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방법 논문

Efficient Tonsillar T Follicular Helper Cell Processing and Functional Analysis 통한 High-dimensional 유세포 분석법

957 조회수

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DOI:

10.3791/67188

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2025년 7월 11일

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1Cell Signaling and Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 3Rheumatology Fellowship Training Program, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, 4Division of Pediatric Otolaryngology, Children's National Hospital, 5Division of Otolaryngology, Department of Surgery, George Washington University School of Medicine and Health Sciences

이 논문에서

요약

여기에서는 편도선 샘플 수집 및 처리, 고차원 스펙트럼 유세포 분석을 사용한 표현형 분석, 비지도 분석을 수행하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

T 여포 도움 세포(Tfh)는 B 세포 동형 전환, 생식 중심(germinal center, GC) 형성, 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation) 및 친화력 성숙(affinity maturation)을 돕는 CD4+ T 도움 세포의 하위 집합으로, 감염, 자가면역 및 백신 접종 중 2차 림프 조직에서 적응성 체액성 면역 반응을 조율하는 데 도움이 됩니다. Tfh 세포의 발달 및 기능을 이해하는 것은 효과적인 백신을 설계하고 이 집단과 관련된 질병에 대한 표적 치료 전략을 개발하는 데 중요합니다. 인간의 편도선 세포는 접근 가능한 점막 림프 기관입니다. 이들은 Tfh 및 GC 세포와 같은 뚜렷한 면역 집단을 프로파일링하고, 세포 간 상호 작용을 조사하고, 동적 세포 기능을 평가하고, 장기 수준에서 조절 메커니즘을 밝힐 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 또한 편도선 세포의 체외 배양은 처리가 간단하며 다양한 조건에서 Tfh 세포 생물학을 평가할 수 있습니다. 여기에서는 인간 편도선 세포의 수집, 분리, 보존 및 배양을 위한 프로토콜을 소개합니다. 또한 Tfh 세포의 심층적인 특성화를 위해 설계된 두 개의 최적화된 스펙트럼 유세포 분석 패널에 대해 설명합니다. 마지막으로, 인산가수분해효소 단백질 2A(PP2A) 억제제 처리를 예로 들어 고차원 유세포 분석 데이터의 비지도 분석의 효율성과 성능을 입증하여 고차원 규모에서 치료로 인한 차이를 효과적으로 밝혀냅니다.

서론

T 여포 도움 세포(Tfh)는 생식 중심(germinal centers, GC) 및 B 세포 항체 생산의 형성 및 기능에 필수적인 CD4+ 보조 T 세포의 뚜렷한 하위 집합입니다. Tfh 세포는 항원 제시 세포와의 상호 작용 및 T 세포 수용체 신호, B 세포, 사이토카인 및 케모카인과의 공동 자극 상호 작용을 포함한 내적 및 외적 요인의 통합을 통해 naive CD4+ T 세포에서 유래합니다1. Tfh cell은 CXCR5 및 PD-1을 발현하며, 이는 GC 내부 또는 GC 근처에서 위치를 안내합니다. BCL-6은 Tfh 개발, 유지 관리 및 기능 1,2에 중요한 마스터 전사 인자입니다. Tfh 세포는 특히 백신 반응과 박테리아 및 바이러스 병원체에 대한 방어에서 체액성 면역 반응을 증가시키는 데 중추적인 역할을 합니다. 비정상적인 Tfh 세포 반응은 자가면역 질환, 면역 결핍 및 잠재적으로 일부 형태의 암을 포함한 다양한 장애와 관련이 있습니다 3,4,5,6. 따라서 이들의 기능과 조절을 이해하는 것은 효과적인 백신 및 치료 전략을 개발하는 데 중요하다7.

체외 분화 시스템이잘 확립되어 있는 Th1, Treg 및 Th17과 같은 다른 CD4+ T 보조 세포와 달리8, Tfh 세포의 발달은 역동적인 세포 간 상호 작용과 특화된 해부학적 구조를 포함하기 때문에 연구가 더 복잡합니다7. 따라서 Tfh 세포에 대한 연구는 인간 말초 순환 Tfh 세포(cTfh) 및 생체 내 마우스 모델의 생체 외 표현형에 크게 의존해 왔습니다. 따라서 Tfh 세포에서 특정 분자의 조절을 조사하는 것은 특히 인간 Tfh 세포의 경우 어렵습니다9. 따라서 림프 조직에서 유래한 Tfh 세포에 대한 심층적인 생체 외 연구는 인간 Tfh 세포에 대한 이해를 높이는 데 필수적입니다.

2차 림프 기관인 편도선은 pre-Tfh (CXCR5intPD-1int CD4+) 및 GC-Tfh (CXCR5hiPD-1hi CD4+) 세포와 같이 말초 혈액에 존재하지 않는 독특한 세포 집단을 가지고 있으며, 둘 다 GC를 형성하는 데 중요한 역할을 합니다. 또한, 구개 편도선은 소아 수술에서 가장 일반적으로 제거되는 조직 중 하나이며 쉽게 접근할 수 있어 Tfh 세포와 관련된 복잡한 면역 메커니즘을 탐색하는 데 귀중한 인체 조직 공급원입니다. 편도선은 호흡기 바이러스 감염의 주요 부위인 상기도에 위치하기 때문에 이러한 바이러스 감염에 대한 면역 반응을 조사하는 데 유리한 조직을 제공합니다. 예를 들어, 본 연구실에서는 이전에 COVID-19에서 회복된 어린이의 편도선과 아데노이드에 있는 Tfh 세포를 특성화하고 이러한 조직을 감염되지 않은 대조군의 조직과 비교했습니다10. 여기에서는 편도선 세포를 처리하고 보관하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. PP2A 억제제 처리된 편도선을 예로 들어 고차원 스펙트럼 유세포 분석을 통해 이러한 세포를 특성화하고 비지도 분석을 사용하여 데이터를 분석하는 방법을 자세히 설명합니다.

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프로토콜

세계의사협회(World Medical Association)의 윤리 강령(헬싱키 선언)은 이 연구의 모든 인간 연구에서 따랐다. 인간 편도선 표본은 수면 호흡 장애 또는 폐쇄성 수면 무호흡증을 유발하는 아데노톤실라 비대 환자로부터 얻었으며, 이는 미국 워싱턴 DC에 있는 아동 국립 병원의 소아 이비인후과 부서에서 제공되었습니다. 이 연구는 Children's National Hospital의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다(IRB 프로토콜 번호 00009806). 등록된 모든 참가자의 부모 또는 보호자가 사전 동의서에 서명했으며 7세 이상의 미성년자 참가자로부터 동의를 얻었습니다.

1. 인간 편도선 채취 및 단세포 분리 및 보관

  1. 편도선 단일 세포의 분리
    1. 수술용 검체 채취
      1. 편도선 절제술을 받는 환자로부터 편도선을 채취하고 수술실에서 25-35mL의 얼음처럼 차가운 멸균 편도선 배지로 채워진 50mL 원심분리 튜브에 신선한 조직 조각을 채취합니다: 5% 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS), 0.05mg/mL 겐타마이신, 10mM 글루타민 및 항생제-항진균제 혼합물(100 units/mL 스트렙토마이신, 100 units/mL 페니실린, 및 0.25μg/mL 암포테리신 B).
        참고: 위 배지의 편도선은 4°C에서 하룻밤 동안 보관하고 다음날 처리할 수 있습니다. 세포 생존율의 최소 손실은 당일 처리와 비교하여 야간 보관에서 확인되었습니다(그림 1A). 편도선은 얼음에 담아 하룻밤 동안 배송할 수도 있습니다.
    2. 편도선 가공
      참고: 모든 배지, 완충액 및 수술 도구는 멸균 상태여야 하며, 편도선 세포 분리는 생물 안전 후드의 얼음 위에서 수행해야 합니다.
      1. 5mL의 냉각된 편도선 배지가 들어 있는 60mm 플라스틱 세포 배양 접시에 편도선을 놓습니다. 얼음 위에서 작업하십시오. 멸균 핀셋과 가위 또는 메스를 사용하여 눈에 보이는 혈전, 지방 및 결합 조직을 조심스럽게 제거합니다(그림 1B, C).
      2. 편도선을 얼음처럼 차가운 편도선 배지 5mL가 있는 새로운 60mm 세포 배양 접시로 옮깁니다. 편도선 조각을 3-5mm 조각으로 자릅니다.
      3. 차가운 편도선 배지 10mL와 함께 새로운 60mm 세포 배양 접시를 준비하고 접시에 70μm 세포 여과기를 놓습니다.
      4. 편도선 조각을 거름망으로 옮기고 멸균 3mL 주사기의 플런저 끝을 거름망을 통해 편도선 조각을 부수십시오.
      5. 접시의 스트레이너 외부에 세포가 포함된 배지를 모아 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
      6. 여과기로 접시에 편도선 배지 10mL를 추가로 추가하고 플런저로 편도선 조각을 부수고 원뿔형 튜브에 배지를 수집합니다. 큰 편도선의 경우 여과기에 결합 조직 조각만 남을 때까지 이 단계를 2-3배 더 반복합니다. 남은 티슈와 사용한 플레이트는 생물학적 위험 백과 의료 폐기물에 넣으십시오.
      7. 50mL 원뿔형 튜브를 편도선 배지로 맨 위까지 채웁니다.
      8. 400 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리기.
        참고: 원심분리를 20분으로 연장하면 수율이 증가할 수 있습니다.
      9. 조심스럽게 흡입하거나 피펫으로 빼내어 상층액을 제거하고 펠릿을 실온(RT)에서 5mL의 암모늄-염화-칼륨(ACK) 용해 완충액에 재현탁시켜 적혈구를 용해합니다. RT에서 5분 동안 배양한 다음 추가 용해를 방지하기 위해 냉각된 PBS 35mL를 추가합니다. 400 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
      10. 50mL의 차가운 PBS와 원심분리기로 한 번 세척합니다. 10mL의 PBS와 변형 세포를 70μm 플라스틱 여과기를 통해 재현탁합니다. 셀 수를 셉니다.
  2. 편도선 세포의 동결 보존
    1. 냉동 매체(90% 열 불활성화 FBS 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO))를 준비합니다.
      참고: 최대 4개월 동안 1°C에서 보관할 수 있습니다.
    2. 세포 현탁액을 400 × g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리(단계 1.1.2.10)합니다. 상등액을 버리고 세포 펠릿을 동결 매체로 재현탁합니다.
      참고: 10 × 106 - 50 × 106 cells/mL of 동결 매체11의 밀도로 세포를 동결하는 것이 좋습니다.
    3. 세포 현탁액의 0.5-1mL를 멸균 cryovials로 분취합니다. 바이알을 -80°C 냉동고에서 속도 조절이 가능한 냉동 용기에 담아 동결합니다. 장기 보존을 위해 일주일 이내에 액체 질소가 들어 있는 저장 탱크로 바이알을 옮깁니다.
  3. 얼어붙은 세포 해동
    참고: 단일 세포 RNA 염기서열분석을 위한 시료 전처리 프로토콜에서 참조된 순차 희석 해동 접근법은 아래12에 설명되어 있습니다. 다른 해동 방법도 효과가 있을 수 있지만, 세포를 따뜻한 해동 버퍼에 즉시 넣는 것보다 이 방법이 더 큰 세포 생존율을 발견했습니다(그림 1D). 세탁 버퍼는 미리 준비할 수 있습니다. 해동 버퍼는 세척 버퍼와 0.1mg/mL DNase I(DNase I은 해동을 시작하기 직전에 추가해야 함)으로 구성됩니다. 세포 수율을 높이기 위해 원심분리 시간을 1분/mL(15mL 튜브의 경우)로 늘리는 것은 선택 사항입니다.
    1. 수조를 37 °C로 데우십시오. 해동을 예열하고 37°C 수조에서 완충액을 세척합니다.
      참고: 모든 세포 세척은 RT에서 수행됩니다.
    2. 보관에서 꺼낸 직후 37°C 수조에서 2-3분 동안 냉동 용액을 해동합니다. 바이알을 수조에 완전히 담그지 마십시오. 작은 얼음 결정이 보이는 동안 수조에서 바이알을 꺼냅니다.
    3. 생물 안전 후드의 넓은 구멍 피펫 팁을 사용하여 해동된 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 0.5mL의 예열된 해동 버퍼로 냉동 용기를 헹구고 15mL 원뿔형 튜브에 헹굼 한 방울(5초마다 1방울)을 넣고 튜브를 부드럽게 흔들어 섞습니다.
    4. 15mL 코니컬 튜브에 2mL를 점진적으로 첨가한 다음 4mL의 배지를 첨가하여 첨가 사이에 ~1분의 대기 시간을 두고 세포를 순차적으로 희석합니다. 3-5초마다 1mL의 비율로 배지를 튜브에 넣고 부드럽게 소용돌이치며 섞습니다.
    5. 상온에서 5 분 동안 400×g의 원심분리기.
    6. 상층액을 제거하십시오. 세포 펠릿을 300μL의 해동 완충액에 재현탁시키고; RT에서 5분 동안 배양합니다.
    7. 세척 완충액 10mL를 추가합니다(DNase I 없음). 상온에서 400 × g 에서 5분 동안 다시 원심분리기를 합니다.
    8. 한 번 더 세척: 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 10mL의 세척 완충액에 재현탁합니다. 상온에서 5 분 동안 400×g의 원심분리기.
    9. 70μm 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 실온에서 400 × g 에서 5분 동안 다시 원심분리기를 하고 세포를 계수합니다. 배양 배지에 재현탁합니다.

2. 생체 외 처리 후 세포 내 사이토카인 및 전사 인자의 발현 측정

참고: 여기에서는 두 개의 고차원 유세포 분석 패널을 사용하여 편도선 Tfh 세포의 표현형 특성을 분석하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. PP2A 활성이 최적의 BCL-6 단백질 발현과 Tfh 분화4에 필수적이라는 점을 감안할 때, PP2A 억제제인 칸타리딘(CAN)으로 처리된 편도선 세포 검사를 통해 Tfh 세포 유지 및 기능에 대한 평가를 설명합니다.

  1. 유세포 분석 염색
    1. 세포 내 사이토카인 염색
      참고: 부화는 어둠 속에서 수행됩니다. 시약, 항체 및 두 패널에 사용된 웰당 각각의 수량은 Table of Materials에 나열되어 있습니다. T 세포 탈과립화를 평가하기 위해 치료 단계에서 항-CD107a 항체를 첨가하여 내부화로 인한 위음성 결과를 최소화합니다13.
      1. 플레이트 2 × 106 편도선 세포와 200 μL의 배양 배지(1 × 107 세포/mL)를 96웰 U 바닥 플레이트 웰에 넣고 16시간 동안 다음 양의 PP2A 억제제 CAN을 사용합니다: 차량 제어, 3 μM 및 6 μM.
        참고: CAN은 1% DMSO로 0.1M로 재구성되었습니다.
      2. 37 oC에서 5% CO2 인큐베이터에서 2.5시간 동안 각 웰에 monensin(0.7 μL/mL), brefeldin(1:1,000), phorbol 미리 스테이트 아세테이트(50 ng/mL, PMA), ionomycin(1,000 ng/mL) 및 2 μL anti-CD107a를 추가합니다. 총 배양 부피는 웰당 200 μL입니다.
      3. 항체 응집체를 제거하기 위해 4°C에서 3-5분 동안 ~16,000 × g 에서 원심분리기 염색 항체. 케모카인 수용체, Brilliant Stain Buffer Plus 및 FACS 완충액을 제외한 모든 표면 항체를 포함하는 2.1.1.8단계에 대한 표면 항체 혼합물을 준비합니다( 재료 표에 언급된 각각의 부피, 반응당 총 112μL의 혼합물).
      4. 배양에서 2.5시간을 완료한 후 400°C에서 2 분 동안 400g에서 원심분리하여 200μL의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 2× 세척합니다. 세척 사이에 플레이트를 빠르게 뒤집어 상층액을 버리십시오. 같은 플레이트에서 염색을 수행합니다.
      5. PBS에서 1:800 희석된 LIVE/DEAD Blue 염료의 100 μL/well에서 RT에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 200 μL의 FACS 완충액으로 2x 세척합니다.
      6. RT에서 5분 동안 True Stain Monocyte Blocker(5μL monocyte blocker + well당 45μL FACS buffer)로 세포를 재현탁합니다.
      7. 염색 반응에 직접 chemokine receptor 항체를 순차적으로 추가합니다(먼저 anti-CXCR3 및 anti-CCR7을 각각 10분 동안 투여한 후 항-CXCR5 및 anti-CCR6를 10μL의 Brilliant Stain Buffer Plus와 함께 RT에서 5분 동안 혼합). 첨가할 때마다 여러 차례 위아래로 피펫팅하여 잘 섞으십시오. 항체 부피에 대해서는 Table of Materials 를 참조하십시오.
      8. 2.1.1.3단계에서 준비한 표면 항체 혼합물을 염색 반응에 직접 추가하고 RT에서 30분 동안 배양합니다. 반응당 총 염색 부피는 180μL: 완충액 내 50μL 단핵구 차단제(2.1.1.6 단계 참조) + 18μL의 항-케모카인 수용체 항체(2.1.1.7 단계 참조) + 112μL의 표면 항체 혼합물(2.1.1.3 단계 참조)입니다.
      9. 200μL의 차가운 FACS 버퍼로 2회 세척합니다.
      10. 세포를 재현탁하고 80μL/웰의 파라포름알데히드 기반 고정 완충액으로 RT에서 20분 동안 배양합니다.
      11. 이미 고정 완충액이 포함된 각 웰에 160μL의 1x 투과성 완충액을 추가합니다. 400 × g 의 플레이트를 상온에서 2분 동안 원심분리하고 200 μL의 투과 완충액으로 1x 세척합니다.
      12. 항사이토카인 항체, Brilliant Stain Buffer Plus 및 투과화 완충액을 포함하는 세포 내 사이토카인(ICS) 항체 혼합물을 준비합니다(총 부피 50 μL/well, Table of Materials). 이 세포 내 사이토카인 항체 혼합물로 세포를 RT에서 30분 동안 배양합니다.
      13. 200 μL/well 투과화 완충액으로 2x 세척합니다. 200μL/well의 FACS 버퍼로 재현탁합니다.
      14. 염색된 세포를 어두운 곳에서 4°C에 보관하고 24시간 이내에 스펙트럼 유세포 분석기에서 데이터를 획득하여 염색 강도14의 손실을 최소화합니다.
    2. 핵 전사 인자 염색
      1. 2.1.1.1단계에서와 같이 CAN으로 세포를 배양합니다(세포를 자극하지 않음).
      2. 배양 배지에 anti-human CD40 항체(0.5 μg/mL)를 첨가하고 염색을 시작하기 전에 15분 동안 세포로 배양합니다. 세포가 자극되면 자극을 시작하기 15분 전에 이 항체를 추가하여 활성화 시 CD40L의 내재화를 방지합니다15,16.
      3. 염색 항체를 원심분리하고 2.1.1.3단계와 유사한 표면 항체 혼합물을 준비합니다: 재료 표의 표면 항체, Brilliant Stain Buffer Plus의 10μL/웰 및 FACS 완충액의 54.1μL/웰.
        참고: 웰당 총 염색 부피는 180μL: 완충액 내 단핵구 차단제 50μL + 케모카인 수용체 항체 13μL + 표면 항체 혼합물 117μL.
      4. 세포를 세척하고 2.1.1.5-2.1.1.8 단계와 같이 LIVE/DEAD Blue 염색 및 표면 염색 및 세척을 수행합니다.
        참고: 항-CXCR3 항체는 이 패널에 포함되어 있지 않습니다.
      5. FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer Set에서 80μL의 핵 전사 인자 고정 완충액으로 세포를 고정합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
      6. 2.1.1.11단계와 같이 투과화 완충액으로 세포를 세척합니다.
      7. Table of Materials에 나열된 항전사 인자 항체, 10μL의 Brilliant Stain Buffer Plus 및 16μL의 투과성 완충액(총 부피 40μL/well)을 포함하는 세포 내 transcription factor(TF) 항체 혼합물을 준비합니다. 이 혼합물로 세포를 4 °C에서 1 시간 동안 배양합니다.
      8. 2.1.1.13-2.1.1.14 단계와 같이 스펙트럼 세포분석기에서 세척 및 획득합니다.

3. 고차원 유세포 분석 데이터의 비지도 분석

참고: 분석에 사용되는 소프트웨어, 패키지 및 해당 버전은 재료 표에 나열되어 있습니다. 3.2단계부터 3.4단계까지의 화면 캡처는 보충 파일 1에 있습니다. 3.5 - 3.7 단계의 예시 스크립트는 Supplemental File 2 및 Supplemental File 3에 있고, 3.8 - 3.9 단계는 Supplemental File 4 및 Supplemental File 5에 있습니다. 스크립트에 대한 ICS 원시 파일 및 TF 원시 파일은 각각 보충 파일 6 및 보충 파일 7에 제공됩니다.

  1. ".fcs" 파일이 저장된 유세포 분석 소프트웨어 작업 공간을 열고 그림 1E와 같이 게이팅을 완료합니다.
  2. 대상 노드(이 경우 CD4+ T 셀)를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. [Select Equivalent Nodes]를 선택합니다.
  3. 대상 노드를 다시 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다. 모집단 내보내기/연결(Export/Concatenate Populations)을 선택합니다.
  4. 채우기: 내보내기 또는 연결 창이 열릴 때까지 기다렸다가 CSV 채널 값을 선택하고 내보낸 파일의 대상을 선택합니다. Include Events(이벤트 포함) 상자에 모든 셀을 포함하고 Parameters(매개 변수) 상자에서 All compensated parameters(보정된 모든 매개 변수)를 선택합니다. 고급 옵션을 확장하고, 파일 이름을 바꿀 접두사를 입력하고, 내보내기를 클릭하여 파일을 대상 폴더로 내보냅니다(각 샘플에 대해 하나의 .csv 파일 내보내기).
  5. 내보낸 "*.csv" 파일을 R(각 샘플당 하나씩)을 사용하여 읽습니다. 각 셀에 샘플 ID를 할당하고 모든 샘플의 셀을 단일 데이터 프레임으로 결합합니다.
  6. 메타데이터(샘플에 대한 추가 정보)를 데이터 프레임에 추가하거나 병합합니다.
  7. 다음 분석을 위해 표본당 동일한 수의 셀을 무작위로 다운샘플링합니다. 이 단계는 선택 사항입니다.
    참고: 이 예에서는 각 조건의 총 CD4+ T 세포에서 8,000개의 CD4+ T 세포를 다운샘플링했으며, 이는 총 CD4+ T 세포 수의 최소 1/7을 나타냅니다.
  8. Seurat 객체 생성: Seurat 객체를 생성할 때 항체 마커에 대한 채널 값을 유전자 발현 수준으로 해석합니다.
    1. 3.6단계에서 생성된 데이터 프레임으로 Seurat 객체를 생성합니다. NormalizeData 단계를 건너뛰고 "데이터" 분석으로 직접 저장합니다.
    2. 흐름 패널에서 비지도 군집화에서 VariableFeatures 로 사용할 표면 마커를 선택합니다.
    3. NormalizeData 17단계를 제외하고 Serat에서 도입된 표준 파이프라인으로 ScaleData, RunPCA, FindNeighbors, FindClusters, RunUMAP을 실행합니다.
    4. FindClusters 단계에서 해상도 매개 변수를 조정하여 클러스터 수를 수정하여 기본 생물학적 컨텍스트를 보다 정확하게 반영하도록 합니다.
  9. Seurat 패키지와 호환되는 DimPlot 및 FeaturePlot 과 같은 시각화 도구를 사용할 수 있습니다. 그룹당 여러 표본이 포함된 그룹을 비교하려면 개체별로 각 클러스터의 백분율을 계산하고 통계 비교를 수행합니다. 그런 다음 보다 정교한 통계 분석을 위해 수학적 모델을 사용합니다10.

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결과

전반적인 세포 생존력을 비교하기 위해 편도선을 세 개의 유사한 조각으로 자르고 (1) 당일 처리, (2) 4°C에서 하룻밤 보관, (3) 얼음에 하룻밤 보관의 세 가지 조건에서 프로토콜을 사용하여 처리했습니다. 이 세 가지 조건 간의 생존 가능성은 큰 차이 없이 매우 유사했습니다(그림 1A). 우리는 또한 해동 과정이 세포의 생존력에 미치는 영향을 평가했습니다. 우리가 사용한 적하 해동 방법은 동일한 공여자의 동결 편도선 샘플을 해동한 후 직접 매체 해동 방법에 비해 세포 생존율이 훨씬 더 높았습니다(그림 1D). 그런 다음 스펙트럼 유세포 분석법으로 Tfh 세포의 심층적인 특성화를 가능하게 하기 위해 32 color intracellular cytokine panel과 28 color transcription factor panel을 사용하여 회수된 동결 편도선 세포를 염색했습니다. 염색을 통해 두 패널의 유세포 분석 데...

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토론

신선한 편도선은 수술 후 3시간 이내에 처리해야 한다는 이전 보고와 달리,19, 신선한 편도선 샘플은 4°C에서 보관하고 24시간 이내에 처리했을 때 생존력을 유지할 수 있음을 발견했다. 액체 질소 저장에서 해동할 때 편도선 조직의 세포 생존력을 최적화하기 위해, 높은 세포 생존율이 매우 중요한 단일 세포 염기서열분석에서 권장되는 적하 해동 방법을 채택했다12. 이 접근 방식을 통해 일반적으로 사용되는 직접 빠른 해동 방법에 비해 살아있는 세포를 최적으로 회수할 수 있었습니다(그림 1D). 수술로 인한 파편과 소작된 조직을 제거하면 생존 가능한 편도선 세포의 수율이 향상됩니다. 편도선 처리 중 원심분리 시간을 연장하면 세포 수율을 더욱 향상시킬 수 있습니다. 그러나 특히 여러 샘플을 동시에 처리할 때 장시간 처리하면 전체 세포 생존...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 NIAID, NIH의 교내 연구 부서의 지원을 받았습니다.

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재료

항체 및 사이토카인 패널 에 대한 기타 리젠트로 보충된 RPMI(+L-글루타민당 L 믹스당 L 혼합 단100 &mu를 위한 배양 배지의 g/mL당 L 믹스당 L 혼합 557299
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Machines and instruments
3 mL 플라스틱 주사기BD309657
96웰 U 바닥 플레이트Thermo Scientific163320
1.2 mL 극저온 바이알Corning430487
Cell strainer 70 & micro; m 나일론팔콘352350
세포 배양 접시(60mm)VWR10062-890
원심분리기Thermo ScientificSorvall Legend XTR
벤치마크 B2000-2 MyBath 2L 디지털 수조벤치마크B2000-2
고급 가위 - SharpF.S.T14060-11
플라스틱 기기 케이스F.S.T20830-05
스펙트럼 유세포 분석기, AuroraCytek5L 16UV-16V-14B-10YG-8R
표준 패턴 겸자FST11000-13
표준 패턴 겸자FST11000-20
Vi-cell Blu 세포 생존율 분석기 Beckman CoulterC19201
Reagents
0.5 M EDTA pH 8.0품질 생물학351-027-101
2-메르캅토에탄올Gibco21985-023
ACK 용해 완충액GibcoA10492-01
항생제-항진균제 혼합물(페니실린-스트렙토마이신-암포테리신 B 현탁액, 100x)Gibco15240-062
브릴리언트 염색 완충액 플러스(RUO)BD566385
칸타리딘시그마C7632-25MG
사이토픽스 고정 완충액BD 554655
디메틸 설폭사이드(DMSO)시그마D8418-250ml
DNAase IRoche10104159001
태아 소 혈청(FBS)VWR97068-085
FoxP3/전사 인자 염색 완충액 세트eBioscience00-5523-00
겐타마이신(50mg/mL)Gibco15750-060
GolgiplugBD555029
GolgiSTOPBD554724
HEPES (1 M)Gibco15630-080
아이오노마이신시그마  I0634-1mg
L-글루타민(200mM)Gibco25030-081
MEM NEAA(100x)Gibco11140-050
파라포름알데히드 16% 용액, EM 등급(PFA)전자 현미경
  Science		15710PBS
PBS, pH 7.4Gibco10010072
Penicillin-Streptomycin(10,000 U/mL)Gibco15140-122
Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)SigmaP8139-1mg
속도 제어 냉동 용기MilliporeCorning CoolCell FTS30
RPMI (+L-글루타민)Gibco11875-085
피루빈산나트륨(100mM)Gibco11360-070
True-Stain 단핵구 차단제BioLegend426103
완충액
배양 배지10% 열 비활성화 FBS(VWR),
2 nM 글루타민,
0.055 mM 2-메르캅토에탄올,
1% 페니실린/ 스트렙토마이신,
1 mM 피루브산나트륨,
10 mM HEPES,
RPMI(+L-글루타민)에서 1% 비필수 아미노산
FACS 완충액PBS에서 2 mM EDTA 및 2% 열 비활성화 FBS
동결 배지90% 열 비활성화 FBS 및 10% DMSO
해동 완충액세척 완충액 + 0.1 mg/mL DNaseI
편도선 배지5% 열 비활성화 FBS,
10mM 글루타민,
0.05mg/mL 겐타마이신,
1% 항생제-항진균제 혼합물
  (페니실린, 스트렙토마이신 및 암포테리신 B).
10%  열 비활성화 FBS 및 10mM HEPES세척 완충액
);
비오틴 항인간 CD107a(LAMP-1) 항체BioLegend3286042 & 200 & mu의 L; 웰당 L 완전 배양 배지.
이 항체는 PMA/이오노마이신 자극 동안 세포와 함께 첨가되었습니다.
Live Dead 염색100 μ 웰
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0.125 & 100 & mu의 L; 웰당 L PBS. 
단핵구 차단50 μ 웰
핵구 차단제 완충액BioLegend4261035 μ L True Stain 단핵구 차단제 및 45 μ L FACS 완충액 당 웰
사이토카인 패널용 표면 항체
케모카인 수용체 혼합μ L/웰 
항인간 CCR6-BV711바이오레전드353436 1
항인간 CCR7-BV421바이오레전드3532081
항인간 CXCR3-PE-Cy5BD5511285
항인간 CXCR5-BV750BD7471111
브릴리언트 염색 버퍼 플러스(RUO)BD56638510
         18 & 무; 케모카인 수용체에 대한 웰당 L 혼합;
단핵구 블록 완충액
기타 표면 항체 혼합물μ L/웰 
항인간 CD103-BUV661BD7499932.5
항인간 CD14-스파크 블루 550바이오레전드3671482.5
항인간 CD19-스파크 NIR 685바이오레전드3022702.5
항인간 CD25-BB515 BD56446710
항인간 CD27- 슈퍼 브라이트 436써모62-0279-425
항인간 CD3-BV510바이오레전드3448282.5
항인간 CD38 APC-Fire810바이오레전드3035501
항인간 CD4 CF YG584CytekR7-200412.5
항인간 CD45RA-BUV395BD7403150.6
항인간 CD56-BUV737BD6127663.5
항인간 CD57-FITCBioLegend3596041.2
항인간 CD69-BUV563BD7487641
항인간 CD8-BUV805BD6128891.2
항인간 FAS-BB700BD5665420.6
항인간 HLA-DR APC-Fire 750BioLegend3076582
항인간 PD1-BV785BioLegend3299291.2
항인간-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
Brilliant Stain Buffer Plus (RUO)BD56638510
FACS 완충액61
                                   112 & 무; 다른 표면 항체에 대한 웰당 L 혼합;
단핵구 블록 완충액(50 & L) 및 케모카인 수용체 혼합물(18 & 엘, 50+18+112 = 180 &무; 웰당 총 L)
사이토카인 패널에 대한 세포내 사이토카인 항체μ L/웰 
항인간 그랜자임 B-PEBD561142 1
항인간 IL10-PE-Dazzle 594BioLegend5068121
항인간 IL17A-BV605BioLegend5123261
항인간 IL2-BV650BioLegend5003343
항인간 IL21- Alexa Fluor 647BD56049310
항인간 IL4-PerCP Cy5.5BD5612341
항인간 퍼포린-APC바이오레전드353312 2.5
항인간 TNFa-PE-Cy7바이오레전드5029300.1
항-IFN&감마;-퍼시픽 블루바이오레전드5025221
SAv-BUV615BD613013 0.25
브릴리언트 스테인 버퍼 플러스(RUO)BD566385 10
1x 투과 완충액 & NBSP;eBioscience00-5523-0019.15
       (50 & L mix per well)<
strong>Antibodies & other regents for transcription factor panel
CD40 Antibody, anti-humanMiltenyi Biotec130-094-1330.5 & mu; 작업 농도
Live Dead 염색; 웰
LIVE DEAD BlueThermoL23105  1 : 800, 0.125 & 100 & mu의 L; 웰당 L PBS. 
단핵구 차단제 완충액BioLegend4261035 & mu; L True Stain 단핵구 차단제 및 45 μ 웰당 L FACS 완충액
전사 인자 패널에 대한 표면 항체
케모카인 수용체 혼합μ L/웰 
항인간 CCR6-BV711BioLegend353436 1
항인간 CCR7-BV421BioLegend353208
1 항인간 CXCR5-BV750BD7471111
브릴리언트 스테인 버퍼 플러스(RUO)BD56638510
       13 &무; 웰
기타 표면 항체 혼합μ L/웰 
항인간 4-1BB-PE-CY7BioLegend3098182.5
항인간 CD14-Spark Blue 550BioLegend3671482.5
항인간 CD19-Spark NIR 685BioLegend3022702.5
항인간 CD200-PerCP-eFluor 710ThermoFisher46-9200-422.5
항인간 CD25-PE-Cy5BioLegend3026085
항인간 CD3-BV510바이오레전드344828 2.5
항인간 CD38-APC-Fire810바이오레전드3035501
항인간 CD4-퍼시픽 블루바이오레전드3174231
항인간 CD40L-PEBD15
항인간 CD45RA-BUV395BD7403150.6
항인간 CD56-BUV737BD6127663.5
항인간 CD69-BUV650바이오레전드3109342.5
항인간 CD8-BUV805BD6128891.2
항인간 HLA-DR APC-Fire 750바이오레전드3076582
항인간 ICOS-BUV563BD7414211.2
항인간 OX40-APC바이오레전드3500085
항인간 PD1-BV785BioLegend3299291.2
항인간-CD45-PerCPThermoMHCD45311.2
브릴리언트 스테인 버퍼 플러스(RUO)BD56638510
FACS 완충액54.1
             117  &무; 다른 표면 항체에 대한 웰당 L 혼합;
단핵구 블록에 직접 추가  버퍼(50 & L) 및 케모카인 수용체 혼합물(13 & 엘, 50+13+117 = 180 &무; 웰당 총 L)
전사 인자 패널에 대한 전사 인자 항체μ L/웰 
항인간 T-bet-BV605BioLegend6448174
항인간 Bcl6-PE-CF594BD5624014
항인간 FoxP3-Alexa Fluor 488BD5608871.6
항인간 GATA3-BB700BD5666422
항인간 Ki67-Alexa Fluor 700BD5612770.4
항인간 Rorgt-Alexa Fluor 647BD5636202
브릴리언트 염색 버퍼 플러스(RUO)BD56638510
1 x 투과화 버퍼 eBioscience00-5523-0016
                               40 & 무; L 웰당 혼합
비지도 분석을 위한 소프트웨어 및 패키지
Software/packageVersion<strong>Source
1data.표1.16.2종합 R 아카이브 네트워크
2FlowJO10.9.0Becton, Dickinson and Company
3pheatmap1.0.12종합 R 아카이브 네트워크
4R4.3.2종합 R 아카이브 네트워크
5readxl1.4.3종합 R 아카이브 네트워크
6Rstudio2023.12.1+402Posit PBC
7Seurat5.1.0종합 R 아카이브 네트워크
8SeuratData0.2.2.9001종합 R 아카이브 네트워크
9SpectroFlo3.0Cytek
10tidyverse2.0.0종합 R 아카이브 네트워크
11viridis0.6.5종합 R 아카이브 네트워크
으로 희석

참고문헌

  1. Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
  2. Choi, J., et al. Bcl-6 is the nexus transcription factor of t follicular helper cells via repressor-of-repressor circuits. Nat Immunol. 21 (7), 777-789 (2020).
  3. Goubet, A. G., et al. Escherichia coli-specific CXCL13-producing TFH are associated with clinical efficacy of neoadjuvant PD-1 blockade against muscle-invasive bladder cancer. Cancer Discov. 12 (10), 2280-2307 (2022).
  4. Jiang, Y., et al. Protein phosphatase 2A propels follicular T helper cell development in lupus. J Autoimmun. 136, 103028(2023).
  5. Overacre-Delgoffe, A. E., et al. Microbiota-specific T follicular helper cells drive tertiary lymphoid structures and anti-tumor immunity against colorectal cancer. Immunity. 54 (12), 2812-2824.e4 (2021).
  6. Patel, P. S., et al. Translational regulation of TFH cell differentiation and autoimmune pathogenesis. Sci Adv. 8 (25), eabo1782(2022).
  7. Alameh, M. G., et al. Lipid nanoparticles enhance the efficacy of mRNA and protein subunit vaccines by inducing robust T follicular helper cell and humoral responses. Immunity. 55 (6), 1136-1138 (2022).
  8. Sekiya, T., Yoshimura, A. In vitro Th differentiation protocol. Methods Mol Biol. 1344, 183-191 (2016).
  9. Ueno, H., Banchereau, J., Vinuesa, C. G. Pathophysiology of T follicular helper cells in humans and mice. Nat Immunol. 16 (2), 142-152 (2015).
  10. Xu, Q., et al. Adaptive immune responses to SARS-CoV-2 persist in the pharyngeal lymphoid tissue of children. Nat Immunol. 24 (1), 186-199 (2023).
  11. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q. Z., Maltzman, J. S., Stee, V. G. T. L. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101(2016).
  12. 10x Genomics. Cell thawing protocols for single cell assays. CG000447. , https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1710525012/CG000447_Handbook_CellThawingProtocols_SingleCellAssays_Rev_B.pdf (2024).
  13. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J Immunol Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).
  14. Diks, A. M., et al. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research. J Immunol Methods. 475, 112616(2019).
  15. Poloni, C., et al. T-cell activation-induced marker assays in health and disease. Immunol Cell Biol. 101 (6), 491-503 (2023).
  16. Dan, J. M., et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science. 371 (6529), eabf4063(2021).
  17. Hao, Y., et al. Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis. Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2024).
  18. Ditoro, D., et al. Differential IL-2 expression defines developmental fates of follicular versus nonfollicular helper T cells. Science. 361 (6407), eaao2933(2018).
  19. Assadian, F., et al. Efficient isolation protocol for B and T lymphocytes from human palatine tonsils. J Vis Exp. (105), e53374(2015).
  20. Florek, M., et al. Loss of CD62L expression in CD4+FoxP3+regulatory T cells following freeze-and-thaw prevents protection against gvhd in murine models. Blood. 124 (21), 2427-2427 (2014).
  21. Frigyesi, I., et al. Robust isolation of malignant plasma cells in multiple myeloma. Blood. 123 (9), 1336-1340 (2014).
  22. Anselmo, A., et al. Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function. Cytometry Part A. 85 (4), 292-301 (2014).
  23. Berhanu, D., Mortari, F., De Rosa, S. C., Roederer, M. Optimized lymphocyte isolation methods for analysis of chemokine receptor expression. J Immunol Methods. 279 (1-2), 199-207 (2003).
  24. Den Braanker, H., Bongenaar, M., Lubberts, E. How to prepare spectral flow cytometry datasets for high dimensional data analysis: A practical workflow. Front Immunol. 12, 768113(2021).

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