이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 테스트하기 위한 간소화된 워크플로우를 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 암 치료의 양상을 바꾸어 놓았으며, 이전에는 불치의 혈액암에서 기록적인 관해율을 달성했습니다. 이러한 성공은 주로 면역 반응을 조절하고 억제하는 역할을 하는 CD4+ T 세포의 작지만 중추적인 하위 집합인 조절 T 세포(Tregs)에 CAR 플랫폼을 적응시키는 데 대한 관심을 불러일으켰습니다. Tregs의 면역억제 활성을 세포 외 표적으로 리디렉션하는 능력은 자가면역 질환, 장기 이식 거부 반응 및 이식편대숙주질환에 대한 세포 치료법을 만드는 데 엄청난 영향을 미칩니다. 여기에서는 인간 말초 혈액에서 진정한 Treg 분리, 아데노 관련 바이러스 매개 상동 유도 복구(HDR) 템플릿 전달을 사용하여 렌티바이러스 또는 CRISPR/Cas9 보조 knock-in을 사용한 인간 Tregs의 유전자 변형 및 안정적인 인간 CAR Tregs의 생체 외 확장에 대한 방법론을 자세히 설명합니다. 마지막으로, 인간 CAR Treg 표현형 안정성과 체외 억제 기능에 대한 평가를 설명하며, 이를 통해 인간 CAR Tregs가 전임상 및 임상 응용 분야에서 어떻게 작용하는지에 대한 통찰력을 제공합니다.
서론
키메라 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR) T 세포 치료법은 혈액 악성 종양 치료에 혁명을 일으켜 이전에는 치료가 불가능했던 암에서 현저하게 높은 관해율을 달성했습니다 1,2. 교모세포종 3,4,5을 치료하기 위해 CAR T 세포를 사용한 고무적인 초기 결과는 광범위한 악성 종양을 표적으로 할 수 있는 CAR 기술의 다양성과 미래 잠재력을 강조합니다. 이 분야에서 CAR의 추가 응용 분야를 탐구함에 따라 조절 T 세포(Tregs)가 유망한 세포 유형으로 부상했습니다. Tregs는 면역 항상성을 유지하고 IL-2 격리, 면역 억제 사이토카인 분비, 항원 제시 세포 조절 등 여러 메커니즘을 통해 면역 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다 6,7.
CAR 기술을 통해 Tregs는....
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프로토콜
1. 인간적인 Treg 고립
- Leukopak 가공
- 류코팩의 내용물을 50mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 피펫과 부드럽게 혼합하여 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) +2% 소 태아 혈청(FBS)을 동일한 부피로 추가합니다.
- 실온(RT)에서 300× g에서 10분 동안 회전합니다. 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 2mL의 DPBS + 2% FBS로 세포 펠렛을 재구성합니다. 피펫으로 염화암모늄 용액 8mL를 세포 현탁액에 4:1 비율로 첨가하고 완만한 반전으로 혼합한 다음 얼음 위에서 15분 동안 남은 적혈구를 용해시킵니다.
- RT에서 10 분 동안 300×g으로 회전합니다. 상층액을 조심스럽게 흡입합니다. DPBS 30mL + 2% FBS를 첨가하여 세포를 세척합니다. 브레이크를 끈 상태에서 세척된 세포를 150×g에서 RT에서 10 분 동안 회전 시킵니다. 상층액을 조심스럽게 흡인합니다. 세포 펠릿을 30mL의 DPBS + 2% FBS에 재현탁합니다.
- 현재 분리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 트리판 블루가 있는 세포를 1:1 비율로 계산합니다.
- 세포 농도가 높기 때문에 처음에는 10....
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결과
여기에 설명된 프로토콜은 자가면역 질환, 이식편대숙주질환, 장기 이식 거부 반응 및 알레르기에 대한 살아있는 치료제를 만드는 것을 목표로 인간 조절 T 세포(Tregs)에서 새로운 키메라 항원 수용체(CAR) 구조를 평가하기 위한 간소화되고 표준화된 파이프라인을 제공합니다. 그림 1은 생체 외 확장 후 Treg 계통 전사 인자 FOXP3 및 HELIOS의 높은 수준으로 평가된 FACS(그림 1A)를 사용하여 말초 혈액에서 매우 순수한 인간 Tregs를 얻는 방법을 보여줍니다(그림 1B).
인간 Treg에서 유전자 변형을 수행하는 두 가지 방법, 즉 렌티바이러스 형질도입(그림 2)과 CRISPR/Cas9 매개 유전자 넉인(
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토론
이 프로토콜은 인간 키메라 항원 수용체 조절 T 세포(CAR Tregs)를 생성하고 평가하기 위한 간소화되고 포괄적인 방법론을 제공합니다. 혈액암 치료에 대한 CAR 기술의 성공은 T 세포의 면역 억제 하위 집합인 Tregs에 적용되도록 영감을 주었습니다. 기존 T 세포와 달리 Tregs는 면역 반응을 억제하여 자가면역 질환, 장기 이식 거부 반응, 이식편대숙주병, 알레르기와 같은 원치 않는 면역으로 인한 질환에 대한 잠재적인 치료법을 제공합니다9. CAR Tregs를 활용하면 항원 특이적 치료가 가능하여 광범위한 면역억제제와 관련된 부작용을 피할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다11. 여기에서는 CAR로 엔지니어링할 때 Treg 계통의 안정성과 기능을 검증하기 위한 in vitro 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기사에서 논의하지는 않았지만, 면역결핍 NSG 마우스는.......
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공개 사항
LMRF는 발명자이며 조작된 면역 세포에 대한 특허로 로열티를 받았으며 Guidepoint Global 및 McKesson에 컨설팅을 제공하고 있습니다. 나머지 저자는 경쟁 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
LMRF는 HIRN(Human Islet Research Network) Emerging Leader in Type 1 Diabetes Grant U24DK104162-07, ACS(American Cancer Society) Institutional Research Grant IRG-19-137-20, South Carolina Clinical and Translational Research(SCTR) 파일럿 프로젝트 Discovery Grant 1TL1TR001451-01, DRC(Diabetes Research Connection) Grant IPF 22-1224 및 Swim Across America Grant 23-1579의 지원을 받습니다. RWC는 세포, 생화학 및 분자 과학 교육 보조금 T32GM132055 and Hollings Cancer Center Lowvelo Graduate Fellowship의 지원을 받습니다. 이 연구는 사우스캐롤라이나 의과대학 Hollings Cancer Center의 유세포 분석 및 세포 분류 공유 리소스(P30 CA138313)의 일부 지원을 받았습니다. CAR 돌연변이 플라스미드를 선물해 주신 UCSF(University of California, San Francisco)의 Qi....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 아데노관련바이러스 ( AAV) | Charles River Laboratories | ||
| CAR 타겟 발현 K562 세포 | (예: CD19-K562 | ||
| Cesium-137 조사기 | |||
| Anti-human CD8, PerCP(클론, SK1) | Biolegend | 344708 | |
| Anti-human CD4, PE/Cy7(클론, SK3), | Biolegend | 344612 | |
| DynaMag-15 자석 | ThermoFisher | 12301D | |
| 고스트 BV510 생존 염료 | TONBO | 13-0870-T100 | |
| K562 세포 | 미국형 배양 컬렉션 | CCL-243 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Gibco | ||
| 1 M HEPES | Gibco | 15630080 | |
| 암모늄 클로라이드 솔루션 | STEMCELL Technologies | 7850 | |
| 안티-휴먼 CD127 PE (클론 hIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | |
| 안티-휴먼 CD25 APC (클론 BC96) | Biolegend | 302610 | |
| Anti-human CD4 FITC (클론 SK3) | Biolegend | ||
| Anti-human CD71 PE (클론 SK1) | Biolegend | 334106 | |
| Anti-human CD8 PerCP (클론 SK1) | Biolegend | ||
| 안티-휴먼 CTLA-4 PerCP-e710 | ThermoFisher | 46-1529-42 | |
| 안티-휴먼 EGFR APC (클론 AY13) | 바이오레전 | 드 352905 | |
| 안티-휴먼 FOXP3 eFluor 450 | ThermoFisher | 48-4776-42 | |
| 안티-휴먼 HELIOS PE | Biolegend | 137216 | |
| Ca2+ 및 Mg2+ 무료 Dulbecco' s 인산염 완충 식염수(DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| 세포 카운터 (TC20 자동 세포 카운터) | Bio-Rad | 1450102 | |
| 세포 계수 슬라이드 | Bio-Rad | 1450016 | |
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| DNA LoBind 튜브 | Eppendorf | 22431021 | |
| Easy 50 EasySep 자석 | STEMCELL Technologies | 18002 | |
| EasySep Human CD4+ T 세포 농축 키트 | STEMCELL Technologies | 19052 | |
| EasySep Human CD8+ T 세포 농축 키트 | STEMCELL Technologies | 19053 | |
| EasySep 자석 | STEMCELL Technologies | 18000 | |
| eBioscience Foxp3 전사 인자 염색 버퍼 세트 | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Falcon Round-Bottom 폴리스티렌 테스트 튜브와 셀 스트레이너 스냅 캡, 5 mL | Fisher Scientific | 08-771-23 | 40μ m |
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| 형광 활성화 세포 분류기 | BD Biosciences | FACS Aria III 세포 분류기 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
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| TrueCut Cas9 Protein v2 | ThermoFisher | A36496 | |
| Trypan Blue solution | 시그마 | T8154-100ML | |
| 1/10 Leukopak | STEMCELL Technologies | 200-0092 | 1-20억 PBMC |
참고문헌
- Zhang, X., Zhu, L., Zhang, H., Chen, S., Xiao, Y. CAR-T cell therapy in hematological malignancies: current opportunities and challenges. Front Immunol. 13, 927153(2022).
- Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell thera....
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재인쇄 및 허가
