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방법 논문

비율계량 형광 공명 에너지 전달에 의한 DNase 활성 평가

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67134

⸱

2025년 7월 25일

 , 
1Baylor College of Medicine, 2Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

이 논문에서

요약

이 연구는 DNase 활성의 검출 및 정량적 평가를 위한 간단하고 사용자 친화적인 비율계량 FRET 분석을 제시하고 약한 뉴클레아제 분석에 적용하는 것을 보여줍니다.

초록

본 프로토콜은 DNase 활성의 검출 및 정량적 평가를 위한 간단하고 민감한 비율계율 Förster 공명 에너지 전달(FRET) 분석을 설명합니다. 비율계량 FRET 측정은 공여자와 수용체 방출 신호의 비율을 사용합니다. 이 분석은 실시간 DNA 절단 센서로 사용되는 스테이플 모양의 이중 태그가 있는 38mer FRET 올리고프로브를 사용하여 단일 가닥 DNA 절단을 감지합니다. 설명된 접근법의 주요 응용 분야는 pH, 온도 및 완충액 조성과 같은 반응 조건이 DNase 활성에 미치는 영향을 정량적으로 평가하는 것입니다. 미미하고 느린 DNA 절단도 검출할 수 있는 능력으로 인해 이 분석은 장기간의 관찰이 필요한 약한 핵분해 활성을 조사하고 DNase 활성에 대한 pH의 영향을 연구하는 데 특히 적합합니다. 이 비율계량 FRET 프로토콜의 이러한 특정 이점은 백혈구 엘라스타제 억제제(LEI)의 DNase 활성의 검출 및 분석에 적용함으로써 설명됩니다.

서론

비율계량 형광 접근법은 단일 신호의 강도에만 의존하는 대신 형광 신호의 비율을 사용하는 분석 방법입니다 1,2. 비율을 사용하면 내부 교정을 제공하고 샘플 및 프로브 농도의 변화, 기기 매개변수 등과 같은 많은 무작위 요인을 보상할 수 있다는 장점이 있습니다. 이것은 형광 프로브의 정확성과 감도를 향상시킵니다.

FRET(Förster 공명 에너지 전달) 프로브의 특정 맥락에서 "비율계량"이라는 용어는 측정이 FRET 공여체 및 수용체 형광단 쌍의 두 방출 신호의 비율을 기반으로 한다는 사실을 나타냅니다. 표적 분석물의 활성을 정량화하기 위해 비율계량 FRET 프로브는 수용체/기증자 방출 강도의 비율(또는 경우에 따라 거꾸로 된 기증체/수용체 비율)을 사용합니다. 이 비율은 FRET 효율과 직접적인 관련이 있습니다. 배경 소음을 최소화하고 조명 조건 및 프로브 농도의 변화를 설명하는 자체 정규화 메커니즘을 제공합니다3.

비율계량 방법의 최근 흥미로운 응용 분야에는 순환 종양 DNA(ctDNA)4,5의 검출을 위한 비율계량 전기화학적 바이오센서, 세포사멸의 식세포 단계의 FRET를 위한 브라운 동작 구동 바이오 나노 기계에서의 사용이 포함됩니다6, 식세포청소율의 표현 FRET 표지 및 분석 7. 이 작업에서 설명한 비율계량 FRET 접근 방식은 DNase 활성의 정량적 평가에 유용합니다. 분석 측정은 FRET 쌍 방출 비율을 기반으로 합니다. 미미하고 느린 DNA 절단도 검출할 수 있기 때문에 이 분석은 더 긴 관찰 기간이 필요한 약한 핵분해 활성을 조사하고 다양한 pH 수준에서 실험하는 데 특히 적합합니다.

여기서, 비율계량 FRET 분석의 몇 가지 특정 이점은 약한 뉴클레아제-백혈구 엘라스타제 억제제(LEI)의 DNase 활성을 연구하기 위한 적용으로 설명됩니다. 이 보고서에는 단계별 지침과 비율 측정 데이터 분석에 대한 설명이 포함된 자세한 프로토콜이 포함되어 있습니다.

비율계 FRET 프로브 설명

비율계량 FRET 프로브는 FAM-TAM(Fluorescein-Tetramethylrhodamine)의 기증자-수용체 FRET 쌍을 운반하는 자기 상보형 38-mer DNA 올리고입니다. 그 서열은 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3'입니다. 자가 혼성화 38-mer는 23 및 15 뉴클레오티드로 구성된 두 개의 연결된 헤어핀으로 구성된 스테이플 모양의 형태를 가정하며, 이는 서로 23.8 Å 떨어진 두 개의 형광단을 배치합니다. 이것은 이 쌍의 Förster 반지름인 R0 = 55 Å8보다 훨씬 가깝습니다. 이러한 위치 지정은 공여자에서 수용체로의 에너지 전달 효율이 매우 높음에 해당합니다7: EFRET = 0.993477. 그 결과, FAM 여기 파장(488nm)에서 조명되면 FRET 프로브는 수용체 TAM(580nm)의 방출 파장에서 형광을 방출하는 반면 FAM 방출(525nm)은 억제됩니다.

그림 1A 는 UNAFold가 예측한 프로브의 2차 구조를 보여주며, 좁은 곡률로 인한 입체 장애로 인해 양쪽 헤어핀 정점에 작은 루프가 있습니다. FRET 프로브에 의한 DNA 절단 검출의 개략도는 그림 1B에 나와 있습니다. 이는 DNase에 의한 올리고프로브의 파손이 FRET 쌍을 분리한다는 것을 보여줍니다. 이 분리는 프로브에 있는 두 형광단의 방출 스펙트럼에 급격한 변화를 일으킵니다. 그림 1C 는 절단 전후의 프로브 방출 스펙트럼을 나타내고 DNase II 프로브 절단 후 FRET 쌍의 분할이 525 nm(ID 525 nm)에서 공여체 방출을 증가시키고 동시에 580 nm(IA 580 nm)에서 수용체 방출을 감소시킨다는 것을 보여줍니다. 그림 1D 는 방출 스펙트럼에 해당하는 PAGE 겔 및 FRET 비율을 보여줍니다. DNase II 프로브 절단은 12-16-mer FAM(녹색) 및 20-24-mer TAM(빨간색) 단편에 해당하는 두 개의 넓은 밴드를 생성했으며, 이는 헤어핀 사이의 연결 영역 근처에서 T23 의 양쪽에서 38-mer의 무작위 절단을 나타냅니다.

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그림 1: 비율계량 FRET 프로브의 구조 및 작동. (A) UNAFold에 의해 생성된 FRET 프로브의 예측된 2차 구조. (B) 작동하는 FRET 프로브의 개략도. 비율계량 FRET 프로브는 23.8Å의 유효 FRET 거리에서 FRET 기증체(FAM) 및 수용체(TAM)로 표지된 스테이플 모양의 38mer 올리고뉴클레오티드로 >99% FRET 효율을 보장합니다. DNase에 의한 올리고프로브의 절단은 FRET 쌍을 분리하여 FRET를 제거합니다. (C) DNase II 매개 절단 전후의 FRET 프로브의 방출 스펙트럼. 절단 전에 FAM 방출이 억제되고 TAM 방출이 두드러집니다. DNase 매개 절단은 FAM과 TAM을 분리하여 FAM 방출(525nm 피크)을 복원하고 TAM 방출(580nm 드롭)을 제거합니다. λ여기 = 488nm. (D) DNase II 절단 전후의 FRET 프로브의 비율 측정 및 전기 영동 평가. 상단 패널: 프로브 상태의 정량적 측정을 나타내는 FRET 비율(RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm). 빨간색: 절단되지 않음; 녹색: DNase II 절단. 하단 패널: 형광 측정 데이터에 해당하는 변성 PAGE 겔. DNase II 절단은 FAM 표지 단편(12-16 nt, 녹색) 및 TAM 표지 단편(20-24 nt, 빨간색)을 생성하며, 이는 T23 옆에 있는 헤어핀 사이의 연결 부근에서 절단을 나타냅니다. 절단되지 않은 대조군은 노란색 형광을 나타냅니다. 사다리: 38-mer 프로브의 5' 및 3' 세그먼트에 해당하는 FAM 및 TAM 표지 올리고뉴클레오티드, 원래 위치에 형광 표지가 있습니다. 반응 조건: 10mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2), 1pmol/μL FRET 프로브, 0.0033U/μL DNase II, 37°C에서 24시간. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; λ여기 = 488nm. UNAFold 조건: 1 μM FRET 프로브, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

개별 테스트 방출 스펙트럼의 변화는 분명하지만 많은 수의 방출 스펙트럼 간의 정량적 비교에는 보다 사용자 친화적이고 컴팩트한 정량적 매개변수가 필요합니다. 이 역할은 FRET 비율에 의해 수행됩니다. 제시된 형광 방법은 정량적 평가를 위해 FRET 쌍 구성원의 형광 방출의 직접(2채널) 비율에 의존하는 비율계량 접근법 그룹에 속합니다 2,9.

이 접근법은 FRET 효율과 관련된 공여자/수용체 방출 비율(RD/A = ID 525nm / IA 580nm)을 사용하며 38-mer(파손 또는 손상되지 않음)의 상태를 정량적으로 특성화합니다. ID/IA 비율은 프로브 농도, 여기 강도 및 광표백과 같은 요인의 변화를 본질적으로 설명하는 자체 정규화 메커니즘을 제공합니다3. 이 접근 방식은 동일한 프로브 내에 기증자와 수용체가 연결되어 있는 FRET 프로브에만 적합하며, 이들의 비율이 알려져 있고 일정합니다. 이러한 이유로, 접근법은 수용체 또는 기증자 누화의 직접 여기를 고려할 필요가 없다2. 프로브의 고정된 기증자-수용체 화학량론은 기증자/수용체 방출 비율이 이러한 변화의 영향을 받지 않고 프로브의 상태를 직접적으로 반영하도록 합니다. 결과적으로, 기증자-수용체 방출의 비율은 신호 정규화 2,3이 내장된 정량적 DNA 절단 매개변수를 제공합니다.

이 분석은 프로브 절단 후 FRET가 중단되고 절단이 증가함에 따라 증가하는 DNase 활성과 동일한 방향으로 변화하기 때문에 ID / IA 비율(반대 IA / ID 비율이 아닌)을 사용합니다. 이는 그림 1C의 스펙트럼에 해당하는 DNase II에 의한 절단 전후의 비율 측정 프로브와 PAGE 전기영동을 보여주는 그림 1D에 의해 설명됩니다. 비율계량 FRET 분석의 편의성, 시간 절약 및 사용 편의성을 입증하기 위해 약한 뉴클레아제-백혈구 엘라스타제 억제제(LEI)의 DNase 활성을 발견하고 연구하는 데 적용되었습니다.

약한 뉴클레아제 LEI

프로테아제 억제제 LEI는 자연적으로 준안정, 즉 위상학적으로 불균형합니다. 이 기능은 억제 메커니즘에 필수적입니다. 표적 프로테아제가 LEI 반응성 부위 루프(RSL)를 절단할 때, 프로테아제 억제제 분자는 급격한 형태 변화를 겪어 프로테아제를 비활성 형태로 기계적으로 늘립니다10,11. 놀랍게도, 이것은 또한 LEI 분자 자체를 파괴 및 팽창시키고 천연 접힘으로 덮인 비밀스러운 DNase 부위를 밝혀 LEI를 활성 엔도뉴클레아제 L-DNase II(LEI 유래 DNase II)로 전환합니다11,12. 비밀스러운 DNase 부위는 황산에서 pH 2에서 하룻밤 배양하여 발생하는 LEI의 변성 및 파손에 의해 노출될 수도 있습니다10,13. LEI를 연구하기 위해 이 FRET 분석을 활용한 결과, LEI의 잠재 핵분해 활성을 밝히기 위해 가혹한 화학적 변성 처리와 표적 효소 절단이 엄격하게 필요하지 않음을 입증했습니다.

제시된 비율 측정 FRET 접근 방식의 응용 프로그램 및 프로토콜은 정상적인 비변성 LEI에 본질적으로 존재하는 약한 DNase 활성의 발견을 설명합니다. 절단되지 않은 LEI의 고유한 핵분해 능력의 발견과 그 분석은 다양한 산성 pH 수준에서 장기간 관찰할 수 있는 분석의 적합성으로 인해 가능했습니다.

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프로토콜

비율계량 형광 공명 에너지 전달에 의한 DNase 활성 평가

이 방법은 가용성 단백질의 핵 분해 특성을 검출하고 분석하는 데 적합합니다. 조사된 DNase의 pH 의존성을 조사하기 위해 절차는 다양한 pH 값에 걸쳐 DNase 활성을 동시에 평가합니다. 이 기술은 약하고 느린 뉴클레아제 활성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 본 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 형광 측정 평가 시스템을 위한 배양 혼합 성분 준비

  1. 원하는 pH 범위에서 완충 용액을 준비합니다. pH 범위 6.8에서 8.0의 경우 Tris-HCl 또는 인산염 완충액을 사용하십시오. Tris-HCl 완충액은 안정성과 효소 활성에 대한 간섭이 최소화되기 때문에 생리학적 pH 조건(pH 7.2 - 8.0)에 사용합니다.
    참고: 인산염 완충액은 이 pH 범위에 적합하지만 완충 용량 제한으로 인해 더 높은 pH 값(>7.5)에는 적합하지 않습니다.
    4.2에서 7.2의 pH 범위의 경우 아세테이트 또는 구연산염 완충액을 사용하십시오. 아세테이트 완충액은 pH 4.2까지 낮은 pH 조건에 효과적입니다.
    참고: 구연산염 완충액은 약간 더 높은 pH 값(pH 5.6 - 7.2)에서 사용할 수 있으며 우수한 완충 용량을 제공합니다. 이 완충액은 산성에서 중성 조건에서 DNase 활성을 연구하는 데 적합합니다. LEI의 핵분해 활성에 대한 제시된 연구에서는 pH 범위가 4.8에서 6.5인 10mM 아세트산나트륨 완충액을 사용했습니다.
  2. 각 완충 용액에서 단백질 샘플을 적절한 농도로 희석합니다. 샘플의 활성을 완전히 알 수 없는 경우 단백질의 다양한 희석액을 준비합니다. 최적의 희석액은 DNase 활성의 강도에 따라 달라지며 여러 단백질 농도를 테스트하여 실험적으로 결정해야 합니다.
    참고: LEI의 초약핵분해 활성에 대한 제시된 연구는 1μM의 농도로 사용되었습니다.
    1. 농축 완충액의 pH는 희석 시 변할 수 있으므로 고농축 완충액을 사용할 때는 항상 최종 용액의 pH를 확인하십시오.
  3. 뉴클레아제가 없는 물에 비율계량 FRET 프로브 용액을 준비합니다. 1 μM(1 pmol/μL)에 가까운 FRET 프로브 농도를 사용하십시오. 매우 높은 프로브 농도를 사용하지 마십시오.
    바람직하지 않은 염기 쌍의 완전한 해리를 보장하기 위해 적용하기 전에 프로브 용액을 빠르게 가열하고 냉각하십시오.
    참고: LEI의 핵분해 활성에 대한 제시된 연구는 뉴클레아제가 없는 물에서 1μM(1pmol/μL)의 농도를 FRET 프로브에 사용했습니다.

2. 비율계량 FRET 프로브를 기질로 사용하여 DNase 반응을 유도합니다.

  1. 테스트할 각 pH 조건에 대해 96웰 플레이트에 3개의 웰을 준비합니다. 각각 양성 및 음성 대조군에 대해 3개의 추가 웰을 포함합니다.
    1. pH 시리즈의 각 웰에서 다음을 결합합니다.
      뉴클레아제가 없는 물 70 μL
      10 μL 10X 완충액(선택한 완충액)
      단백질이 함유된 시료 10 μL
      비율계량 프로브 용액 10 μL(10 pmol/μL 스톡 농도)
      참고: 산성 pH에서 LEI의 핵분해 활성에 대한 제시된 연구에서는 다음 10X 완충액을 사용했습니다: 100 mM Na 아세테이트 pH 5.2
    2. 각 양성 대조군 웰에서 다음을 결합합니다.
      뉴클레아제가 없는 물 79 μL
      10 μL 10X DNase II 완충액(100 mM Na 아세테이트 pH 5.2)
      DNase II 0.33 μL(1 U/μL 스톡)
      비율계량 프로브 용액 10 μL(10 pmol/μL 스톡 농도)
      참고: 산성 pH에서의 연구의 경우 DNase II를 양성 대조군으로 사용하십시오. pH 7(특히 pH 6.5-8) 근처에서 DNase 활성을 평가할 때 DNase II 및 아세테이트 완충액 대신 DNase I 및 관련 완충액(예: 10mM Tris-HCl, 2.5mM MgCl2, 0.5mM CaCl2, pH 7.6)으로 전환하십시오.
    3. 각 음성 대조군 웰에서 단백질 샘플 대신 뉴클레아제가 없는 물을 추가합니다.
  2. 서로 다른 pH 값에서 DNase 단백질을 포함하는 반응 혼합물에 프로브 용액을 첨가하여 DNase 반응을 유도합니다.
    알림: 기포 형성을 피하면서 모든 샘플을 철저히 혼합하십시오. 활성 DNase 샘플의 경우 모든 반응을 가능한 한 동시에 가깝게 시작합니다. LEI와 같은 초약한 활동의 경우 엄격한 타이밍이 덜 중요합니다.
    참고: 특히 활성 뉴클레아제를 다룰 때 일관된 배양 시간을 보장하려면 각 측정에 필요한 시간에 따라 샘플을 시차를 두고 추가하십시오. 예를 들어, 각 측정에 10초가 걸리는 경우 첫 번째 샘플 10초 후에 두 번째 샘플을 추가합니다.

3. 인큐베이션

  1. 연구된 DNase를 37°C의 비율계량 FRET 프로브와 함께 수조 또는 온도 조절 인큐베이터에서 다양한 시간 동안 배양합니다. 규칙적인 샘플링 간격으로 여러 시점을 사용하여 효소 회전율을 정확하게 평가하고 아티팩트를 최소화합니다. LEI의 초약한 핵분해 활성에 대한 제시된 연구는 느린 핵분해 반응을 등록하기 위해 24시간 배양을 사용했습니다.
    참고: 연구된 DNase의 강도에 따라 달라지기 때문에 예비 실험에서 최적의 배양 시간을 결정하십시오. 활성 뉴클레아제는 프로브 절단을 완료하는 데 매우 짧은 시간이 필요하므로 15-30분 배양으로 시작하십시오. 시료가 너무 농축되고 반응이 너무 빠르면 단백질 농도를 낮춰야 합니다. 샘플 단백질이 너무 약하면 필요에 따라 배양 시간이 늘어날 수 있습니다.

4. 동일한 pH 조건에 대한 신호 정규화

  1. 100μL의 250mM Tris-HCL(pH 8.0)을 첨가하여 모든 배양 반응을 중지합니다. 이 단계는 또한 모든 샘플의 pH를 균등화합니다.
    참고: pH 균등화 단계는 서로 다른 pH 조건에서 시작된 반응을 비교할 때 중요합니다. 이 절차는 프로브 조각의 완전한 분리를 보장하여 FRET 기반 신호를 최대화합니다. 또한 프로브의 FAM 형광단 방출은 산성 pH에서 감소하며 pH 8.0에서 최적입니다. 이 연구에 사용된 것보다 이온 강도가 더 높은 샘플의 경우 효과적인 pH 조정을 달성하기 위해 더 농축된(>250mM) 및 더 높은 pH(>8.0) 균등화 용액이 필요할 수 있습니다.
    참고: 알칼리성 pH는 현재 연구에서 입증된 바와 같이 LEI와 같은 산성 뉴클레아제의 활성을 효과적으로 중단합니다. 중성 또는 알칼리성 뉴클레아제의 경우, 신호 평가 전에 적절한 특정 비활성화 방법을 식별하고 적용해야 합니다.

5. 형광 신호 감지 및 FRET 비율 계산

  1. pH 균등화 단계 직후 분광형광계를 사용하여 기증자 형광단과 수용체 형광단 모두의 방출 스펙트럼을 기록합니다. 488 nm에서 기증자 형광단을 여기시키고 동시에 525 nm(기증체) 및 580 nm(FRET 유래 수용체 신호)에서 방출을 검출하여 96웰 플레이트에서 직접 측정을 수행합니다.
  2. 기록된 형광 강도를 사용하여 각 샘플의 DNase 활성을 평가합니다. 적절한 통계적 방법을 적용하여 데이터를 분석하고 유의성을 평가합니다.
    참고: RFRET = 525nm에서의 기증자 방출/580nm에서의 수용체 방출을 사용하여 FRET 비율을 계산합니다. 이 분석에서 DNA 절단은 형광단을 분리하여 FRET를 방해하여 기증자 방출을 증가시키고 수용체 방출을 감소시킵니다. 이러한 변화는 DNase 활성의 지표 역할을 하는 FRET 비율(RFRET)을 높입니다.

6. PAGE 기반 분열 검증

  1. 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)14을 수행하여 FRET 프로브의 절단을 확인합니다. FRET 프로브 및 절단 산물은 형광 표지되어 추가 염색 없이 볼 수 있습니다.
    참고: 대표적인 연구에서 38-mer FRET 프로브의 LEI 매개 절단은 PAGE를 변성시켜 확인되었습니다( 그림 2 참조). 분석 결과 LEI는 6-8-mer FAM 표지 단편과 15-16-mer TAM 표지 단편을 생성했으며, 이는 양쪽 머리핀 정점 근처의 절단과 일치합니다. 이 패턴은 DNase II에서 생성된 프래그먼트 프로파일과 달랐습니다.
    1. 각 샘플 15μL를 20% 변성 PAGE 겔에 로드합니다.
    2. 젤을 100V에서 1시간 동안 실행합니다.
  2. 고해상도 컬러 카메라가 장착된 문서화 시스템을 사용하여 젤 이미지를 획득합니다.
    참고: 대표 연구의 이미지는 디지털 SLR 카메라를 사용하여 캡처되었습니다.

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결과

이 대표적인 연구는 장기간의 관찰이 필요한 느린 효소 반응을 조사하기 위한 비율계량 FRET 접근법의 구체적인 이점을 강조합니다. 특히, 이 애플리케이션은 비율계량 FRET 시스템을 사용하여 LEI의 고유한 DNase 활성을 검출하고 분석하는 방법을 보여줍니다. 이 연구의 결과는 그림 2에 나와 있습니다.

이 접근 방식을 사용하여 LEI가 절단이나 가혹한 화학 처리에 대한 노출을 통한 효소 활성화 없이 약산성 조건에서 DNase 활성을 나타낸다는 것을 입증했습니다. 우리는 이러한 핵분해 활성이 pH 5.5의 용액에서 검출할 수 있는 LEI의 고유한 특성≤ 확인했습니다. 크기는 적당하지만 활성은 매우 안정적이었으며 pH는 4.8에서 5.2 사이로 DNase II 계열 구성원과 유사했습니다

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토론

이 연구는 약한 뉴클레아제인 백혈구 엘라스타제 억제제(LEI)를 사용하여 DNase 활성의 검출 및 평가를 위한 비율계량 FRET의 적용을 보여줍니다. 이 접근 방식은 단백질과 생체 분자의 DNase 특성을 평가하기 위한 편리하고 정량적인 방법을 제공합니다. 프로토콜은 간단하고 데이터 분석 절차는 직접적이고 간단합니다. 이 분석은 다양한 산성 pH에서 긴 배양을 허용하는 38-mer FRET 프로브를 사용합니다. 우리가 입증한 바와 같이 이 특성을 통해 분석은 사소하고 느린 DNA 절단도 감지할 수 있습니다. 이러한 안정성은 분자 비콘19,20과 같은 다른 프로브 기반 방법에 비해 뚜렷한 이점을 제공하며, 이는 장시간 배양 및 낮거나 높은 pH 조건에서 덜 안정적입니다

비율계량 FRET 분석을 통해 pH, 이온 조건...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NIH의 국립 일반 의학 연구소(National Institute of General Medical Sciences)의 보조금 R01 GM148812의 지원을 받았습니다. NIH의 국립 암 연구소(National Cancer Institute)의 R21 CA255979 보조금으로; NIH(모두 VVD)의 R21 AG073887 및 R21 AG071978 보조금.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 플레이트송골매353219
DNA FRET 프로브IDT DNA5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM – 플루오레세인-dT;   탐 – 테트라메틸로다민-dT. 
DNase II시그마 알드리치D8764
EVOLT 디지털 SLR 카메라올림푸스E500
전원 공급 장치가 있는 젤 전기영동 장치바이오 래드
레이노보프로틴CJ01 시리즈
LiCOR 겔 이미징 시스템리코
뉴클레아제가 없는 물인비트로젠10977015
프리캐스트 PAGE 젤인비트로젠EC68852
아세트산나트륨 완충액 pH 5.2시그마 알드리치S2899-100ML
분광형광계테칸새파이어 2

참고문헌

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