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방법 논문

고립된 미토콘드리아에서 이종생물 수송 및 효과 공개: 호흡량 측정 및 효소 분석의 통찰력

1.2K 조회수

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DOI:

10.3791/67146

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2025년 3월 7일

 ,  , 
1Grupo de Investigación en Bioquímica y Microbiología (GIBIM), Escuela de Química, Universidad Industrial de Santander, 2Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales - Cintrop. Escuela de Medicina, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Industrial de Santander, Parque Tecnológico y de Investigaciones Guatiguará Km 2 El Refugio Piedecuesta

이 논문에서

요약

본 연구는 호흡량 측정 및 효소 분석을 통해 미토콘드리아 기능에 대한 생체이물의 효과를 연구하는 방법론을 소개한다. 다양한 종의 전자 전달 사슬 조절을 조사하여 곤충 매개체 매개 질병에 대한 표적 생물 살충제 개발에 대한 통찰력을 제공합니다.

초록

미토콘드리아는 전자 전달 사슬(ETC)을 통한 에너지 생산에 중요한 역할을 하기 때문에 종종 세포의 발전소라고 합니다. 그러나 그 중요성은 에너지 생산에 훨씬 그치지 않습니다. 미토콘드리아 생체 에너지학의 조절 장애는 건강과 세포 기능에 영향을 미치는 세포 내 연쇄 반응을 유발할 수 있습니다. 미토콘드리아 기능의 생리학적 중요성을 감안할 때, 새로운 치료법과 바이오 제품을 개발하기 위해 미토콘드리아 기능의 약리학적 잠재력을 탐구하는 데 관심이 높아지고 있습니다. 미토콘드리아 생물 에너지학을 조절하면 신경 퇴행성 질환, 대사 질환 및 암과 같은 문제를 해결하고 해충 및 매개체 매개 질병을 통제하기 위한 바이오 제품을 개발하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공할 수 있습니다.

이 연구는 복합체 I에 대한 글루타메이트 및 NADH, 복합체 II에 대한 숙시네이트, 복합체 III 및 IV에 대한 시토크롬 c(산화 및 환원 모두)를 포함한 다양한 기질을 사용하여 전자 전달 사슬(ETC)에 대한 이종생물체의 영향을 평가하는 방법을 제시합니다. 이 방법론을 사용하면 미토콘드리아 복합체를 통한 전자 전달의 활성화 또는 억제를 호흡계와 분광 광도계를 사용하여 평가할 수 있습니다. 미토콘드리아는 분리된 미토콘드리아, 단편화된 세포 또는 다양한 종의 균질화된 조직에서 얻을 수 있습니다.

실험실에서는 Aedes aegypti 와 Wistar 쥐에서 미토콘드리아 기능을 분석했지만 이 방법은 Rhipicephalus microplus 및 Rhodnius prolixus와 같은 다른 종에도 적용할 수 있습니다. 이 접근법은 언커플러 단백질의 존재와 고유한 에너지 요구량에 의해 영향을 받는 종 특이적 산화성 기질 선호도에 대한 이론화의 기초를 제공합니다. 최근의 연구 결과는 미토콘드리아 기능을 표적으로 하는 혁신적인 생물살충제 설계 전략에 대한 귀중한 통찰력을 제공하며, 매개체 매개 질병 및 해충 침입을 효과적으로 통제할 수 있는 상당한 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

미토콘드리아는 산화적 인산화 과정에서 화학 에너지 생성으로 인해 항상 세포의 발전소라고 불려 왔습니다 1,2. 미토콘드리아는 주요 핵심 대사 기능 외에도 세포 내 Ca2+ 조절 수준, 염증 과정, 활성 산소종 생성에서 세포 사멸 유도 과정에 이르기까지 다른 많은 세포 과정에도 관여합니다3. 미토콘드리아 생물 에너지학과 그 조절 장애는 세포 기능과 전반적인 건강에 영향을 미치는 세포 내 과정과 관련이 있습니다. 이는 혁신적인 치료법과 안전한 바이오 제품을 개발하기 위해 미토콘드리아 기능을 표적으로 하는 제약 잠재력을 연구하는 데 대한 관심을 불러일으켰습니다 4,5,6. 또한 미토콘드리아 과정의 복잡한 상호 작용과 세포 기능에 미치는 영향을 이해하는 것은 표적 치료법을 개발하고 매개체 매개 질병 및 해충 침입을 통제하기 위한 바이오 제품을 설계할 수 있는 기회를 제시하는 데 중요합니다 7,8.

전자 전달 사슬의 특정 구성 요소를 생체이물(xenobiotics)으로 표적으로 삼는 것은 생물농약 생성을 위한 미토콘드리아 기능을 조절하는 전략으로 부상했습니다. 나노입자 기반 미토콘드리아 표적 살충제와 같은 살충제 제형에 포함된 천연 및 합성 화합물은 S. frugiperda9에서 미토콘드리아 잠재력과 ATP 합성을 감소시켜 미토콘드리아 기능에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다.

또한, 대부분의 카바메이트 및 피레스로이드 기반 제품은 모기에서 복합 I 억제제로 보고되었습니다. 그러나 그들의 장시간 노출은 Anopheles gambiae에서 일부 피레스로이드 내성 개체군을 생성했으며, 이는 종종 이러한 기질을 대사할 수 있는 P450의 높은 수준과 관련이 있습니다10,11. 유사하게, 식물과 식물의 에센셜 오일, 추출물 및 2차 대사 산물은 다양한 곤충 단계에서 광범위한 폐사율을 갖는 잠재적인 살충제로 기록되었습니다12,13. 이러한 천연 화합물의 살충 활성은 세포 사멸 과정을 유발할 수 있는 활성 산소 종 생성, 미토콘드리아 전위 ΔΨm 및 ATP 합성을 조절하여 미토콘드리아 호흡 사슬의 특정 지점에서 전자 수송 억제와 관련될 수 있습니다 6,8.

살충제 제제의 공급원인 천연 화합물과 미토콘드리아에 미치는 영향은 새롭고 안전한 생물 살충제를 설계하는 데 중요한 역할을 합니다. 이러한 맥락에서 이 원고는 미토콘드리아 복합체를 통한 전자 수송을 활성화하거나 억제하는 생체이물(xenobiotics)의 능력을 확인하는 방법론을 설명합니다. 이 포괄적인 접근 방식을 통해 호흡량 측정법과 분광 광도법 방법을 모두 사용하여 다양한 기질을 사용하여 미토콘드리아 기능에 대한 생체이물계의 효과를 정확하게 측정할 수 있습니다. 이 방법론은 Aedes aegypti를 포함한 주요 매개체 종의 미토콘드리아 기능을 분석하는 데 적용되어 언커플러 단백질의 존재와 각 종에 특이적인 뚜렷한 산화성 기질 선호도를 이론화했습니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 설명된 모든 방법은 산탄데르 산업 대학의 과학 연구 윤리 위원회인 윤리 위원회 "Comité de ética en investigación científica CEINCI"의 승인을 받았습니다. 또한, 이러한 분석은 Arrive 지침을 준수했으며 콜롬비아의 동물 연구를 규제하는 1989년 콜롬비아 법률 84(Chapter IV, Art. 23-26) 및 결의안 8430(1993, Title IV, Art. 83-93)을 따랐습니다.

참고: 이 프로토콜을 시작하기 전에 모든 생화학 서적의 산화적 인산화 장을 읽는 것이 좋습니다.

1. 시약 및 용액

  1. 쥐 간 미토콘드리아를 분리하려면 250mL의 미토콘드리아 분리 완충액(250mM D-만니톨, 10mM HEPES pH 7.2 및 1mM EGTA)을 준비합니다. 50mL의 분리 완충액(BSA가 없는 분리 완충액이라고 함)을 꺼낸 다음 0.2g의 BSA를 다른 200mL(BSA를 사용한 분리 완충액이라고 함)에 추가합니다.
  2. 이집트숲모기 유충을 균질화하려면 100mL의 완충액(250mM 자당, 10mM HEPES, 1mM EGTA pH 7.2)을 준비합니다.
  3. 반응 완충액 준비: 80mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4, 50μM EDTA.
  4. 하기 기재된 바와 같이 pH 7.2에서 효소 활성에 사용되는 시약의 재고를 준비한다: 25 mM NADH (각 분석에 대해 신선하게 제조), 2 M 숙신산나트륨, 4 mM 사이토크롬 c (각 분석에 대해 신선하게 제조), 200 μM 로테논, 0.5 mM KCN, 6 mM 2,6-디클로로페놀린도페놀 (DCPIP), 100 mM 페나진 메토설페이트 (PMS), 및 60 mM 페리시아나이드칼륨.
    참고: 25°C에서 18.2MΩ·cm의 저항률을 가진 초순수가 모든 실험 및 시약 준비에 사용되었습니다. 이 물은 Milli-Q 정제 시스템을 사용하여 생성되어 유기물, 무기물 및 미생물 오염 물질을 검출 가능한 한계 이하로 제거하므로 고감도 생화학 및 분자 생물학 응용 분야에 적합합니다.

2. 쥐 간에서 간 해부, 균질화 및 미토콘드리아 분리

  1. 시작하기 전에 모든 재료와 완충액을 얼음 위에 놓고 미토콘드리아 손상을 방지하기 위해 전체 분석 동안 모든 재료가 얼음처럼 차가워지도록 합니다.
  2. 10mL의 미토콘드리아 분리 완충액을 얼음처럼 차가운 원뿔형 튜브에 넣습니다.
  3. 수컷 Wistar 쥐를 자궁경부 참수로 안락사시키고 호흡 분석을 방해할 수 있는 CO2 사용을 피합니다. 이를 위해 산탄데르 산업 대학(CEINCI)의 과학 연구 윤리 위원회는 2022년 결의안 13에 대한 방법을 승인했습니다.
    참고: 쥐의 무게는 170g을 넘지 않아야 합니다. 지방은 호흡 분석에도 영향을 미칠 수 있습니다.
  4. 멸균 메스로 복부 쥐 부분을 절개합니다(약 4-5cm).
  5. 복부가 보이면 간을 완전히 절개합니다. 쥐의 간은 다엽 기관으로 짙은 빨간색은 약 10cm x 5cm입니다.
  6. 얼음처럼 차가운 격리 완충액 안에 간을 조심스럽게 넣고 이 배지로 두 번 헹굽니다.
  7. 10mL의 분리 배지가 있는 페트리 접시에 날카로운 가위로 간(1cm 미만 크기)을 잘게 다집니다.
  8. 용액을 Potter Elvehjem 조직 균질화 튜브에 넣고 저속(~390rpm)으로 최소 10회 조심스럽게 균질화합니다.
  9. 용액을 원뿔형 튜브로 옮기고 600 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  10. 원심분리 후 상등액을 새 원뿔형 튜브에 조심스럽게 붓습니다. 펠릿과 조직의 일부, 혈액, 손상되지 않은 세포 성분을 버리십시오.
  11. 튜브에 더 많은 분리 버퍼(~35mL)를 채우고 6000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.
  12. 원심분리 후, 상층액을 버리고 펠릿(미토콘드리아)을 BSA가 없는 새로운 분리 완충액에 조심스럽게 재현탁합니다.
    참고: 미토콘드리아 재부유의 경우 부드러운 브러시를 사용하는 것이 좋습니다.
  13. 그런 다음 7000 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 버리고 분리된 미토콘드리아를 BSA 없이 2mL의 분리 완충액에 재현탁합니다.
  14. 브래드포드(Bradford) 방법 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 단백질 농도를 측정한다14.

3. Aedes aegypti 식민지 및 유충 균질화.

참고: 이 절차를 위해 Ae. aegypti 군체는 습도(70% ± 5%), 광주기(12:12) 및 온도(27 ± 5°C)와 같은 곤충 조건에서 번식 케이지(40cm × 40cm × 40cm) 내부에 보관되었습니다. 난자는 여과지에 수집되었습니다.

  1. 실험 일주일 전에 여과수와 탈염소수가 담긴 쟁반에서 알이 부화되었는지 확인하십시오. 유충 주기에서 탈피 과정으로 instar를 식별합니다. 각 탈피 과정을 관찰하여 상태 L1, L2 및 L3을 확인합니다. 유충이 L3에 들어가면 재료를 수집하기 위해 최대 12시간을 기다립니다.
  2. instar L3-L4에서 염소가 없는 물(~30mL의 물)에 최소 100마리의 Ae. aegypti 유충을 수집합니다. 파스퇴르 피펫으로 유충을 가져 가십시오.
  3. 여과지를 사용하여 유충을 여과하고 수집된 유충을 헹구고 Aedes aegypti 균질화 완충액(~2mL)에 다시 현탁시킵니다.
  4. 유충이 있는 용액을 Potter Elvehjem 조직 균질화 튜브로 옮기고 ~390rpm에서 최소 10회 조심스럽게 균질화합니다.
  5. 균질화된 조직을 옮기고 유리솜 주사기를 통해 여과하여 큰 외골격 잔류물을 제거합니다.
  6. 단백질 농도는 브래드포드(Bradford) 방법 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 측정한다15.
    참고: 모기 유충에서 미토콘드리아를 분리할 필요는 없습니다. 이 단계에서 얻은 단백질 추출물을 사용하여 생체이물(xenobiotics)의 효과를 평가할 수 있습니다.

4. 미토콘드리아 전자 전달 사슬에 대한 이종생물제의 영향 결정

참고: 이 프로토콜은 균질화된 쥐의 간과 곤충 조직에서 분리된 미토콘드리아에 대한 미토콘드리아 생물 에너지학에 대한 생체이물학의 효과를 평가하기 위해 고안되었습니다.

분석은 폴라로그래픽(NADH 및 숙시네이트 산화효소)과 분광광도법(NADH 탈수소효소 - 복합체 I, 숙시네이트 탈수소효소 - 복합체 II, 사이토크롬 c 환원효소 - 복합체 III 및 사이토크롬 c 산화효소 - 복합체 IV)의 두 가지로 나뉩니다.

  1. 폴라로그래픽 분석: 이를 위해 고해상도 호흡계를 사용하여 NADH 및 숙시네이트의 완전한 산화를O2 소비로 측정하고 결과를 NADH 및 숙시네이트 산화효소로 보고합니다.
    1. 분석을 시작하기 전에 매일 기기를 교정하십시오. 이 단계는 사용된 산소 그래프에 따라 달라질 수 있습니다. 제조업체의 지침을 따릅니다.
      1. Oroboros 보정을 위해 실험 챔버 부피(2mL)보다 0.2mL 이상 높은 반응 배지를 챔버에 추가하여 챔버와 주입 모세관을 배지로 채웁니다.
    2. 중간 첨가 후 교반기를 켭니다.
    3. 산소 농도 신호가 안정될 때까지 기다렸다가 기록하십시오.
    4. 제로 산소 보정을 위해 산소 고갈을 허용하는 미토콘드리아, 세포 현탁액, 빵 효모 또는 디티오나이트(빵 효모 권장)를 추가하고 기록합니다. 신호가 백그라운드 수준(일반적으로 O2k 시스템의 경우 ± 2pmol/mL/s)에 도달할 때까지 기다립니다.
    5. 챔버에 반응 완충액, 0.1mg의 단백질(균질화된 미토콘드리아 또는 유충) 및 기질(0.17mM NADH 또는 10mM 호박산나트륨)을 추가할 때 산소 소비량을 모니터링하여 NADH 및 숙시네이트 산화효소 활성을 수행합니다.
    6. 전자 수송 단백질 억제제를 사용하여 관찰된 산소 소비량이 미토콘드리아 호흡 사슬에 의한 것인지 확인합니다. 일반적인 것은 로테논 1μM 및 KCN 1mM16입니다. 옥시그래프 셀에서 표 1에 따라 시약을 추가합니다(순서가 중요함).
  2. 분광광도계 분석
    참고: 미토콘드리아 복합체를 통한 전자 전달을 평가하기 위해 분광 광도계와 PMS, DCPIP 및 시토크롬 c와 같은 인공 전자 수용체를 사용하여 효소 분석을 수행하고 측정했습니다. 하루에 하나의 효소를 측정하는 것이 좋습니다. 분석 최소 하루 전에 완충액과 시약을 준비합니다. 일부 화합물은 광연성입니다. 보다 표 2 더 많은 권장 사항을 참조하십시오.
    1. NADH 탈수소효소 활성을 위해 반응 시스템에는 50mM 인산염 완충 용액 pH 7.4, 2mM EDTA, 0.1mg/mL 미토콘드리아 단백질, 1μM 로테논 및 1mM KCN이 포함됩니다. 분광 광도계 셀에서 표 2(순서가 중요함)에 따라 시약을 추가합니다(순서가 중요함)17. 권장되는 단계는 다음과 같습니다.
      1. EDTA와 혼합된 완충액 인산염 100mL를 준비하고 pH가 변하지 않는지 다시 확인합니다. 버퍼는 냉장고에 보관하되 분석 중에는 반드시 실온(RT, 약 25°C)에 보관해야 합니다.
      2. 로테논, KCN, NADH 및 페리시아화칼륨(4시간까지 안정)의 신선한 원액을 준비합니다. 제안된 용량은 1mL의 농축 용액입니다(표의 첫 번째 열 참조).
      3. 테스트된 화합물이 물에 대한 용해도가 낮은 경우 화합물의 용매만 사용하여 실험 설계에 효소 활성에 대한 추가 제어를 포함합니다.
      4. 먼저, 420 nm에서 페리시아화칼륨의 환원에 의한 NADH 탈수소효소 활성을 모니터링한다. 1.04 mM-1·cm-1의 몰 흡광 계수로 농도를 계산하십시오. 분광 광도계에는 반응에서 최대 활성을 계산하는 옵션이 있습니다. 사용 설명서를 확인하십시오. 그런 다음, 보고된 활성을 효소의 특정 활성을 얻는 데 사용되는 단백질의 농도로 나눕니다.
    2. 20mM 숙신산나트륨 및 1mM 페나진 메토설페이트(PMS)에 60μM 2,6-디클로로페놀린도페놀(DCPIP)을 인공 전자 수용체로 첨가하여 숙시네이트 탈수소효소 활성을 평가합니다. 분광 광도계 셀에서 표 3 (순서가 중요함) 17에 따라 시약을 추가합니다. 권장 사항은 다음과 같습니다.
      1. NADH 탈수소효소에 사용된 것과 동일한 완충액을 준비합니다. 동일한 조건에서 유지하십시오.
      2. 숙시네이트, PMS 및 DCPIP의 신선한 원액을 준비합니다. 권장 용량은 농축 용액 1mL입니다. 분석 당일에 PMS 및 DCPIP 용액을 준비합니다.
      3. 테스트된 화합물이 물에 대한 용해도가 낮은 경우 실험 설계에 효소 활성에 대한 추가 대조군을 포함시킵니다.
      4. 600nm에서 DCPIP의 감소에 의한 석시네이트 산화를 모니터링합니다. Beer의 법칙을 적용하여 21.0 mM-1·cm-1의 몰 흡광 계수로 농도를 계산합니다. 그런 다음, 보고된 활성을 효소의 특정 활성을 얻는 데 사용되는 단백질의 농도로 나눕니다.
    3. NADH 또는 석시네이트를 산화성 기질로 사용하여 사이토크롬 c 환원효소(복합체 III) 활성을 측정합니다. 이 효소를 사용하면 복합체 I(NADH 사용) 또는 복합체 II(숙시네이트 사용)의 전자 수송이 유비퀴논으로 전달된 다음 복합체 III로 전달되어 전자를 시토크롬 c로 전달합니다. 이 반응은 시토크롬 c의 감소로 이어집니다. pH 7.4 50mM 인산염 완충 용액, 2mM EDTA, 미토콘드리아 단백질 0.1mg, 50μM NADH 및 0.1mM KCN을 포함하는 반응 시스템을 준비합니다. 분광 광도계 셀에서 표 4(순서가 중요함)에 따라 시약을 추가합니다(순서가 중요함)18. 권장 사항은 다음과 같습니다.
      1. NADH 탈수소효소에 사용된 것과 동일한 완충액을 준비합니다. 동일한 조건에서 유지하십시오.
      2. NADH 탈수소효소와 동일한 NADH 및 KCN을 사용합니다.
      3. 테스트된 화합물이 물에 대한 용해도가 낮은 경우 실험 설계에 효소 활성에 대한 추가 대조군을 포함시킵니다.
      4. 550nm에서 사이토크롬 c 감소를 모니터링하고 Beer의 법칙을 적용하여 19.8mM-1·cm-1의 몰 흡광 계수로 농도를 계산합니다. 그런 다음, 보고된 활성을 효소의 특정 활성을 얻는 데 사용되는 단백질의 농도로 나눕니다.
    4. 시토크롬 c 산화효소 활성으로 발현되는 시토크롬 c 산화효소(복합체 IV)를 측정합니다. 이를 위해 50mM 인산염 완충 용액, pH 7.4, 2mM EDTA 및 0.1mg의 미토콘드리아 단백질을 포함하는 시스템 반응을 준비합니다(표 5). 이러한 효소 분석의 경우, 등몰 양의 사이토크롬 c와 디티오나이트나트륨을 혼합하여 사이토크롬 c를 감소시켜 사이토크롬 c를 완전히 감소시킵니다.
    5. 그런 다음, 생성된 혼합물을 이동상과 동일한 인산염 완충 용액을 사용하여 가교 결합된 dextran 겔 컬럼에 통과시킵니다. 그 후, 550 nm에서 분광 광도계를 사용하여 수집된 분획을 정량화합니다19. 권장 사항은 다음과 같습니다.
      1. NADH 탈수소효소에 사용되는 것과 동일한 완충액을 사용합니다. 동일한 조건에서 유지하십시오.
      2. 테스트된 화합물이 물에 대한 용해도가 낮은 경우 효소 활성에 대한 추가 제어가 실험 설계에 포함되어야 합니다.
      3. 550nm에서 사이토크롬 c 산화를 모니터링하고 Beer의 법칙을 적용하여 19.8mM-1·cm-1의 몰 흡광 계수로 농도를 계산합니다. 그런 다음, 보고된 활성을 효소의 특정 활성을 얻는 데 사용되는 단백질의 농도로 나눕니다.
        참고: 산소 소비량과 분광 광도계로 측정된 효소의 특정 활성을 계산하는 과정을 보여주는 스프레드시트 파일은 보충 파일 1로 포함되어 있습니다.

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결과

이 프로토콜로 얻은 결과를 분석하기 전에 미토콘드리아에서 전자 전달 사슬의 생화학에 대해 조금 기억하는 것이 중요합니다. 첫째, NADH는 복합체 I에 위치한 산화 환원 센터에 한 쌍의 전자를 공급합니다. 거기에서 복합체 I에서 유비퀴논으로 전달되는 전자의 수송을 시작하고, 이어서 복합체 III로 이동하여 시토크롬 c를 기증하고, 마지막으로 산소가 최종 전자 수용체인 복합체 IV로 이동하여 물로 환원시키는 전자의 수송을 시작합니다. 반면에 석시네이트는 복합체 II(숙시네이트 탈수소효소라고도 함)에 전자를 공급합니다. 전자는 복합체 II에서 유비퀴논으로 전달되고 그때부터 위에서 설명한 것과 동일한 경로를 따릅니다. 유비퀴논은 전자를 복합체 III로 운반한 다음 복합체 IV로 전달하여 산소20을 환원합니다.

이 연구에서 설명한 프로토콜은 쥐의 간과 균질화된 이집트숲모 기 유충에서 미토콘드리아 생물 에너지학에 대한 이종생물제의...

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토론

고해상도 O2를 사용한 분광 광도계 및 폴라로그래픽 방법을 사용하여 미토콘드리아 기능에 대한 생체 이물의 영향을 조사했습니다. 이 연구는 쥐 간에서 분리된 미토콘드리아와 균질화된 이집트숲모기 유충이라는 두 가지 생물학적 모델을 사용하여 미토콘드리아 전자 전달 사슬을 통한 전자 전달뿐만 아니라 NADH 및 석시네이트 산화에 대한 Cymbopogon flexuosus 에센셜 오일과 카바크롤의 영향을 구체적으로 평가했습니다. 또한, 전자 수송 사슬의 특정 지점에서 잠재적 인 전자 차단은 DCPIP 및 페리 시아 화칼륨과 같은 인공 전자 수용체를 사용하여 조사되었으며, 분광 광도법16 , 19 , 21을 통해 사이토크롬 c 산화 및 환원을 모니터링했습니다.

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공개 사항

모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 산탄데르 대학교(Universidad Industrial de Santander)의 "Vicerrectoría de Investigación y Extensión VIE"가 "소의 진드기 감염을 방지하기 위해 실험실에서 설계되고 현장에서 검증된 ixodicide 및 ixorepellent의 제형" 프로젝트에 해당하는 보조금 번호 3739에 자금을 지원한 것에 대해 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2,6-디클로로페놀린도페놀머크119814사용 당일에 준비하십시오.
브래드포드 시약MerckB6916
BSA,MerckA7030
CarvacrolMerckW224511
Cytochrome c, MerckC2506감광성 콘버, 알루미늄 호일로 덮습니다. 용액에서는 냉동실에 보관해야 합니다.
D-만니톨MerckM4125
EGTAMerck>E3889
에틸렌디아민테트라아세트산, 테트라소듐염 이수화물, MerckE6511
HEPES,MerckH3375
KCN,Merck60178용액에서 2주 동안 작동합니다.
KH2PO4MerckP5655
Multiskan FC 마이크로플레이트 광도계Thermo Scientific 
Na2HPO4Merck567550
Oroboros O2k Oroboros Instruments10203-03https://www.oroboros.at/index.php/product/o2k-startup/
Phenazine 메토설페이트 MerckP9625사용 당일에 준비하십시오.
포타슘 페리시아나이드 Merck244023사용 당일에 준비합니다.
Potter Elvehjem 조직 균질화 튜브
RotenoneMerck557368에탄올에 용해됩니다. 감광성 콘버트는 알루미늄 호일로 덮습니다. 용액에서는 냉동실에 보관해야 합니다.
호박산 나트륨MerckS9637용액에 넣어 냉동실에 보관해야 합니다.
자당MerckS0389
β-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 감소된 디소듐 염 수화물MerckN8129감광성 콘버는 알루미늄 호일로 덮습니다. 용액에서는 냉동실에 보관해야 합니다.
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참고문헌

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