: hiPSC 파종 매체의 조성.

N2B27 매체100mL
DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제48.6 mL
NeuroBasal 배지48.6 mL
GlutaMAX 보충제 (×100)0.5 mL
MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA, 100x)0.5 mL
2-메르캅토에탄올(×1000)0.1 mL
겐타마이신(50mg/mL)0.1 mL
N2 서플리먼트(×100)0.5 mL
B27 보충제 마이너스 비타민 A (50×)1mL
헤파린, 4kU/mL0.1 mL

표 3: N2B27 매체의 조성.

중배엽 유도 매체(MIM)3mL
N2B27 매체3mL
BMP4 (100ng/μL)0.9 μL
CHIR99021 (12 mM)3 μL

표 4: 중배엽 유도 매체(MIM)의 조성.

혈관 분화 배지 1(VDM1)3mL
N2B27 매체3mL
포스클린 (12 mM)0.5 μL
VEGFA(100ng/μL)3 μL

표 5: 혈관 분화 배지 1(VDM1)의 조성.

콜라겐 I 혼합물5mL
콜라겐 I (3.61g/mL)2.77mL
10x DMEM/F12 매체0.5 mL
중탄산 나트륨, 7.5 %0.5 mL
헤페스, 1m0.5 mL
H2O (에이치오)0.73 mL
나오, 1M75 마이크로리터

표 6: 콜라겐 I 혼합물의 조성.

콜라겐 I - 기저막 매트릭스 혼합물6.5 mL
콜라주 I 믹스5mL
마트리겔(10mg/mL)1.5 mL

표 7: 콜라겐 I-기저막 매트릭스 혼합물의 조성.

혈관 분화 배지 2(VDM2)5mL
DMEM/F-12, GlutaMAX™ 보충제3.67 mL
겐타마이신(50mg/mL)5 μL
MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA, 100X)50 μL
2-메르캅토에탄올(×1000)5 μL
헤파린, 4kU/mL5 μL
Knockout 세럼 교체0.75 mL
증권 시세 표시기0.5 mL
VEGFA(100ng/μL)5 μL
FGF2 (100 ng/μL)5 μL

표 8: 혈관 분화 배지 2(VDM2)의 조성.

블로킹 버퍼50mL
당나귀 세럼2.5mL
트윈 200.25 mL
트리톤 X-1000.25 mL
데옥시콜산나트륨 용액(1%, wt/v)0.5 mL
증권 시세 표시기46.5 mL

표 9: 면역염색을 위한 차단 완충액의 조성물.

토론

설명된 프로토콜에는 고품질 혈관 오가노이드의 균질하고 재현 가능한 생성을 위한 두 가지 주요 수정 사항이 포함되어 있습니다. 첫 번째 수정은 EB 균일성을 더 잘 제어할 수 있도록 마이크로웰 플레이트를 사용하는 것입니다. 혈관 분화의 시작점으로서 EB의 크기는 줄기세포의 운명과 다른 계통에 대한 분화 효능을 조절하기 때문에 매우 중요합니다. EB 크기의 변화는 일반적으로 일관되지 않은 구조와 조직을 가진 이질적인 오가노이드로 이어집니다16,17. hiPSC 콜로니(11,12)를 들어올리는 종래의 EB 생성 방법은 개별 EB에 대한 세포 수를 제어하는 것을 어렵게 만들고 일반적으로 불균일한 EB 형성을 초래합니다. 이 프로토콜에서, hiPSC는 단일세포 현탁액으로 해리되고 마이크로웰(16,18)에서 재응집된다. 시딩 세포 수를 조정함으로써 EB의 크기를 최적화하여 일관되고 효과적인 중배엽 분화를 보장할 수 있습니다. 마이크로웰 시딩의 경우 500-1,000개의 셀이 사용되며, 이는 상대적으로 작은 EB(직경 100-200μm)를 생성할 수 있습니다. 이 방법은 배치에서 배치로 그리고 다양한 세포주(13) 간에 원하는 크기의 균일한 EB를 재현성 있게 생성할 수 있습니다. Day 0 이후, EB의 형태는 분화 과정에서 시간이 지남에 따라 변했습니다: 모양은 덜 구형이 되고 표면은 더 거칠어지지만(그림 1), 부피는 크게 증가하지 않습니다. 3D 혈관 형태는 임베딩 밀도와 임베디드된 오가노이드의 크기에 따라 달라집니다. 너무 큰(>500μm) 오가노이드는 일반적으로 혈관 세포 분화가 불충분한 결과를 초래하며, 너무 작은 오가노이드는 혈관 구조가 덜 발달된 경향이 있습니다.

두 번째 수정은 EB 형성 중 hiPSC 생존력을 향상시키기 위해 CEPT 칵테일을 통합하는 것입니다. 세포 생존율은 이 과정에서 hiPSC 콜로니의 품질 외에도 매우 중요합니다. hiPSC가 단세포 현탁액으로 해리될 때 일반적으로 세포 생존율을 향상시키기 위해 ROCK 억제제 Y27632를 첨가합니다. 그러나 Y27632는 저밀도의 hiPSC에 대해 최적이 아닌 것으로 나타났으며 원치 않는 막 응력을 유발할 수 있는 반면, CEPT 칵테일(크로만 1, 엠리카산, 폴리아민 및 트랜스-ISRIB로 구성)은 더 낮은 밀도의 hiPSC를 사용하여 세포 응력을 크게 줄이고 이 EB 형성 과정에서 생존력을 향상시킬 수 있습니다15.

겔에 오가노이드를 삽입하기 전에 오가노이드는 마이크로웰 플레이트에서 유지되며, 매체 변화는 가능한 중단을 피하기 위해 완만해야 합니다. 처음 5일 동안은 200μL 피펫을 사용하여 배지를 교체하는 것이 좋습니다. 혈관 오가노이드 생성에 사용되는 모든 매체는 사용 전에 미리 예열해야 합니다. 특히 겔 임베딩 후 콜드 미디어(cold media)를 사용하면 기저막 매트릭스가 부분적으로 액화되고 혈관 네트워크 형성을 위한 3D 하이드로겔 틈새에 영향을 미칠 수 있습니다. 오가노이드의 임베딩 밀도와 균일한 분포도 혈관 네트워크 형성에 중요한 요소입니다. 조밀한 오가노이드 임베딩은 잠재적으로 혈관 네트워크의 과도한 융합으로 이어질 수 있으며, 낮은 임베딩 밀도는 불충분한 네트워크 형성으로 이어질 수 있습니다. 웰당 60-80개의 오가노이드를 파종하고 3D 겔의 첫 번째 레이어에 오가노이드를 추가한 직후 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 움직이면 이러한 오가노이드를 더 잘 분배할 수 있습니다.

이 프로토콜은 다른 애플리케이션에 맞게 추가로 수정할 수 있습니다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽(BBB) 단서를 적용하여 BBB 계면(19,20,21,22,23,24,25)의 형성으로부터 혈관 내피 세포를 더욱 억제할 수 있습니다. 3D 하이드로겔 조성도 조정할 수 있습니다. 예를 들어, 피브린과 비트로넥틴은 시험관 내 혈관 네트워크 형성에 일반적으로 사용됩니다 25,26,27,28,29,30,31,32. 콜라겐 I이 없는 기저막 매트릭스는 임베딩에 사용될 수 있으며, 이는 매립 과정을 단순화하고 다른 기계적 자극을 제공할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 생성된 혈관 오가노이드는 잠재적으로 질병 모델링 또는 약물 스크리닝 응용 분야에 사용될 수 있지만, 한 가지 제한 사항은 이러한 오가노이드가 몇 개의 더 큰 혈관으로 대부분 모세혈관 조직만 재현한다는 것입니다. 더 큰 혈관에 초점을 맞춘 연구의 경우, 오가노이드 생성은 추가적인 기계적 자극을 필요로 할 수있다 24,31,32,33. 혈관 오가노이드를 동물(34)에 이식하거나 관류 펌프(33)를 가진 마이크로/매크로-유체 장치와 같은 재순환과 연결하면 잠재적으로 이 문제를 해결할 수 있습니다.

공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없음을 선언합니다.

감사의 글

NIH Center Grant(P30CA013696)를 통해 부분적으로 자금을 지원받은 Columbia University의 Herbert Irving Comprehensive Cancer Center의 Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource의 기술 지원에 감사드립니다. 이 연구는 NIH(R21NS133635, Y.-H.L.; UH3TR002151, K. W. L.). 그림 1A는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올 (1000x)Gibco21985023
AccutaseSigma-AldrichA6964
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immuno Research Labs711-546-1520.25 mL 50% 글리세롤로 재구성,  -20°C에서 보관; C 최대 1년, 사용을 위한 희석 비율: 1:1000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson Immuno Research Labs705-606-147은 0.25 mL 50% 글리세롤로 재구성하고, -20°C에서 보관; C 최대 1 년, 사용을위한 희석 비율 : 1 : 1000
B27 보충제에서 비타민 A를 뺀 (50x)Gibco125870104 °C에서 해동; C, 부분 표본 및 -20 °에 저장; C, 동결-해동 주기
BMP4ProSpecCYT-081100ng/µ의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성하지 않습니다. L, 부분 표본 및 -20 °에 저장; C
CD31 항체 abcamab28364희석 비율: 1:400
원심분리기Eppendorf022626001
CHIR99021Tocris Bioscience4423/10DMSO로 12mM에서 원액을 만들고 -20°C에서 보관합니다. C는 최대 1 년.
Chroman 1Tocris7163/10100 µ에서 원액을 만듭니다. M을 DMSO로 설정하고 -20°C로 저장합니다. C는 최대 1 년.
콜라겐 I 코닝40236
컨포칼 현미경니콘AXRMP/Ti2
코닝 엘플라시아 플레이트코닝4441
백작 II FL 자동 세포 계수기Thermo FisherAMQAF1000
DMEM/F-12, GlutaMAX 보충제Gibco10565018
DMEM/F-12, 분말Gibco12500062바이오 그레이드 ddH2O로 10x 스톡 용액을 만들고 0.2 µ로 멸균합니다. M 필터. 4 °C에 보관하십시오.
Edi042ACedars Sinai
EmricasanMedchemexpress LLC는DMSO로 1mM에서 재고 솔루션을 만들고 -20°C에서 저장할 HY1039610MG 있습니다. C는 최대 1 년.
ERG 항체Cell Singali Technology97249희석 비율: 1:400
소 태아 혈청 - 프리미엄애틀랜타 생물학S111504°C에서 해동; 씨  및 분취, 상점  -20 > C 최대 5 년 동안 또는 4 °에 저장; 최대 한 달 동안
FGF2ProSpecCYT557100ng/µ의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성합니다. L, 부분 표본 및 -20 °에 저장; C
Fluorodish 세포 배양 접시세계 정밀 기기FD35-100
ForskolinTocris Bioscience109912 mM의 농도에서 DMSO로 재구성하고 -20 °C에서 분취 및 저장합니다. C
겐타마이신(50mg/mL)Gibco15710064
GlutaMAX 보충제(100개)Gibco35050061
헤파린, 100kUMilliporeSigma375095100KU의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성
Gibco15630080
인큐베이터Thermo Scientific13998123
Knockout Serum ReplacementGibco108280284°C에서 해동; C, 부분 표본 및 -20°C에 보관; C, 동결-해동 주기
Matrigel, GFR Basement Membrane MatrixCorning3562304°C에서 해동을 피하십시오. C, 부분 표본 및 -80°C에 저장; C, 동결-해동 주기
MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA, 100x)Gibco11140050
분자 생물학 등급 물Corning46000CV
mTeSR 플러스 키트STEMCELL Technologies10011304°°에서 해동; C, 부분 표본 및 -20°C에 보관; C, 동결 - 해동 주기
N2 보충 (100x)Gibco175020484°C에서 해동을 피하십시오. C, 부분 표본 및 -20°C에 보관; C, 동결-해동 주기 NaOH
용액 (1M)을 피하십시오. HyCloneSH31088.01
NeuroBasal 배지Gibco21103049
NIS-Elements, ver 5.42Nikon
Normal Donkey SerumJackson Immuno Research Labs1700012110mL 멸균 ddH2O로 재구성, 4°C에서 보관; 최대 2주 동안
C 파라포름알데히드, 20%Electron Microscopy Sciences15713SPBST로 희석
, 20xThermofisher28352
PDGFRβ 항체R& DAF385희석 비율: 1:400
폴리아민 보충제(1000x)Sigma-AldrichP8483
Rapiclear 투명화 시약, 1.49SUNJIN LABRC149001
중탄산나트륨(7.5%)Gibco25080094
데옥시콜레이트 나트륨 일수화물ThermofisherJ62288221%(wt/v) 원액에 대해 ddH2O로 용해
TBST, 20xThermofisher28360
trans-ISRIBTocris Bioscience5284/10은 DMSO로 1 mM에서 재고 용액을 만들고 -20°C에서 보관합니다. C는 최대 1 년.
Tritin X-100Sigma-AldrichT8787-50ML
Trypan Blue Stain (0.4%)Thermo Fisher15250061
Tween 20Sigma-AldrichP7949-100ML
VEGF-AProSpecCYT-116100ng/µ의 농도에서 멸균 ddH2O로 재구성합니다. L, 부분 표본 및 -20°C에 저장; 씨
은 은 은 은 는 는 4kU/mL HEPES (1M)을 피하십시오.은

참고문헌

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