이 프로토콜은 머리가 고정된 마우스의 뇌간에서 생체 내 고밀도 단일 뉴런 기록을 얻는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 전신 마취 전과 전신 마취 중에 REM(Rapid Eye Movement) 수면 중에 비활성화된 뇌간 영역인 복외측 수관 주위 회색에서 뉴런의 활동 전위 발화를 측정하기 위해 배포됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
실리콘 다중전극 기반 기록은 많은 뇌 영역에서 활동 전위의 시간적 해상도에서 신경 활동을 연구하는 데 점점 더 인기를 얻고 있습니다. 그러나 다중 채널 프로브를 사용하여 뇌간과 같은 깊은 꼬리 구조에서 신경 활동을 기록하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 중요한 관심사는 상부 시상 정맥동 및 횡 정맥동과 같은 큰 혈관을 피하는 프로브 삽입을 위한 궤적을 찾는 것입니다. 이러한 큰 정맥을 손상시키면 광범위한 출혈, 기저 뇌 조직의 손상 및 잠재적으로 사망을 유발할 수 있습니다. 이 접근법은 전방 좌표를 각진 접근법과 결합하여 기록 프로브가 고위험 혈관 구조 아래의 뇌를 관통할 수 있도록 함으로써 뇌간 구조를 표적으로 하는 것을 설명합니다. 엄격한 수직적 접근법과 비교했을 때, 각진 접근법은 목표로 삼을 수 있는 뇌 영역의 수를 최대화합니다. 이 전략을 사용하면 REM 수면과 관련된 뇌간 영역인 vlPAG(ventrolateral periaqueductal gray)에 재현성 있고 신뢰할 수 있게 접근하여 세보플루란 마취 전과 마취 중에 머리 고정 마우스에서 단일 단위, 다중 전극 기록을 얻을 수 있습니다. 높은 시간 해상도로 vlPAG 및 주변 핵의 신경 활동을 기록하는 능력은 REM 수면과 마취 간의 관계에 대한 이해를 발전시키는 데 한 걸음 더 나아간 것입니다.
서론
실리콘 다전극 기반 기록은 단일 활동 전위 분해능 1,2,3,4로 많은 뇌 영역에서 신경 활동을 측정하기 위해 점점 더 대중화되고 있습니다. 지난 10년 동안 고밀도 녹음 기술은 상당히 성장했습니다. 현재의 실리콘 기반 기록 전극은 높은 채널 수, 광섬유 및 전기 피질 검사(ECoG) 기록 장치(5,6)를 수용할 수 있습니다. 더욱이, 이들 전극의 만성 이식은 장기 기록(7,8)을 가능하게 한다.
최근의 기술 발전에도 불구하고 다중 채널 프로브로 뇌간과 같은 깊은 꼬리 구조를 표적으로 삼는 것은 여전히 어려운 일입니다. vlPAG(ventrolateral periacqueductal gray)와 같은 뇌간 구조를 표적으로 삼을 때 한 가지 중요한 장애물은 주요 혈관(예: 상시상 정맥동 및 횡방향 정맥동)을 피하는 프로브 궤적을 식별하는 것입니다. 이러한 큰 정맥의 손상은 광범위한 출혈, 기저 뇌 조직의 손상, 심지어 사망을 유발할 수 있습니다 9,10. 우리는 전방 좌표에서 비스듬히 뇌간 구조를 표적으로 삼아 기록 프로브가 이러한 고위험 혈관 구조 아래의 뇌를 관통할 수 있도록 할 것을 제안합니다(그림 1 참조). 이 각도 접근 방식은 수직 접근 방식에 비해 기록에 액세스할 수 있는 뇌 영역의 수를 최대화합니다. 또한, ECoG 기록이 필요한 실험 상황에서, 프로브 삽입을 위한 개두술 창이 더 앞쪽에 위치하기 때문에 각진 전방 접근법은 ECoG 헤드셋 이식에 사용할 수 있는 더 많은 두개골 표면을 제공합니다(10,11).
마취에 의한 REM 수면 변화를 담당하는 특정 세포군과 회로를 식별하는 것은 마취 연구의 주요 목표로 남아 있습니다. 따라서, 여기서의 목표는 REM 수면과 관련된 뇌간 영역인 vlPAG에 재현성 있고 신뢰할 수 있게 접근하여 세보플루란 마취 전과 마취 중에 머리 고정 마우스에서 단일 단위, 다중 전극 기록을 얻는 것이었습니다12,13. 이전 연구에서는 마취와 관련된 신경 상태 변화를 식별하기 위해 깨어 있는 마우스에서 vlPAG의 전기생리학적 국소자기전위(LFP) 측정을 사용했습니다14,15. 그러나, LFP 측정은 주로 기록된 영역(16) 내의 활동 전위가 아닌 시냅스 활성에 민감하다. 결과적으로, 마취제가 vlPAG 뉴런에 의해 생성되는 신경 활동 패턴에 어떻게 직접적인 영향을 미치는지에 대한 이해는 제한적입니다. 여기에서, 머리가 고정된 마우스의 뇌간으로부터 고밀도의 단일 뉴런 기록을 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 또한 다양한 다른 심부 및 후방 뇌간 구조의 단일 뉴런 활동을 기록하는 데 적용할 수 있습니다.
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프로토콜
모든 연구는 버지니아 대학교(버지니아 주 샬러츠빌)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 3-7개월 된 25-30g의 수컷 C57BL/6J 마우스 5마리를 사용하였다. 여기에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 헤드플레이트 및 헤드셋 이식
- PFA(Perfluoroalkoxy) 코팅된 스테인리스강 와이어를 3핀 커넥터 헤더에 납땜하여 ECoG 헤드셋을 만듭니다(그림 2A).
- 마우스 입체택시 아틀라스(17)를 기반으로 삽입 좌표를 식별한다. 피타고라스 정리를 사용하여 프로브 삽입의 각도와 깊이를 계산하는 것은(특히 문헌에 정보가 거의 없는 경우) 합리적인 시작점입니다(그림 1)18.
참고: 궁극적으로 좌표는 시행착오를 통해 조정됩니다. vlPAG를 표적으로 하기 위해 성체 마우스에서 전후(AP) -3.6mm, 내측(ML) +0.5mm, 배측(DV) -4mm의 좌표를 사용했습니다. 프로브를 20° 각도(AP)로 삽입했습니다. - 유도 챔버(산소의 1.5%-3% 이소플루란)에 마우스를 넣어 전신 마취를 유도합니다. 마취가 완료되면 마우스를 입체 프레임에 놓고 동물의 코를 노즈 콘에 놓고 헤드 바(head bars)로 머리를 고정합니다.
- 각막 손상을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오. 온도 조절 시스템을 사용하여 체온을 37°C로 유지하십시오.
- 제모 크림을 바르거나 두피에 털을 면도한 다음 포비돈 요오드와 70% 알코올로 소독합니다. '팁만' 무균 기술을 사용하여 멸균 수술 영역을 유지하십시오.
- 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 끼임 검사를 실시합니다.
- 진통 투여: 카프로펜 2.5mg/kg, 등에 피하 투여.
- 두피를 5mm 절개하여 두정골과 후두골 위의 원형 피부 패치를 제거합니다. 메스 칼날로 수막을 긁어 부드럽게 제거합니다.
- 메스 칼날을 사용하여 근육 부착물을 자르고 두정골과 후두골을 노출시킵니다19. 출혈을 조절하고 두개골 표면을 건조시키기 위해 필요에 따라 과산화수소를 도포합니다. 강한 결합을 얻기 위해 건조한 두개골에 치과용 시멘트와 수지를 바르는 것이 중요합니다.
- 먼저 두개골20의 브레그마와 람다 표시를 식별합니다. 그런 다음 노즈 콘 위치를 조정하여 두개골의 전후 위치를 수평으로 하여 두 랜드마크 사이에 100μm 이상의 높이 차이가 발생하지 않도록 합니다.
- 두개골의 내측 위치를 평평하게 하려면 브레그마와 람다 사이의 두 개의 반대 지점을 각각 시상 봉합사에서 1mm씩 선택하고 높이를 확인합니다. 둘 사이의 높이 차이가 100μm 이상인 경우 헤드 바를 조작하여 두개골의 내측 위치를 조정합니다.
- 브레그마와 람다 사이의 거리를 측정하고 Franklin-Paxinos stereotaxic atlas(보통 4.2mm)17에 보고된 거리와 비교합니다. 측정된 거리와 보고된 거리의 차이를 사용하여 AP 좌표를 비례적으로 조정합니다. 멸균된 연필로 두개골에 개두술 좌표를 표시하십시오.
참고: 측정된 브레그마-람다 거리가 4.2mm와 다른 경우 좌표를 비례적으로 조정해야 합니다. 입체택시 아틀라스에 보고된 모든 AP 좌표는 표준화된 브레그마-람다 거리에 해당합니다. 쥐 두개골의 크기는 가변적이기 때문에 그에 따라 좌표를 조정하는 것이 중요합니다. - 입체적 미세 조작기를 사용하여 헤드플레이트를 람다 봉합사 바로 위에 놓고 헤드플레이트와 그 주변에 치과용 시멘트를 도포하여 두개골에 고정합니다(그림 3A, B). 시멘트가 마를 때까지 최소 10분 동안 기다립니다.
- 두 개의 피질 전극(전두엽 및 두정엽 피질)과 기준 전극(소뇌) 역할을 할 하나를 위해 버 구멍(직경 0.5mm)을 뚫습니다. 코팅된 은선 전극의 벗겨진 끝(0.5mm)을 버 구멍 안에 넣고 자외선 활성 수지를 사용하여 고정합니다.
- 코팅된 스테인리스강 와이어를 치과용 시멘트로 완전히 덮어 와이어가 노출되지 않도록 합니다. 헤드셋의 밑면과 측면을 치과용 시멘트로 덮어 제자리에 단단히 고정되도록 합니다. 헤드셋이 제자리에 고정되면 bregma 및 lambda 봉합사가 계속 보이는지 확인합니다(그림 2B).
- 쥐가 최소 7일 동안 회복하도록 하고 동물과 수술 부위에 이상이 있는지 매일 검사하십시오. 필요에 따라 진통제(Carprofen 2.5mg/kg, SC)를 투여합니다.
2. 실리콘 프로브 배치 및 기록
- 마우스를 녹음 장비에 익숙하게 하고 머리를 고정합니다(두 날에 최소 1.5시간)(그림 2D).
- 녹음 당일, 마우스를 마취실(산소의 이소플루란 1.5%-3%)에 넣습니다.
- 마우스를 입체 프레임에 배치하고 1.3에 설명된 대로 노즈 콘과 헤드 바를 조정합니다. 입체 수술 내내 마취(산소 내 이소플루란 1.5%-3%)를 유지합니다. 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 끼임 검사를 실시합니다.
- 눈에 안과 연고를 바르고 적절한 체온을 유지하십시오.
- 브레그마와 람다를 식별하여 두 해부학적 랜드마크 사이에 100μm 이상의 높이 차이가 없는지 확인합니다.
- 멸균 연필로 두개골에서 계산된 좌표를 찾아 표시한 다음 좌표 주위에 2mm x 2mm 개두창 윤곽을 만듭니다.
- 마취 깊이를 확인하기 위해 발가락 꼬집기 검사를 수행합니다.
- 고속 드릴을 사용하여 2mm x 2mm 개두술 창을 만듭니다. 0.5-1mL의 생리식염수를 도포하여 뇌 표면이 건조해지는 것을 방지합니다. 주사기 바늘과 미세한 집게를 사용하여 경막을 제거합니다.
참고: 과도한 출혈을 피하기 위해 주요 혈관(상시상동, 횡부비동)을 관찰하십시오(그림 3). - 고속 드릴을 사용하여 일반적으로 두개골 창에서 ~1-2mm인 실리콘 프로브의 기준 전극을 위한 별도의 버 구멍을 만듭니다.
- 부착된 어플리케이터를 사용하여 개두술을 완전히 밀봉하기 위해 두개골에 0.2mL의 저독성 실리콘 접착제를 도포합니다.
- 마우스가 약 1시간 동안 회복되도록 합니다.
- 헤드플레이트와 나사를 사용하여 마우스의 머리를 전기생리학 기록 장비에 부착합니다(그림 2D).
- 실험 후 프로브 궤적을 재구성할 수 있도록 실리콘 프로브 섕크에 형광 염료 DiI(1:4 DiI:Ethanol)를 코팅합니다.
- 매니퓰레이터에 프로브를 장착하고 원하는 각도를 설정합니다. vlPAG를 대상으로 하기 위해 15-20°의 AP 각도가 적용되었습니다.
- 기록 프로브를 두개골 창 중앙 내의 뇌 표면으로 내립니다. 먼저 ~300μm 깊이까지 프로브를 수동으로 삽입합니다. 이 깊이에 삽입되면조직 손상을 최소화하기 위해 프로브를 자동으로 천천히 낮추십시오(예: 200μm/min).
알림: 처음에는 프로브를 수동으로 삽입하는 것이 좋습니다. 수동 프로브 삽입은 초기 삽입 시 프로브가 구부러질 경우 프로브를 중지하고 후퇴시킬 수 있는 기능을 보장합니다. 프로브가 조직에 완전히 침투하면 일반적으로 자동 모드에서 프로브를 계속 하강하는 것이 안전합니다. - 마를 방지하기 위해 개두창 내의 뇌 표면에 미네랄 오일을 바르십시오.
- 삽입 후 녹음 프로브를 10분 동안 가라앉히십시오.
- Intan Recording Controller를 사용하여 30kHz에서 실리콘 프로브 및 ECoG의 데이터를 기록합니다.
- 녹음 후 1-2시간 후에 심경 관류 기술을 사용하여 뇌를 4% 파라포름알데히드22에 고정합니다.
참고: 시멘트 때문에 두개골의 부분을 제거하기 어려울 수 있습니다. 그렇기 때문에 두개골의 등쪽 부분을 제거하여 뇌를 절제하는 것이 바람직합니다. - 쥐의 목을 베고 목에서 아래턱까지 등 쪽의 정중선을 따라 피부를 자릅니다. 두개골에 붙어있는 근육과 조직을 제거하고, 뇌에 쉽게 접근할 수 있도록 아래턱을 잘라냅니다.
- 관류가 올바르게 이루어지면 뇌가 약간 수축되어 구멍의 등쪽 부분에 가는 가위를 삽입할 수 있는 충분한 공간이 남게 됩니다. 후두골에서 약 1mm 크기의 내측 절삭, 외측 절삭 1회, 반대측 절삭 1회를 합니다.
- 안과용 집게를 사용하여 두개골의 등쪽 부분을 조심스럽게 제거합니다. 후두골에서 시작하여 뇌의 등쪽 부분 전체가 노출될 때까지 모든 두개골 조각을 제거합니다.
- 마이크로 주걱을 뇌 아래로 밀어 넣고 후각구에서 시작하여 뇌를 퍼냅니다.
- 일단 관류되고 제거되면, 뇌는 4-48 시간 동안 4 ° C에서 4 % 파라 포름 알데히드에 저장 될 수 있습니다.
3. 프로브 궤적 재구성을 위한 조직학
- 진동체를 사용하여 뇌를 70μm 관상 절편으로 절단합니다.
- 세포 핵을 염색하는 DAPI 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 섹션을 장착합니다. 투명한 매니큐어로 슬라이드를 커버슬립하고 밀봉합니다.
- 형광 현미경으로 슬라이드를 이미지화합니다. 프로브 트랙이 명확하게 보이도록 대비/밝기를 조정합니다. MATLAB 코드가 원활하게 실행될 수 있도록 결과로 생성되는 tiff 이미지 파일 크기가 10MB 미만인지 확인합니다. MATLAB 코드23을 사용하여 프로브 트랙을 복원합니다.
4. 전기생리학적 데이터 분석
- 오프라인 감지 및 자동 분류 소프트웨어(Kilosort)24를 사용하여 실리콘 프로브에서 기록된 신경 신호를 분석합니다.
- Phy를 사용하여 감지된 클러스터를 다중 또는 단일 단위로 수동 분류25. 클러스터가 생리학적 스파이크 파형 형태를 가지고, 교차 correlogram에서 내화 기간을 표시하고, 진폭 보기의 정규 분포를 나타내는 경우 클러스터를 단일 단위로 분류합니다.
- 단일 단위 데이터를 MATLAB으로 가져와서23.
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결과
5명의 남성 C57BL/6J에게 ECoG 헤드셋과 헤드플레이트를 이식했습니다(그림 4A). 회복 후, 마우스는 서로 다른 날에 두 번의 1.5시간 세션 동안 머리 고정과 전기생리학 기록 장비에 습관화되었습니다(그림 4B). 다음으로, 2mm x 2mm 개두술 창을 만들고(그림 4C) 마우스를 깨우고 머리를 고정한 상태에서 실리콘 프로브를 삽입했습니다(그림 4D). 두 가지 유형의 실리콘 UCLA 프로브가 사용되었습니다 : (1) 64 M : 1 섕크, 64 전극 프로브; (2) 256 ANS: 4 섕크, 256 전극 프로브. 세보플루란(Sevoflurane)과 산소는 전기생리학 장비에 고정된 노즈콘(nose cone)을 사용하여 투여하였다. 산소 및 세보플루란 수치는 인라인 가스 분석기를 사용하여 5분마다 모니터링했습...
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토론
뇌간 핵은 호흡, 의식 및 수면과 같은 기본 기능을 매개합니다 26,27,28. 뇌간의 위치(심부 및 후방)는 표준 기술을 사용하여 생체 내에서 신경 활동을 연구하는 데 어려움을 줍니다. 여기에서는 머리가 고정된 마우스에서 재현 가능한 단일 단위 기록을 허용하기 위해 각진 전방 접근법이 제시됩니다.
다중 전극 실리콘 프로브를 조심스럽게 삽입하는 것은 REM 수면과 관련된 뇌간 구조를 일관되게 표적으로 삼으면서 주요 혈관의 손상을 방지하는 데 중요합니다. 진입13의 최상의 좌표와 궤적을 해결하기 위해서는 상당한 정도의 기교, 집중력 및 인내심이 요구된다.
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공개 사항
저자는 이 작업에 따른 경쟁 재정적 이익 또는 기타 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
그림 1, 그림 3, 그림 4, 그림 8 및 그림 9 는 BioRender.com 로 만들어졌습니다. MATLAB 코드에 대한 도움을 주고 스크립트를 공유해 준 Scott Kilianski에게 감사의 말을 전합니다. 탐사선 궤적 재구성에 도움을 준 Anna Grace Carns에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1024 채널 RHD 레코딩 컨트롤러 | Intan Technologies, Los Angeles, California, USA | C3008 | 실리콘 프로브 레코딩; 레코딩 하드웨어 및 소프트웨어 |
| 24 mm x 50 mm No. 1.5 VWR coverslip | VWR, Radnor, Pennsylvania, USA | 48393-081 | Histology |
| 4% PFA in PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | J61899. AK | 조직학; 관류 용액 |
| C& B 메타 본드 | Patterson Dental, 리치몬드, 버지니아, 미국 | 분말 : 5533559, 퀵베이스 : 5533492, 촉매 : 55335007 | 헤드 플레이트 & 헤드셋 이식 |
| C57/6J 마우스 4-6주, 수컷 | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA | 000664 | |
| Capnomac Ultima | Datex, Helsinki, Finland | ULT-SVi-27-07 | 가스 분석기; 단종; 대체 가스 분석기는 Bionet America에서 구매할 수 있습니다 |
| CM-DiI | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | V22888 | 실리콘 프로브 코팅용 적색 형광 염료 |
| 커넥터 헤더 | DigiKey, Thief River Falls, Minnesota, USA | 1212-1788-ND | ECoG 헤드셋 |
| DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, Alabama, USA | 0100-20 | Histology |
| iBOND Universal | Patterson Dental, Richmond, Virginia, 미국 | 044-1113 | 헤드플레이트 & 헤드셋 이식; 에 대한 두개골에 스테인리스 스틸 와이어 고정 |
| 저독성 실리콘 접착제 | World Precision Instruments, Sarasota, Florida, USA | KWIK-SIL | 헤드플레이트 |
| 마이크로 매니퓰레이터 시스템 | New Scale Technologies, Victor, New York, USA | 다중 프로브 매니퓰레이터: XYZ 스테이지 어셈블리: 06464-0000, MPM 시스템 키트: 06267-3-0001, MPM-Platform-360, MPM 수동 암용 MPM 링, MPM_Ring-72 DEG: 06262-3-0000 | 실리콘 프로브 녹음; 뇌에 프로브를 삽입하는 |
| Microprobe | UCLA, Los Angeles, California, USA | 256 ANS, 64M | 단종; 대체 실리콘 프로브는 Neuropixels |
| Mineral Oil | Sigma Aldrich, Saint Luis, Missouri, USA | M8410-100ML | 실리콘 프로브 기록; 기록 중 조직이 건조해지는 것을 방지합니다. |
| Normal Saline | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA에서 구입할 수 있습니다. | Z1376 | 헤드플레이트 & 헤드셋 이식; 수술 중 뇌가 건조해지는 것을 방지 |
| PFA 코팅 스테인리스 스틸 와이어-직경 0.008 in. 스트라이프 끝으로 코팅 | A-M 시스템, Sequim, Washington, USA | 791400 | ECoG 헤드셋 및 참조 전극 ECoG |
| 플래티넘 와이어 24AWG | World Precision Instruments, 미국 플로리다주 새러소타, 실리콘 | PTP201 | 기준 전극 |
| Shandon Colorfrost Plus 현미경 슬라이드 | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA | 99-910-01 | 조직학 |
| 스테인리스 스틸 헤드플레이트 | Star Rapid, 중국 | 맞춤형 부품 | 헤드플레이트 & 헤드셋 이식; 요청 시 디자인 가능 |
| 입체 장치 | KOPF, Tujunga, California, USA | 모델 940 디지털 디스플레이 콘솔 헤드플레이트가 있는 소형 동물 입체 기기 | 헤드플레이트 & 헤드셋 이식 |
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