본 연구는 미세조류에서 지용성 색소를 추출하고 정량화하기 위해 Jeffrey와 Humphrey가 개발한 방법을 사용하는 이점을 강조합니다. 이 방법은 이러한 유기체의 엽록소 생산 및 세포 함량에 대한 성장 인자의 영향을 평가하는 데 유용한 도구 역할을 합니다.
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이 논문에서
요약
초록
미세조류는 엽록소와 카로티노이드의 두 가지 주요 색소 그룹을 포함합니다. 엽록소는 빛 에너지를 흡수하여 화학 에너지로 변환하여 유기 화합물의 합성을 촉진하는 녹색 색소입니다. 이 안료는 높은 항산화 특성과 착색 능력으로 인해 식품, 제약 및 화장품 산업에서 생명 공학 투입 제품의 귀중한 주요 공급원 역할을 합니다. 본 연구의 목적은 TaguchiL4 실험설계를 통해 Chlorella sorokiniana에서 엽록소 a와 b의 세포 성장 및 세포 함량에 대한 성장 인자(CO2 농도, 광색, 광도)의 효과를 평가하고, 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 이용하여 방법을 검증하는 것이었다 추가 연구 모델로서의 미세조류. 세포 성장은 550nm의 파장에서 광학 밀도 분광 광도계 기술을 사용하여 정량화되었습니다. 엽록소의 정량화를 위해 90% 순수 아세톤 용액을 사용하여 세포 추출물을 수득한 후, Jeffrey와 Humphrey가 설명한 방법에 따라 647nm 및 664nm의 파장에서 분광광도계 기술을 사용하여 엽록소 a 및 b의 농도를 정량화했습니다. 실험 결과는 낮은 CO2 첨가, 보라색 빛 및 낮은 빛 강도의 조건을 제어하면 세포 성장과 세포 내 엽록소 a 및 b의 농도가 모두 증가한다는 것을 나타냈습니다. 이 엽록소 정량화 방법을 구현하면 사용되는 파장이 두 가지 유형의 엽록소의 흡광도 피크에 있기 때문에 엽록소 함량을 빠르고 간단하며 정확하게 측정할 수 있으므로 연구 중인 모든 미세조류에 대해 이 기술을 쉽게 재현할 수 있습니다.
서론
최근 몇 년 동안 인위적인 활동으로 인한 환경 문제의 증가와 생태계의 건강과 균형에 대한 악영향으로 인해 보다 효율적이고 환경 친화적인 생산 시스템에 대한 검색이 이루어졌습니다. 이로 인해 산업 분야의 프로세스가 가속화되고 이러한 유해한 영향을 완화하기 위한 생물 정화 치료의 구현과 바이오 화합물의 개발을 촉진했습니다1.
이러한 맥락은 현재의 환경 및 경제적 문제에 대한 혁신적인 솔루션을 찾아야 할 필요성에 의해 추진되는 미세조류 연구의 상당한 성장으로 이어졌습니다. 미세조류는 햇빛과 이산화탄소를 각각 에너지와 탄소의 원천으로 사용하여 수중 환경에서 번성합니다. 이러한 특성으로 인해 다양한 가치 있는 제품을 생산하기 위한 지속 가능하고 유망한 대안이 됩니다. 이 분야의 연구는 이러한 세포의 생리와 신진대사를 이해하고 세포의 배양 및 가공을 위한 효율적인 기술을 개발하는 데 중점을 두었습니다2.
연구 과정을 가속화하고 생리학, 대사 및 잠재적 응용 분야에 대한 이해를 심화하기 위해 미세조류를 연구하기 위한 접근 가능하고 신뢰할 수 있는 도구를 개발해야 할 필요성이 분명합니다. 이러한 도구를 사용하면 이러한 유기체의 건강과 발달에 대한 기본 지표인 엽록소 농도와 같은 주요 매개변수에 대한 환경 및 생산 요인의 영향을 신속하게 분석할 수 있습니다. 엽록소 함량의 감소는 환경 스트레스, 영양 결핍 또는 질병을 나타낼 수 있습니다.
이러한 녹색 색소는 광합성에 중요한 역할을 하며, 햇빛 에너지를 포착하여 이산화탄소와 물을 포도당과 산소로 전환하고 미세조류3의 바이오매스의 0.5%에서 5% 사이를 구성합니다. 엽록소는 생명 과정을 유지하는 데 필수적인 역할을 하는 것 외에도 다양한 산업 분야에서 응용되고 있습니다. 엽록소 추출물은 식품 및 음료 가공에 천연 착색제로 사용되어 제품에 생생한 녹색 색조를 부여하는 동시에 항산화 특성을 제공합니다. 또한, 엽록소 기반 보충제는 해독 및 항염증 효과로 인해 건강 및 웰빙 부문에서 인기를 얻고 있습니다. 엽록소의 다면적인 특성을 활용함으로써 산업계는 시각적 매력과 소비자 웰빙에 모두 기여하는 혁신적인 제품을 개발할 수 있습니다1.
이와 관련하여, 생명공학적 관련성이 큰 미세조류 중 하나는 C. sorokiniana이다. 이 미생물은 빠른 성장 속도가 두드러져 바이오매스 생산에 매우 효율적입니다. 또한 C. sookiniana 는 단백질, 지질 및 비타민을 포함한 고영양 화합물의 다양한 함량을 나타내므로 식품, 사료 및 바이오 연료 생산의 다양한 응용 분야에 유용합니다2. 또한, 이 미세조류 종은 다양한 기능을 가진 세포외 효소를 생성하는 것으로 밝혀져 폐수 처리, 생물 정화 및 제약과 같은 생명공학 응용 분야의 가능성을 열어줍니다4. C. sorokiniana는 급속한 성장과 다양한 응용 분야 외에도 엽록소 생산에 대한 상당한 잠재력을 보여줍니다. 광합성 미생물로서, C. sookiniana 는 엽록소의 합성에 필요한 기계를 가지고 있으며, 엽록소는 미세조류3의 바이오 매스의 0.5 %에서 5 % 사이를 구성합니다. 이러한 능력은 C. sorokiniana 를 상업적 규모의 엽록소 생산에 매력적인 후보로 만들고 긴급한 환경 및 영양 문제에 대한 지속 가능한 해결책이 될 것을 약속합니다5.
반면에, 중요한 관심을 끄는 또 다른 미세조류 종은 H. pluvialis입니다. 이 미세조류는 수많은 산업 응용 분야에서 강력한 항산화 색소인 아스타잔틴의 생산으로 유명합니다. 아스타잔틴은 H. pluvialis 광계를 보호하는 메커니즘으로 작용하여 환경적 요인에 의해 유도된 산화 스트레스로부터 광계를 보호합니다. 이 색소는 항산화 특성과 잠재적인 건강상의 이점으로 인해 화장품, 기능 식품 및 양식 산업에서 많이 찾고 있습니다. 아스타잔틴을 생산할 수 있는 풍부한 능력을 갖춘 H. pluvialis 는 다양한 산업 및 소비자의 요구에 부응하는 혁신적인 제품을 개발하기 위한 유망한 방법을 제시합니다6.
최근 연구에서는 엽록소 생산에 대한 H. pluvialis1 의 잠재력을 강조하여 산업적 중요성을 더욱 높였습니다. 예를 들어, 한 연구는 다양한 성장 조건에서 H. pluvialis 의 엽록소 함량을 조사한 결과, 최적의 재배 매개변수에서 H. pluvialis 가 다른 미세조류 종을 능가하는 놀라운 엽록소 생산 속도를 보였다는 것을 발견했습니다7. 이 발견은 엽록소의 지속 가능한 공급원으로서 H. pluvialis 의 잠재력을 강조하여 다양한 산업 분야에서 활용할 수 있는 새로운 기회를 제공합니다.
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프로토콜
1. 배양 배지 준비 및 접종 준비
- 3N-BBM + V (CCAP) 성장 배지 1L를 준비합니다 (다량 영양소 : NaNO3 [0.75 g L-1], CaCl2 [0.019 g L-1], MgSO4 [0.019 g L-1], K2HPO4 [0.057 g L-1], NaCl [0.025 g L-1], KH2PO4 [0.175 g L-1]; 미량 영양소 : Na2 EDTA [0.0186 g L-1], FeCl3 [0.0024 g L-1], MnCl2 [0.001 g L-1], ZnCl2 [1.25 x 10-4 g L-1], CoCl2 [5 x 10-5 g L-1], Na2MoO4 [9.98 x 10-5 g L-1])8 121 °C 및 1.5 psi에서 15 분 동안 살균한다.
- 미세조류 C. sorokiniana에 대해 대략 3 x 106 cells mL-1의 농도로 1L의 성장 배지를 플라스크에 접종합니다. 또는 성장 배지에 접종물의 5% 내지 10%(V/V)를 첨가하십시오.
알림: 멸균 상태를 유지하려면 층류 후드, 장갑, 실험실 가운 및 안면 마스크를 사용하는 것이 좋습니다. - 22-26 ° C 사이의 온도에서 대략 3,600-4,200 lux의 강도로 적색 광원 아래에서 C. sorokiniana의 경우 12 시간 빛과 12 시간 어둡게의 광주기, H. pluvialis의 경우 16 시간 빛과 8 시간 어둠의 광주기로 접종 된 플라스크를 배양하고 24 시간마다 수동으로 교반합니다. 두 균주 모두에 대해 약 7일 동안.
참고 : C. sorokiniana 의 경우 최소 7-10 일 (강렬한 녹색을 얻을 때까지), H. pluvialis의 경우 10-12 일 동안 성장 조건에서 유지하십시오. 동역학에서 접종물 역할을 할 미세조류 농축액을 얻으려면 생성된 조류에서 상층액 매체를 제거해야 합니다. - 멸균 환경에서 멸균 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 약 10mL의 접종된 배지를 채우고 3,000 x g 에서 25-30°C에서 20분 동안 원심분리합니다.
- 멸균 상태에서는 마이크로피펫을 사용하거나 멸균된 50mL 원추형 원심분리 튜브에 바이오매스를 붓고 농축하여 상층액을 제거합니다.
- 동역학에 필요한 접종물의 양이 얻어질 때까지 필요에 따라 이 과정을 반복합니다.
- 접종물의 광학 밀도(OD550 nm)를 측정하여 미세조류의 세포 농도를 측정하고 사용할 준비가 될 때까지 3-4 °C의 온도에서 보관합니다.
참고: 직접 세포 계수는 처음에 세포 농도와 흡광도의 상관 관계를 파악하기 위해 수행되었습니다. 일단 계산되면 접종물은 4일 이상 냉장 보관할 수 없습니다.
2. 성장동역학 연구
- 표준 실험실 절차에 따라 각 실험에 적합한 필요한 부피의 3N-BBM+ V(CCAP)를 준비합니다 (C. sorokiniana 에 대한 광생물반응기 수준 테스트의 경우 8L, H. pluvialis의 플라스크 수준 테스트의 경우 0.5L).
- 광생물 반응기와 플라스크 모두에 대해 광원을 원하는 색상 스펙트럼으로 구성합니다(460nm에서 파란색, C. sookiniana 의 경우 460nm와 630nm의 혼합, H. pluvialis의 경우 630nm에서 빨간색). 외부 조명 간섭을 피하기 위해 두 시스템을 모두 커버하십시오.
참고: 각 발광 다이오드에서 방출되는 파장의 변화로 인해 각 다이오드9의 파장과 방출 전력을 결정하기 위해 광원에서 분광 방 사계를 사용하여 분광 방 사법을 수행했습니다. 적색 LED와 청색 LED를 결합하여 보라색 빛을 얻은 결과, 청색 LED의 경우 1.65W nm-1의 방출 전력으로 460nm의 파장을, 적색 LED의 경우 0.6W nm-1의 방출 전력으로 630nm의 파장을 얻었습니다. 이 측정은 청색광 및 적색광 하에서만 수행된 테스트에 사용되었습니다. - C. sorobiniana의 경우 12시간 밝기와 12시간 어두운 주기, H. pluvialis의 경우 16시간 빛과 8시간 어두운 주기 사이를 번갈아 가며 타이머를 프로그래밍합니다.
- CO2 폭기 시스템을 광생물 반응기 배양 용기에 연결하여 C. sorokiniana에 대해 12시간 간격으로 이산화탄소를 공급합니다.
- 3 x 105 cells mL-1 또는 이와 동등한 광학 밀도(OD550 nm) = 0.180의 시작 세포 밀도를 달성하기 위해 충분한 양의 사전 접종물을 배양 용기에 접종합니다.
알림: 오염을 방지하기 위해 접종 중 무균 기술을 확인하십시오. - 세포 성장 및 생리학적 매개변수를 모니터링하기 위해 C. sookiniana 의 경우 12시간, H. pluvialis 의 경우 8시간의 일정한 간격으로 배양액을 샘플링합니다. 배양물의 무결성을 유지하기 위해 멸균 기술을 사용하여 샘플을 수집합니다.
3. 엽록소의 정량화
참고: 세포 정량을 위한 데이터는 보충 파일 1에 제공됩니다.
- 40mL의 시료를 플라스틱 원뿔형 원심분리 튜브에 넣습니다.
- 3,000 x g 에서 15 °C에서 20 분 동안 원심 분리하고 디캔테이션 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 폐기합니다.
- 산화를 방지하기 위해 알루미늄 호일로 덮인 유리관과 나사 캡에 세포 펠릿을 옮깁니다.
- 소용돌이를 사용하여 3mL의 90% 순수 아세톤 용액으로 셀 펠릿을 재현탁시킵니다.
- 현탁액 샘플을 얼음 수조에서 각각 5분씩 2회 주기 동안 초음파 처리하고 4°C에서 16시간10분 동안 휴지시킵니다.
- 16 시간 후, 이전 단계 (3.5 단계)에서 언급 한 것과 동일한 조건에서 다시 초음파 처리하고 이전에 설명 한 조건 (3.2 단계)에서 다시 원심 분리합니다.
- 파스퇴르 피펫을 사용하여 색소 추출물을 분리하고 빛으로부터 보호되는 다른 깨끗한 튜브로 옮깁니다.
- 색소 추출물을 석영 셀에 넣어 630nm, 647nm 및 664nm 파장의 분광 광도계에서 판독합니다.
알림: 90% 아세톤으로 미리 분광 광도계를 보정하십시오. - 엽록소 농도를 계산하려면 다음 방정식11을 사용하십시오.
엽록소 A = 11.93 A664 - 1.93 A647
엽록소 b = 20.36 A647 - 5.50 A664
참고: 결과는 추출물의 μg mL-1 로 표시되며, 여기에 추출물 부피를 곱하고 샘플의 mL 수로 나누어 배양액의 μg mL-1 엽록소 농도를 얻습니다. - μg chl cell-1의 값을 얻으려면 다음 공식을 사용하십시오.
μg chl cell-1 = 배양 1mL의 μg chl / [cells mL-1] 배양 세포 농도.
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결과
엽록소 세포 농도의 변화를 감지하는 기술의 효율성을 관찰하고 C. sorokiniana에서 성장 인자의 효과를 평가하기 위해CO2 부피 추가, 광 색상 및 광 강도를 평가하는 Taguchi L4 실험 설계를 수립했습니다. 각 요인은 표 1과 같이 표 2의 실험 설계에 의해 정의된 조건 하에서 낮고 높은 수준으로 평가되었습니다.
실험 과정이 종료된 후, 결과는 처리 2에 해당하는CO2의 낮은 첨가, 보라색 광 및 높은 광 강도(C1, P,I2)의 조합이 미생물 성장을 7.83 x 105 cells mL-1로 증가시키는 것을 보여주었습니다. 반면에, 엽록소 함량은 조건 C2, P, I2 하에서 처리 4에서 더 높았으며, 132 h에서...
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토론
H. pluvialis와 C. sorokiniana 사이의 비교 연구는 엽록소 생산 역학에서 상당한 차이를 보여주었습니다. H. pluvialis는 실험 전반에 걸쳐 엽록소 농도의 감소를 보인 반면, C. sookiniana는 꾸준한 증가를 보였습니다. 또한, 초기에는 두 종 모두에서 엽록소 a의 비율이 더 낮았지만, 이 비율은 특정 성장 조건에서 역전되었으며, 이는 특정 파장의 선택성 또는 노출을 통해 상기 엽록소의 생성이 유도되는 징후를 제공할 수 있습니다. 이러한 발견은 실험 조건에 대한 각 종의 고유한 반응을 시사하며, 생물학적 모델 내부 및 모델 간의 변화를 감지하는 데 사용되는 분석 기술의 민감성을 강조합니다. 엽록소 a와 b의 비율에서 미묘한 변화를 식별할 수 있는 능력은 미세조류의 색소 합성 조절에 대한 새로운 통찰력을 제공하며, 이는 생명 공...
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공개 사항
저자는 밝힐 것이 없습니다.
감사의 글
저자들은 Institutos Tecnologicos Federales를 위한 과학 연구, 기술 개발 및 혁신 요청(Call for Scientific Research, Technological Development, and Innovation, 16898.23-P)에 따라 TecNM으로부터 부분적으로 자금을 지원받은 것에 대해 감사의 뜻을 표합니다. 또한 Instituto de Ciencia, Tecnología e Innovación del Estado de Michoacán de Ocampo(FCCHTI23_ME-4.1.-0001)의 지원에도 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| C3H6O | Meyer | 67-64-1 | 아세톤 90% |
| 15 mL 튜브 | Biologix | 10-9502 | 시험관 |
| 2510-DTH | Branson | D-73595 | Sonicator |
| 5 mL 나사 캡 시험관 | Kimax | 45066-13100 | 시험관 |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | Biologix | 10-9151 | 시험관 |
| 알루미늄 호일 | Reynolds | 611 표준, 12" x 1000 피트 | 시험관 커버 |
| CaCl2 | Meyer | 0925-250 | 칼슘 클로라이드 |
| 원심분리기 | Dynamica | 14 R | 원심분리기 냉장 |
| CoCl2 | Merck | 1057-100 | 이발트 염화 CoCl |
| 3 | Merck | 157740 | 철(III) 염화물 |
| K2HPO4 | Meyer | 2051-250 | 인산이칼륨 |
| KH2PO4 | Meyer | 2055-250 | 인산 모노칼륨 |
| MgSO4 | Meyer | 1605-250 | 황산 마그네슘 |
| 마이크로피펫 | LabNet | 모델 베타-페트 | 마이크로피펫 |
| MnCl2 | Merck | 429449 | 망간(II) 염화물 |
| Na2 EDTA | Merck | 200-449-4 | Edatamil, Edetato Disodium Salt Dihydrate |
| Na2MoO4 | Merck | 243655 | 몰리브덴산나트륨 |
| NaCl | Meyer | 2365-500 | 염화나트륨 |
| NaNO3 | Meyer | 2465-250 | 질산나트륨 |
| RGB LED 스트라이프 | Steren | GAD-LED2 | Light 출처 |
| 분광 광도계 | PerkinElmer | 모델 Lambda35 | 분광 광도계 |
| 분광 방 사계 | Gigahertz-Optik | 모델 BTS256 | |
| Vortex | Scientific | Industries Vortex-Genie® 2 | Vortex |
| ZnCl2 | Merck | 208086 | 염화 아연 |
참고문헌
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재인쇄 및 허가
