극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

Summary

이 프로토콜은 시료 전처리 최적화를 통해 불균일한 입자 분포를 해결하기 위한 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)를 예로 사용하는 실용적인 방법을 제시하며, 연구자가 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하여 고분자 구조를 효율적으로 규명할 수 있는 참고 자료를 제공합니다.

Abstract

극저온 전자 현미경(Cryo-EM)은 유리체 얼음에 부유하는 거의 네이티브 조건에서 고분자 구조를 연구할 수 있게 함으로써 구조 생물학에 혁명을 일으켰습니다. 이 기술은 결정화(crystallization)를 필요로 하지 않고 단백질 및 기타 생체 분자의 고해상도 시각화를 가능하게 하여 그 기능과 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 최근 단일 입자 분석의 발전과 향상된 컴퓨터 데이터 처리로 인해 Cryo-EM은 현대 구조 생물학에서 없어서는 안 될 도구가 되었습니다. 채택이 증가하고 있음에도 불구하고 Cryo-EM은 특히 불균일한 입자 분포와 같은 효과를 제한할 수 있는 지속적인 문제에 직면해 있습니다. 이 문제는 종종 재구성된 단백질 구조의 분리능 저하와 정확도 감소로 이어집니다. 이 기사에서는 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)의 작은 열 충격 단백질을 예로 들어 이 문제를 해결하기 위한 간단하고 실용적인 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 방법은 시료 전처리를 최적화하여 우선 흡착을 최소화함으로써 보다 균일한 입자 분포와 고품질 단백질 Cryo-EM 구조를 보장합니다. 이 기술은 구조 연구에서 유사한 문제를 극복하고자 하는 연구자에게 귀중한 지침을 제공합니다.

Introduction

최근 기기 하드웨어 ^1,2와 이미지 처리 소프트웨어 ^3,4,5의 발전으로 극저온 전자 현미경(Cryo-EM)은 현대 구조 생물학에서 인기 있고 강력한 도구로 부상했습니다. 이러한 획기적인 발전에도 불구하고 Cryo-EM을 사용하여 고분해능 고분자 구조를 달성하는 데 병목 현상이 지속되고 있습니다. 이러한 중요한 과제 중 하나는 공기-물 계면 ^6,7,8,9에서 주로 관찰되는 배향 선호 현상을 포함한 불균일한 입자 분포입니다.

시료 유리화(vitrification) 과정에서 일부 분자는 그리드의 특정 축을 따라 정렬되는 경향을 보입니다. 이로 인해 최종 데이터 세트에서 입자 보기가 고르지 ....

Protocol

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 단백질 정화

1. E. coli BL21(DE3)에서 재조합 MjsHSP16.5의 발현을 유도하고 앞서 설명한 바와 같이 니켈 킬레이트 크로마토그래피 컬럼을 사용하여 단백질을 정제합니다²⁶. 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 컬럼²⁶에서 정제한 후 12.5% SDS-PAGE 겔에 5μL의 피크 분획을 로드하고 표준 Coomassie blue staining²⁸로 시각화하여 단백질 순도를 검사합니다(그림 2).
2. 제조업체의 지침에 따라 50kDa 분자량 컷오프가 있는 원심 필터를 사용하여 MjsHSP16.5를 포함하는 풀 분획을 4°C에서 약 65mg/mL로 농축합니다( 재료 표 참조).
   참고: 단백질 응집을 방지하기 위해 원심분리 중 5분마다 단백질 용액을 부드럽게 피펫으로 분사합....

Results

MjsHSP16.5에 대한 최적의 그리드 조건을 식별하기 위해 주로 다양한 단백질 완충액 조건을 검사하는 데 중점을 둔 초기 Cryo-EM 스크리닝을 수행했습니다. (1) MjsHSP16.5의 안정성과 균질성을 보장하고 결정화에 중요한 최종 정제 완충액³⁰; (2) 고회절 품질 MjsHSP16.5 결정의 성장에 필요한 조건으로부터 적응된 완충액³⁰; 및 (3) MjsHSP16.5의 전자 현미경(EM) 연구에 이전에 사용된 완충액,^31,32.

버퍼 최적화(3단계에서 설명한 바와 같이 미세 투석 버튼을 사용한 버퍼 교환)와 병행하여 4단계에서 설명한 대로 그리드의 표면 전하를 수정하기 위해 다양한 글로우 방전 매개변수를 검사했습니다. 그리드는 방전되지 않은 상태로 유지되거나(소수성) 음전하 또는.......

Discussion

모든 단백질 구조 연구는 단백질 정제로 시작되며, 이는 고유 기능을 보존하면서 순도가 높고 균질한 단백질 표적을 분리하는 것 사이의 균형을 이루기 위한 반복적인 프로세스입니다. 단백질 시료를 정제하고 보존하기 위한 완충액 조성은 정제 과정에서 신중하게 선택되지만, 이러한 완충액은 후속 Cryo-EM 시료 전처리^{및 이미징 6}에서 종종 문제를 제기합니다. 이 문제는 최적의 Cryo-EM 분석을 위한 완충액 성분과 전제 조건 간의 불일치로 인해 발생하며, 따라서 효과적인 Cryo-EM 분석과 호환되는 단백질 저장 완충액을 최적화하는 중요한 단계가 필요합니다. 그러나 각 단백질은 고유한 구조적 및 기능적 특징을 가지고 있기 때문에 만능 접근법은 없습니다²⁴. 결과적으로, 최적의 시료 준비는 조사 중인 특정 단백질에 따라 달라질 수 있습니다.

.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
14-mL 원형 바닥 튜브	SPL Life Sciences	40114
250 &마이크로; L 가스타이트 주사기 모델 1725 LTN	Hamilton	81100	시멘트 바늘, 22s 게이지, 2 인치, 포인트 스타일 2
50 &마이크로; L 투석 버튼	Hampton Research	HR3-326
50-mL 유리 비커	DIAMOND	HA.1010D.50
Ä KTA 순수 25 L	Cytiva	29018224	FPLC
Amicon Ultra-15 원심 필터 유닛	Millipore	UFC905024	50-KDa NMWL
Bradford 시약	Supelco	B6916
Dumoxel 스타일 N5	Dumont	0103-N5-PO
Glacios 2 Cryo-TEM	ThermoFisher Scientific	GLACIOSTEM
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg	Cytiva	28989335
마이크로 원심분리기 튜브 1.5mL	HD Micro	H23015
PCR 튜브 0.2mL, 플랫 캡	Axygen	PCR-02-C
PELCO easiGlow Glow Discharge unit	Ted Pella	91000
PELCO TEM 그리드 홀더 블록	Ted Pella	16820-25
Quantifoil R 1.2/1.3 200 Mesh, Cu	전자 현미경 사이언스	Q2100CR1.3
Spectra/Por 3 RC 투석 멤브레인 튜브	Fisher Scientific	086705B	3500 Dalton MWCO
Superose 6 Increase 10/300 GL	Cytiva	29091596
우라닐 아세테이트	Merck	8473
Vitrobot Mark IV	ThermoFisher Scientific	VITROBOT
VitroEase 완충액 스크리닝 키트 및 세제	ThermoFisher Scientific	A49856