방법 논문

Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic

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DOI:

10.3791/67244

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2024년 10월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, NC State University

이 논문에서

요약

장내 신경교세포는 장 항상성 및 수술 후 합병증을 포함한 질병 진행에 대한 역할로 점점 더 인식되고 있습니다. 응급 탐색적 개복술에서 회복 중인 말 환자는 수술 후 염증성 질환의 위험이 높기 때문에 연구를 위해 반복 가능한 말 장 신경교세포 배양을 확립하는 것이 중요합니다.

초록

수술 후 염증성 질환인 말 산통(급성 복부)은 고객 비용, 환자의 불편함 및 입원 시간을 증가시킬 뿐만 아니라 많은 경우 생명을 위협하는 것으로 입증되었습니다. 장 세포의 독특한 집단인 장아교세포(enteric glia)는 위장 환경을 감지하고 주변 세포 유형과 소통하는 역할로 점점 더 인정받고 있습니다. 장아교세포와 장 상피 사이의 상호작용은 말 장아교세포가 어떻게 점막 장벽을 변화시켜 건강과 배앓이의 염증을 조절할 수 있는지를 규명하는 데 중요한 역할을 할 수 있습니다.

이 상호작용을 연구하기 위해, 우리는 말 jejunum에서 일차 말 장 신경교세포(primary equine enteric glial cultures)를 확립하고 배양균을 배앓이에 존재하는 것으로 알려진 염증성 상태에 노출시키는 방법을 제시합니다. 1차 장 신경교세포(Primary enteric glial cultures)는 배앓이와 관련이 없는 이유로 안락사된 성체 말에서 얻었다. 장 융모와 lamina propria를 미세 절개하여 점막하를 노출시켰습니다. 분리된 점막하층은 콜라겐분해효소, 프로테아제, 소 혈청 알부민으로 2-3시간 동안 효소 소화를 거쳤다. 다음으로, 원심분리, 피펫팅 및 세포 여과기(40-100 μm)를 포함한 기계적 분해를 통해 ~400,000 cells/300 μL의 배지 농도로 0.05 mg/mL 폴리-L-라이신 코팅 웰에 도금하는 데 사용되는 펠릿을 수득했습니다.

합류 및 첫 번째 통과 후, 장 신경교세포는 그런 다음 말 재조합 IL-1β(0, 10, 25ng)에 24시간 동안 노출되었습니다. 배앓이 시 상피-신경교세포 상호작용을 모델링하기 위해, 대조군 또는 처리된 장내 신경교세포에 의해 조절된 배지를 이중 전극 EndOhm 챔버를 사용하여 경상피 전기 저항(TEER)을 측정하면서 합류 말 jejunal 단층에 직접 추가되었습니다. 이러한 데이터는 말 장신경교세포(equine enteric glial culture)의 많은 잠재적 영향력 있는 응용 분야 중 하나일 뿐입니다.

서론

말 배앓이는 응급 상담을 위한 가장 흔한 의학적 증상입니다1. 말의 최대 17%가 외과적 교정이 필요하기 때문에 수술 후 결과를 높이기 위한 노력이 말 의학 연구의 최전선에 있어야 합니다2. 현재 수술 후 산통 환자는 패혈증/내독소혈증 쇼크(환자의 12.3%)와 수술 후 장폐색증(환자의 13.7%)을 포함하여 생명을 위협하는 여러 질환의 위험이 높습니다3. 수술 후 합병증에 대한 치료의 진전에도 불구하고 이러한 상태를 예방하거나 치료하기 위한 고급 치료법의 필요성은 계속되고 있습니다.

최근 연구에서는 배앓이 환자의 국소 및 전신 염증 상태를 강조하고 있다4. 예를 들어, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF) 알파, 인터루킨 1β(IL-1β), 인터루킨 6(interleukin 6, IL-6), 단핵구 화학유인 단백질(monocyte chemoattractant protein-1)과 같은 전염증성 단백질은 모두 정상 장 조직에 비해 배앓이 장 점막에서 발현이 유의하게 증가하는 것으로 나타났습니다4. 전신적 관점에서, 장 조직의 TNF 알파 증가는 수술 후 비위 역류의 위험 증가와 2 L 이상의 상관관계가 있음이 입증되었으며, 이는 수술 후 운동성 장애의 일반적인 측정치이다4. 또한 인터루킨 IL-1β 및 TNF 알파를 투여하면 패혈성 쇼크의 임상 징후를 유발할 수 있는 것으로 알려져 있다5.

배앓이 장 조직의 염증 상태와 수술 후 합병증과의 연관성에 대한 잠재적인 설명은 장 상피 장벽입니다. 건강에서, 장관을 둘러싸고 있는 원주형 상피의 단일 층을 연결하는 단단한 접합 복합체는 내강 함량과 박테리아 성분이 점막하 공간과 혈류에 도달하는 것을 제한하는 기능적 장벽을 제공합니다. 그러나 수술 중 배앓이와 관련된 장 폐색과 장 조작으로 인한 팽창과 손상은 이 장 장벽 기능을 방해할 수 있습니다.

장 벽의 기능적 구성 요소 전체와 관련하여, 장 신경계 내의 점막하 장내 신경교세포망은 염증 경로와 관련된 수술 후 합병증의 병태생리학적 발달에 중요한 것으로 나타났으며, 특정 치료 표적을 제공할 수 있다 6,7,8,9 . 장신경교세포는 위장관 전체에 존재할 뿐만 아니라 장 환경의 센서 역할을 하고, 장벽의 수많은 세포 유형을 통해 신호 전달에 영향을 미치며, 장 장벽을 직접 조절한다6. 그러므로, 장의 이러한 강력한 센서들이 부상과 염증에 의해 활성화될 것이고, 장벽 투과성의 변화와 같은 급성 반응을 일으킬 수 있을 것이라고 가정하는 것이 타당하다.

이 연구는 말 장아교세포의 배양, 보다 구체적으로는 염증성 말 장아교세포가 장 장벽 기능에 미치는 역할을 설명한 최초의 연구입니다. 여기에서는 말 점막하 장내 신경교세포의 1차 배양 방법과 염증성 IL-1β 노출에 대한 반응, IL-1β 노출 후 장내 신경교세포가 말 장세포 단층의 투과성에 미치는 영향 평가, 말 혈청 적용을 통한 봉쇄 가능성을 제시합니다.

프로토콜

말 장내 신경교세포(Equine enteric glial) 1차 배양균은 이 연구와 관련이 없는 이유로 바르비투르산염을 과다 투여하여 인도적으로 안락사시킨 세 마리의 말에서 얻었다. 배양 연구를 위해 선택된 말은 현재 위장 질환의 병력이 없는 성체 말이었다.

1. 점막하 말 장내 신경교세포 1차 배양

  1. 3 개의 별도 성인 말 말에서 얻은 jejunal crypts에서 말 상피 단층을 성장시킵니다.
    1. 24웰 플레이트에 코팅 용액을 37°C에서 2시간 또는 실온에서 하룻밤 동안 코팅하고 멸균수로 2배 세척한 다음 셀이 도금할 준비가 될 때까지 실온에서 보관합니다.
    2. 인도적 안락사 후 60분 이내에 제주눔의 일부를 제거하고 얼음 위의 차가운 링거 용액에 넣으십시오.
    3. 제주눔에서 10cm 부분을 제거하고 항상간장 경계에서 열어 비림프성 영역이 조직 중앙에 오도록 합니다. 해당 부분을 약 7cm x 7cm 부분으로 자릅니다. 해부하기 전에 신선한 Ringer's solution으로 조직을 잘 헹굽니다.
    4. 실리콘 엘라스토머로 코팅된 페트리 접시에 조직을 차가운 링거 용액 또는 PBS 점막 면이 위로 향하게 하여 조직을 최대한 늘립니다(그림 1A).
    5. 구부러진 겸자로 장 융모를 제거한 다음 약 5cm x 5cm의 비림프 부위(그림 1C)에서 라미나 프로프리아층을 제거합니다.
      참고: 이 층은 점막하층에서 쉽게 분리됩니다(그림 1B).
    6. 한쪽 모서리를 미세해부 가위로 풀어 한 장의 점막하층을 제거하고 점막하층을 제주눔의 내원근층에서 벗겨내면서 자연스러운 분리를 관찰한다(그림 1D).
    7. 수집된 점막하층을 2-5mm 조각으로 다지고 5mL의 "Organo-FBS"(표 1), 0.825mg의 콜라겐분해효소, 5mg의 프로테아제 및 20mg의 소 혈청 알부민이 포함된 50mL 원뿔형 튜브에 넣습니다. 효소 분해를 위해 37°C에서 2-3시간 동안 조직을 배양합니다.
    8. 배양 후 실온 "Organo + FBS" 10mL를 첨가하여 효소 작용을 중지합니다. 10mL 혈청학적 피펫으로 조직 혼합물을 약 15배 위아래로 피펫팅하여 조직에서 세포를 분리한 다음 실온에서 3분 동안 3,000× g 으로 원심분리합니다.
    9. 상층액을 버리고 10mL 혈청학적 피펫으로 약 15배 다시 위아래로 피펫팅하여 조직에서 세포를 분리하여 10mL 실온 PBS로 펠릿을 재현탁시킵니다.
    10. 원뿔형 튜브를 3,000× g 에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 10mL 혈청학적 피펫으로 약 15배 위아래로 피펫팅하여 조직에서 세포를 분리하여 10mL의 실온 "Organo + FBS"로 펠릿을 재현탁시킵니다.
    11. 100μm, 70μm, 40μm 공극 크기의 세포 여과기를 통해 세포를 순차적으로 여과합니다.
    12. 여과된 세포와 배지를 3,000× g 에서 실온에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 펠릿을 "Organo + FBS" 1mL에 재현탁시킵니다.
    13. 트리판 블루로 염색하여 살아있는 세포를 식별하고 혈구계로 계산합니다.
    14. 24웰 플레이트의 각 웰에서 300μL의 "Organo + FBS"에 약 400,000개의 세포를 파종하고 각 웰에 성장 인자를 추가합니다: N2 5 μL/웰, G5 5 μL/웰 및 B27 10 μL/웰. 24웰 플레이트를 37% CO2 가 있는 2°C 인큐베이터에 넣어 세포가 부착될 수 있도록 합니다. 24시간 후, 위의 성장 인자를 사용하여 배지를 "glia media"(표 1)로 변경하고 48시간마다 교체합니다(그림 2).

2. 면역형광 세포학

  1. 1차 배양(P0)(단계 2.1.14)에서 장 신경교세포를 70-80% 합류점으로 성장시키고 한 번(P1) 통과시킵니다.
  2. 0.1% PBS 아지드화물을 적용하기 전에 5분 동안 4% 파라포름알데히드를 사용하여 웰의 1차 배양(P0) 세포를 고정합니다.
  3. PBS 아지드화물, 4% 당나귀 혈청 및 0.5% Triton-X로 구성된 포화 용액을 준비합니다. 300μL의 포화 용액을 웰에 추가하여 실온에서 2시간 동안 세포를 투과시킵니다.
  4. 신경교세포 마커에 대한 1차 항체인 신경교세포산성단백질(GFAP)과 섬유아세포 마커인 알파 평활근 액틴에 대한 1차 항체를 포화 용액에 1:1,000으로 희석하여 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  5. 당나귀 항 토끼 IgG Alexa Fluor 594 및 염소 항 마우스 IgG Alexa Flour 488에 대한 2 차 항체를 추가하기 전에 PBS로 3 회 세척하십시오. 포화 용액에 2-3 시간 동안 1:500 희석.
  6. PBS에서 5분 동안 1:1,000 희석하여 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 핵을 염색합니다.
  7. PBS로 3회 세척한 후 세포를 0.1% PBS 아지드화물에 보관합니다.

3. 점막하 말 장내 신경교세포 1차 배양 IL-1β 노출

  1. 첫 번째 통로(P1)의 세포가 70-80% 합류점에 도달하면 IL-1β 노출 실험을 수행합니다. 웰을 0 ng, 10 ng 및 25 ng의 IL-1β에 24 시간 동안 노출시킵니다. 24시간 후 각 웰의 매체를 -80°C에서 보관하고 보관합니다.

4. 장세포 단층 생산을 위한 말 오가노이드 배양

참고: 2018년에 발표된 Stewart et al. 프로토콜에 따라, 냉동 은행된 은행 말 장 크립트 및 새싹이 2D 장내 검사를 위해 확장되었습니다10.

  1. 트랜스웰 인서트당 약 700-1,000개의 새싹/크립트 조각(단일 세포로 해리될 경우 40,000-50,000개의 세포)을 사용합니다. 장세포를 추가하기 전에 트랜스웰 인서트에 42μL의 0.05% Matrigel을 코팅합니다. 37 °C에서 1시간 동안 배양하여 Matrigel을 인서트에 고정하고 추가 배지를 흡인하고 트랜스웰을 덮지 않은 상태로 30분 동안 건조시킵니다. 각 트랜스웰 인서트에 200μL의 DMEM-F12 배지를 추가하고 플레이트를 사용할 때까지 37°C에서 보관합니다.
  2. 오가노이드가 들어있는 Matrigel 패티를 PBS로 세척한 다음 얼음 위에서 500μL의 세포 회수에 노출시킵니다. 세포가 15mL 튜브에 완전히 모일 수 있도록 반복적으로 피펫팅합니다.
  3. 300× g 에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 장 상피 줄기 세포(IESC) 배지의 목표 부피에 세포 펠릿을 현탁시킵니다. 원하는 수의 단층에 200μL의 매체를 곱하여 목표 부피를 계산합니다. (표 1).
  4. 1mL 주사기를 IESC 배지에 사전 코팅하고 16G 바늘을 통해 세포 현탁액을 흡입합니다. 16G 바늘을 28G 바늘로 교체하고 이를 통해 세포 현탁액을 배출하여 오가노이드의 분리를 촉진합니다.
  5. 생성된 세포 현탁액 200μL를 코팅된 트랜스웰의 정점 측에 배치하고, 500μL의 IESC와 이전에 설명한 성장 인자를 트랜스웰 인서트(10)의 기저 측에 배치합니다. 합류점에 도달할 때까지 24-48시간마다 매체와 성장 인자를 교체하십시오. 합류점을 1,000 ohmsxcm 2,11의 TEER에 해당하는 세포 밀도로 정의합니다. 측정은 5.1단계를 참조하십시오.

5. 염증성 사이토카인(inflammatory cytokine) 및 말 장내 신경교세포(equine enteric glial products)에 노출된 후 말 장세포 단층 투과성

  1. 이중 전극 TEER 측정 챔버를 사용하여 단층에서 TEER를 정량화하고 각 트랜스웰 투과성 멤브레인에 대한 기본 판독값을 설정합니다. 측정하기 전에 IESC 매체와 트랜스웰이 실온에 도달하는 데 15분이 걸리는지 확인하십시오. 배양 컵에 1.5mL의 IESC 배지를 채우고 측정 시 유체 라인이 일치하도록 트랜스웰 인서트 내에 정확히 200μL의 배지가 있는지 확인합니다.
  2. 트랜스웰 삽입체의 기저측면(basolateral aspect)을 웰당 25 ng IL-1β, 10 ng 및 25 ng 인터루킨 6(IL-6)의 염증성 사이토카인 또는 10 ng 또는 25 ng IL-1β에 노출된 배양액의 신경교세포(glial) 산물에 노출시킵니다. 대조군 트랜스웰 삽입물의 기저측면(basolateral aspect)을 신경교세포(glia media)에 노출시키고, IL-1β에 노출되지 않은 배양액의 신경교세포(glia media)에 노출시킵니다.
  3. 각 트랜스웰을 문화 컵에 넣어 45-10분 간격으로 15분 동안 TEER를 측정합니다.

6. 통계

  1. 시점(0, 10, 20, 30 및 45분)에 대해 각 트랜스웰의 TEER의 폴드 변화를 계산합니다.
  2. 선택한 소프트웨어( 재료 표 참조)를 활용하여 IL-1β(25ng), IL-6(10ng, 25ng 및 100ng) 및 신경교세포(0ng IL-1β, 10ng IL-1β 및 25ng IL-1β에 노출됨)에 대한 TEER 감소와 기저측 노출 간의 상관관계를 비교하여 쌍을 이루지 않은 단측 t-검정을 사용하여 매체를 대조군에 제공합니다.

결과

효소 및 기계적 소화를 추가로 진행하여 점막하층(그림 1)에 말 jejunum을 미세해부하면 말 장아교세포의 생존 가능한 세포 배양을 생성할 수 있습니다. 세포는 다른 종의 장내 신경교세포(enteric glia)와 일치하는 방추형 세포의 우세를 가진 다형성(pleomorphism)을 보여주었습니다(그림 2A). 배양 결과, 선택적 신경교세포 마커인 신경교세포(glial fibrillary acidic protein, GFAP)에 대해 양성이었으며, 섬유아세포 오염이 적었습니다(alpha SMA, 그림 2B). 일부 경우에는 점막하층의 미세해부가 충분히 제어되지 않았으며, 섬유아세포 마커 평활근 액틴의 면역형광을 통해 관찰된 높은 비율의 섬유아세포로 배양물이 오염되었습니다(그림 3).

다음으로, 말 장내 신경교세포의 유용성에 대한 예로, IL-1β에 노출된 장내 신경교세포가 장 상피장벽 기능에 미치는 영향을 평가하였다. 24시간 동안 10 ng 및 25 ng IL-1β에 노출된 말 점막하 장내 신경교세포의 배지에 대한 기저측 노출은 투과성을 유의하게 증가시켰다(p=0.05 및 0.04, 대조 배지의 평균 = 0.9, 신경교세포의 평균 10 ng IL-1β 그룹 = 0.8, 95% 신뢰 구간 = -0.2 - 0.02, 신경교의 평균 25 ng IL-1β 그룹 = 0.8, 95% 신뢰 구간 = -0.1995 - 0.01060, n = 3-4) (그림 4A). 그러나 IL-1β에 노출된 장내 신경교세포에 의해 생성되고 설치류 모델12에서 장세포 투과성 증가를 유도하는 것으로 입증된 염증성 사이토카인인 기저외측 10-25 ng 말 IL-6에 말 상피 단층이 노출된 경우, 말 장세포 단층 투과성은 유의하게 증가하지 않았습니다(그림 4B)

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그림 1: 미세해부와 효소 및 기계적 소화에 의한 말 jejunum에서 장내 신경교세포의 분리. (A) 제주눔은 항간막 경계를 따라 절단하고 점막 쪽을 위로 핀으로 고정하였다. (B) 장 융모를 현미경으로 시각화하고 희미한 lamina propria가 시각화될 때까지 부드럽게 긁어내어 제거했습니다. (C) 그런 다음 평활근 섬유가 반투명 점막하를 통해 보일 때까지 라미나 프로프리아층을 제거했습니다. (D) 점막하층을 텐트로 덮고 근육층에서 벗겨내어 필요에 따라 섬유질 태그를 절단했습니다. 이미지는 10x 해부 현미경(B,C)으로 획득했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 말 점막하 장내 신경교세포 배양의 이미징. (A) 말 장내 신경교세포의 성상(화살표), 방추형(열린 화살촉) 및 신경절(닫힌 화살촉) 형태는 위상차 현미경으로 평가되었습니다. (B) 배양물의 순도는 GFAP에 대한 염색으로 평가되었으며, 섬유아세포 마커에 대한 평활근 액틴 스케일 바 = 100mm(A), 400mm(B)에 대해 평가했습니다. 약어 : GFAP = glial fibrillar acidic protein; DAPI = 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 실패한 말 점막하 장내 신경교세포 배양(equine submucosal enteric glia cultures)의 이미징. 배양물의 순도는 GFAP(빨간색)와 섬유아세포 마커인 평활근 액틴(녹색)에 대한 염색으로 평가되었으며, 이는 섬유아세포 오염의 많은 비율을 보여주었습니다. 노란색 화살촉은 GFAP를 나타내고 흰색 화살촉은 평활근 작용을 나타냅니다. 눈금 막대 = 400mm. 약어: GFAP = 신경교 섬유소 산성 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 염증성 사이토카인 및 염증성 신경교세포(inflammatory glial products) 노출에 따른 말 상피 단층 TEER. (A) 24시간 동안 10ng 및 25ng의 IL-1β에 노출된 말 점막하장 신경교세포의 배지에 대한 기저측 노출은 투과성을 유의하게 증가시켰습니다(*p = 0.05 및 0.04, 각각 n = 3-4). (B) IL-1β의 기저외측 25ng 및 말 IL-6의 10-25ng에 대한 말 장세포 단층 급성 노출은 말 상피 단층 투과성을 유의하게 증가시키지 않았습니다(n = 2-4). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 분리 및 배양용 시약. 다음 시약을 사용하여 말 장 신경교 분리, 장 신경 교양 및 말 장 상피 줄기 세포 배양을 위한 배지를 제형화했습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구의 목적은 말 점막하 장신경교세포의 반복 가능한 1차 배양 방법을 개발하고 배앓이 시 상피-신경교세포 상호작용을 모델링하는 데 적용하는 것을 입증하는 것이었습니다. 말에서 새로운 장 신경교세포 분리 및 배양은 돼지 및 설치류 모델과 인간의 장 질환 경로를 이해하는 데 도움이 되는 것으로 입증되었습니다 6,7,13,14. 이 세포 집단을 연구하는 것은 장 환경의 상피하 센서로서의 역할뿐만 아니라 장 벽 내의 주변 세포와 상호 작용하고 통신하는 능력 때문에 잠재적으로 중요합니다. 이들의 예리한 감지 능력으로, 장 조직이 팽창, 허혈 및 잠재적으로 외과적 조작으로 인해 스트레스를 받는 말 산통에서 신경교세포의 잠재적으로 중요한 역할을 상상하는 것은 어렵지 않다6.

Lisowski et al.의 이전 연구는 배앓이 수술 시 말 장 조직의 염증 상태가 높아진 것을 보여주었습니다. 이러한 염증성 환경을 완화하는 것의 중요성은 장 장벽 기능을 방해할 수 있는 능력을 가진 제품을 합성할 수 있는 것으로 입증된 설치류 장아교세포(insent enteric glia) 배양에 의해 강조되고 있습니다 7,12. 장 내강 내용물이 장 벽으로 누출되면 염증 반응이 일어날 뿐만 아니라 순환계에 잠재적으로 침투하여 내독소 쇼크/패혈증을 유발할 수 있습니다. 불행히도 수술 후 말 배앓이 환자는 패혈증 및 수술 후 장폐색증을 포함한 수많은 염증성 수술 후 합병증에 시달리고 있으며, 이는 생존율과 환자의 편안함을 감소시킬 뿐만 아니라 고객 비용과 정서적 고통을 증가시킨다3. 배앓이 시 상피-신경교세포 상호작용 모델을 확립하면 배앓이에서 말 장 장벽 투과성의 잠재적 경로와 가능한 예방을 설명할 수 있습니다.

말 점막하 장아교세포의 배양은 종의 특성으로 인한 적응과 제한을 포함합니다. 가장 중요한 것은 효과적인 효소 분해에 필요한 시간을 적정해야 한다는 것입니다. 저자들은 37 °C에서 2-3 시간 동안 효소를 사용한 배양이 말 장 아교 세포의 성공적인 분리에 필요하다는 것을 발견했습니다. 또한, 패시에이징(passaging) 전에 말의 장내 배양이 80% 이상의 합류점에 도달하도록 허용하는 것은 배양 생존력에 해로운 것으로 보입니다. 이 날짜에 이 방법의 주요 제한 사항은 표본 크기입니다. 이 연구는 연구와 관련되지 않은 이유로 배앓이 수술 또는 안락사를 받는 말에서 얻은 조직/세포만을 대상으로 했습니다. 추가 피험자로부터 말 장아교세포의 지속적인 배양과 말 장아교세포의 동결 및 보관을 위한 프로토콜을 개발하는 것은 이 연구의 힘을 크게 증가시킬 것입니다.

이 연구는 말 배앓이 및 위장관 질환을 이해하는 데 도움이 되는 잠재적 방법론으로서 말 점막하 장염교세포 배양 및 말 장세포의 1차 배양의 새로운 유용성을 소개합니다. 또한, 고립된 장낭 및 오가노이드에서 성장한 말 상피 단층은 과거에 잘 확립되어 있었지만, 이 연구는 모델로서의 유용성을 계속 보여줄 뿐만 아니라 말 장 장세포 및 장 벽 내에서 발견되는 다른 세포 유형과의 상호 작용을 조사하는 추가 연구를 장려합니다.

이러한 세포 유형 간의 관찰된 상호 작용은 배앓이와 염증성 장 질환(IBD) 및 대장염과 같은 기타 염증성 위장 질환 모두에 대한 잠재적인 응용 프로그램을 포함합니다. 또한, 장아교세포(enteric glia) 및 장세포(enterocyte)에 대한 배양 방법의 지속적인 개선을 통해 향후 공동 배양 연구를 확립할 수 있을 것입니다. 또한, 본 연구는 상피 단층에 대한 근접성과 장 장벽 기능에 초점을 맞추기 때문에 점막하 장신경교세포에 초점을 맞추고 있지만, 장벽의 근장신경총에서 말 장신경교세포의 기능을 배양하고 평가하기 위한 추가 작업을 수행할 수 있으며, 이는 염증성 말 장신경교세포가 운동성에 미치는 영향을 결정하는 데 도움이 될 수 있다15.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자들은 이 프로젝트에 자금을 지원해 준 모리스 동물 재단(Morris Animal Foundation)에 감사의 뜻을 전한다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1 M HEPES 버퍼Gibco15630-080
10 mM HEPESLife Technologies15630-106
2 mM GlutaMAXLife Technologies25050-061
4' 6-Diaminidino-2-PhenylindolInvitrogenD3571
Advanced DMEM/F12Life Technologies12634-010
알파 평활근 액틴 항체Abcam7817
Amphotericin BSigmaAA95294.4 g/mL 스톡 분취량, 최종 농도 1.1 &마이크로; g/mL
항진균제 1xGibco15240-096
B27Gibco12587010
혈청 알부민SigmaAA3311
BSA 50mg/mL 원액SigmaA3311
CaCL2ACROS 유기적206791000Equine Ringer ' 의 구성 요소 s 스톡 1: 다른 성분과 결합한 다음 이 스톡 100mL를 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 5% CO2.
로 pH를 7.4로 조정 Equine Ringer와 결합' s 재고 2 완료 " 링거' s Solution"을 참조하십시오.
CollagenaseSigma9891
DMEM-F12 매체Thermo Fisher11320033
당나귀 토끼 방지 IgG Alexa Fluor 594Invitrogen21207
EVOM EndOhm 이중 전극 TEER 측정 챔버World Precision InstrumentsEVM-EL-03-01
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentsEVM-MT-03-01
G5Gibco17503012
겐타마이신 용액SigmaG1272최종 농도 20 &마이크로; g/mL
GFAP 항체Abcam4674
염소 안티 마우스 IgG Alexa Fluor 488Invitrogen28175
IL-1β ELISAThermo FisherESIL1B
KClThermo FisherP330-500Equine Ringer 구성 요소 s 스톡 1: 다른 성분과 결합한 다음 이 스톡 100mL를 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 5% CO2.
로 pH를 7.4로 조정 Equine Ringer와 결합' s 재고 2 완료 " 링거' s Solution"을 참조하십시오.
L-글루타민 용액Corning25-00-Cl
MatrigelBD Bioscience354277
MgCl2Thermo FisherM33-500Equine Ringer' 구성 요소 s 스톡 1: 다른 성분과 결합한 다음 이 스톡 100mL를 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 5% CO2.
로 pH를 7.4로 조정 Equine Ringer와 결합' s 재고 2 완료 " 링거' s Solution"을 참조하십시오.
N2Gibco17502048
Na2HPO4Thermo FisherBP332-1Equine Ringer' 구성 요소 s 스톡 2: 다른 성분과 결합한 다음 이 스톡 100mL를 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 5% CO2.
로 pH를 7.4로 조정 Equine Ringer와 결합' s 재고 1 완료 " 링거' s Solution"을 참조하십시오.
NaClThermo FisherS271-10Equine Ringer의 구성 요소 s 스톡 1: 다른 성분과 결합한 다음 이 스톡 100mL를 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 5% CO2.
로 pH를 7.4로 조정 Equine Ringer와 결합' s 재고 2 완료 " 링거' s Solution"을 참조하십시오.
NaH2PO4Thermo FisherBP329-500말 링거의 구성 요소 s 스톡 2: 다른 성분과 결합한 다음 이 스톡 100mL를 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 5% CO2.
로 pH를 7.4로 조정 Equine Ringer와 결합' s 재고 1 완료 " 링거' s Solution"을 참조하십시오.
NaHCO3Thermo FisherS637-212말 링거의 구성 요소 s 스톡 2: 다른 성분과 결합한 다음 이 스톡 100mL를 눈금이 매겨진 실린더에 넣고 탈이온수로 1L로 희석합니다. 5% CO2.
로 pH를 7.4로 조정 Equine Ringer와 결합' s 재고 1 완료 " 링거' s Solution"을 참조하십시오.
펜/스트렙 용액Gemini400-109
Poly-L-lysineSigmaP26360.5 mg/mL in 1x borate buffer
Prism 소프트웨어GraphPad
ProteaseSigmaP4630
중탄산나트륨 용액SigmaS87617.5% 원액

참고문헌

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Equine Enteric Glial Culture and Application to the Study of a Neural Inflammatory Mechanism in Equine Colic
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