소뇌 Purkinje 세포(PC)는 DNA 손상 반응의 결핍에 특히 민감합니다. DNA 손상에 대한 PC 반응의 역학을 시각적으로 평가하기 위한 프로토콜이 제시되며, 여기에는 소뇌 기관형 배양 내 단백질 결합 폴리(ADP-ribose) 사슬 염색이 포함됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
소뇌 Purkinje 세포(PC)는 높은 대사율, 특정 염색질 구조 및 광범위한 전사 활성의 독특한 상호 작용을 나타내므로 DNA 손상에 특히 취약합니다. 이를 위해서는 종종 PC 기능 장애 또는 손실로 시작되는 소뇌 변성을 예방하기 위해 효율적인 DNA 손상 반응(DDR)이 필요합니다. 대표적인 예가 게놈 불안정 증후군인 운동실조-모세혈관 확장증(A-T)으로, 점진적인 PC 고갈과 소뇌 악화를 특징으로 합니다. PC에서 DDR 메커니즘을 조사하는 것은 이러한 장애에서 PC의 퇴화로 이어지는 경로를 밝히는 데 매우 중요합니다. 그러나 in vitro 에서 PC를 분리하고 배양하는 복잡성은 오랫동안 연구 노력을 방해해 왔습니다. Murine cerebellar organotypic (slice) 배양은 in vivo 조직 환경을 밀접하게 모방하여 실현 가능한 대안을 제공합니다. 그러나 이 모델은 현미경 이미징에 적합한 DDR 표시기로 제한됩니다. 당사는 유기형 배양 프로토콜을 개선하여 빠르고 빠른 DDR 지표인 단백질 결합 폴리(ADP-ribose)(PAR) 사슬의 형광 이미징이 유전독성 스트레스에 대한 반응으로 이러한 배양 내 PC의 DDR 역학을 효과적으로 드러낸다는 것을 입증했습니다.
서론
세포 DNA의 무결성은 매일 세포당 수만 건의 DNA 병변을 일으키는 활성 산소종과 같은 대사 부산물과 같은 DNA 손상 물질로 인해 지속적으로 위협을 받고 있습니다1. 게놈 안정성의 지속적인 유지는 세포 항상성 2,3에 필수적입니다. 이 유지 관리의 초석은 DNA 손상 반응(DDR)으로, 이는 다른 많은 세포 과정을 신중하게 조정하면서 특정 DNA 복구 경로를 시작하는 복잡하고 계층화된 신호 네트워크입니다 4,5. DDR의 결핍은 일반적으로 염색체 불안정성, 진행성 조직 저하, 성장 또는 발달 장애, 암에 대한 소인, 특정 DNA 손상 물질에 대한 민감성 증가를 특징으로 하는 '게놈 불안정 증후군'으로 나타납니다 6,7,8,9. 특히, 종종 소뇌 위축을 ....
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프로토콜
재료, 장비 및 항체에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 동물 시술은 텔아비브 대학 윤리 위원회의 승인 후 윤리 지침에 따라 채택되었습니다. 이 절차는 성별에 관계없이 10일 된 새끼 쥐에게 수행됩니다. 필요한 경우, 꼬리 생검 및 표준 방법을 사용하여 전날에 유전형 분석을 수행합니다. 용액은 멸균되며 달리 명시되지 않는 한 4°C에서 보관됩니다. 표 1을 참조하십시오.
1. 문화의 준비
알림: 멸균 환경에서 절차를 수행하고 70% 에탄올을 사용하여 미리 작업 표면을 소독하십시오.
- 6웰 플레이트의 각 웰에 1mL의 BME를 추가합니다. 멸균 겸자를 사용하여 단일 세포 배양 삽입물을 각 웰에 넣고 절개 절차 전에 최소 2시간 동안 37°C/5% CO2 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
- 조직 초퍼, 30mm 배양 플레이트, 양안 현미경 및 광원을 포함하는 생물학적 후드 내에 해부 영역을 설정합니다.
- 과정 전반에 걸쳐 수술 도구를 70% 에탄올에 담그십시오. 70....
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결과
그림 1은 소뇌 기관형 배양(cerebellar organotypic cultures)의 일반적인 모습을 보여줍니다. 그림 1A 의 맨 윗줄은 배양 상태에서 유지되는 소뇌 박리를 보여주고, 맨 아래 줄은 Calbindin D-28k(녹색)에 대해 염색된 PC와 NeuN(빨간색)에 대해 염색된 신경 세포핵을 보여줍니다. 그림 1B에서 PC의 성상교세포(빨간색)는 중간 필라멘트 유형 III 단백질인 GFAP(녹색)에 대해 염색됩니다. 그림 2 와 그림 3 은 강력한 산화제인 두 가지 DNA 손상 물질인 브롬산칼륨(12시간 동안 10mM의 최종 농도)과 파라콰트로 이러한 배양물을 처리한 후 관찰된 PAR 염색을 보여줍니다. PAR 반응은 대조군과 비교하여 소뇌 foliu.......
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토론
일반 의견
유기형 배양 시스템의 주요 장점은 소뇌 피질 조직을 사용하여 연구를 용이하게 하여 배양 접시 설정에서 몇 주 동안 구조적 조직을 보존한다는 것입니다. 이 시스템은 수상돌기 가시 및 초구조적 특징(52,53,54,55,56,57,58,59)에 대한 상세한 검사를 포함하여 Purkinje 세포(PC)에 대한 심층적인 형태학적 분석을 수행하는 데 유용합니다.......
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공개 사항
저자들은 이 연구와 관련된 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
우리 연구실의 연구는 Dr. Miriam and Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation과 Israeli Association for Fighting the A-T Disease의 지원을 받고 있습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 및 장비 | |||
| 150 x 30cm 페트리 접시 | Corning Inc. | 3261 | |
| 35 x 10mm 페트리 접시 | 코닝 | 3294 | |
| Acetone | Invitrogen | 25030081 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| 접착 현미경 슬라이드 | Marienfeld | 48187 | 76 x 26 x 1 mm |
| 헬리콥터용 블레이드 | TED PELLA | 모델 TC752-1 | 스타일 면도날 |
| BME | GIBCO | 41010-026 500ml. | L-Glut 없음 |
| 세포 배양은 | Millipore | PICM0RG50 | |
| D-Glucose | Biological Indo | 02-015-1A | |
| HBSS w/o 페놀 레드 | Sigma-Aldrich | H-1138-500L | No Ca+,No Mg+ |
| HBSS with 페놀 레드 | Sartorius | 02-015-1A | |
| 말 세럼 | GIBCO | 26050088 | 열 비활성화 |
| 아이리스 펜치 | CellPath | GZX-0100-00A | 130mm 무딘 톱니 모양의 |
| 아이리스 스파튤라 | F.S.T | 10092-12 | |
| L-글루타민 (200 mM) | Gibco | 41010026 | |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 322412-1L | |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| 현미경 | GRIGENE | ||
| 장착 매체 | . Ltd, 이스라엘 | K239320A | |
| Paraquat | Sigma-Aldrich | 856177-250MG | Paraquat dichloride (Methyl viologen) |
| PARG- Poly(ADP-Ribose) Glycohydrolase inhibitor | Tocris Bioscience, United Kingdom | PDD 00017273 | light sensitive |
| 인산염 완충액 | 생물학적 인도. | 02-018-1A | |
| 가위, 피부 조직 | |||
| 여섯 웰 플레이트 | Corning 통합 | CLS3516 | |
| 예비 절단 디스크 | TED PELLA | 모델 10180-01 | |
| 조직 초퍼 | McIlwain | 모델 TC752 | 10180-220 |
| 핀셋, 뾰족한 | |||
| 요로 컵 | |||
| Antibodies | |||
| Alexa fluor 488 당나귀 안티 토끼 IgG | Invitrogen | A21206 | 1:500; 이차 ab; 2차 희석 완충액; 실온에서 2 시간 동안 배양 |
| Anti glial fibrillary acidic protien | Milliphore | MAB3402 | 1:1500; 1 차 ab; 차단; 호스트 : 마우스 |
| 안티 칼빈딘 - D-28K | Swant | CB300 | 1:2000; 기본 ab; 블로킹; 호스트: rabbit |
| 안티-칼빈딘-D-28K | 스완트 | CB-38a | 1:2000; 기본 ab; 차단 |
| Anti-pan-ADP-ribose 시약 | Milliphore | MABE1016 | 1:800; 1차 ab; 차단; 실온에서 2시간 동안 배양 |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride) | Cell signaling | 4084 | 1:1000; 2차 희석 완충액; 실온에서 20분 동안 배양 |
참고문헌
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Negrini, S., Gorgoulis, V. G., Halazonetis, T. D. Genomic instability--an evolving hallmark of cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (3), 220-228 (....
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