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방법 논문

Establishing A Mouse Model for Respiratory Tract Extreme Low-Temperature Air Inhalation(극한 저온 공기 흡입을 위한 마우스 모델)

687 조회수

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DOI:

10.3791/67254

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2024년 11월 1일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University

이 논문에서

요약

차가운 환경 자극은 다양한 만성 질환의 발병과 관련이 있습니다. 따라서 전임상 연구를 위한 동물 모델을 확립하는 것이 중요합니다. 이 시스템은 병원성 메커니즘에 대한 기본 연구의 요구 사항을 충족하는 자극 모델을 생성하는 장치를 제공함으로써 이러한 요구를 해결합니다.

초록

현재 저온 환경 자극을 위한 마우스 모델을 구성하려면 냉열판과 웨어러블 냉각 장치를 사용합니다. 이러한 방법은 냉 자극에 대한 마우스 피부 또는 신경 회로의 반응 및 조절 효과를 연구하기 위한 요구 사항을 부분적으로 충족할 수 있습니다. 수많은 임상 연구에서 저온 환경에 대한 노출과 다양한 질병의 발병 사이의 상관 관계가 입증되었습니다. 최근에는 장기와 조직 간의 지속적인 정보 교환에 대한 강조가 높아지고 있으며, 이는 인체 내의 오랜 문제를 해결하기 위한 새로운 관점을 제공합니다. 그러나 기존 설비에서는 쥐가 찬 공기를 흡입하는 모델을 구축할 수 없습니다.

추운 환경에 쥐를 두는 것은 매력적으로 보이지만 상당한 한계가 있습니다. 생쥐가 찬 공기를 들이마시는 동안 피부도 추운 환경에 의해 자극을 받기 때문에 병리학적 변화가 먼 장기의 상호작용을 통한 폐 자극 때문인지 아니면 피부 수용체와 신경 신호 전달 때문인지는 불분명하다. 이것은 관련 연구에서 상당한 혼란을 야기합니다. 이 계획은 극한의 냉기 흡입 자극을 위한 마우스 모델을 구성하기 위한 새로운 접근 방식을 제시합니다. 이 장치를 사용하면 생쥐가 신체가 정상 온도를 유지하는 동안 매우 낮은 온도의 가스를 흡입할 수 있습니다. 이는 극한의 주변 온도가 마우스에 미치는 자극 효과의 시뮬레이션을 극대화하고 극한의 환경 온도와 관련 질병 간의 관계를 연구하기 위한 연구 요구 사항을 충족합니다.

서론

이 방법은 주로 비침습적이고 표준화되고 안정적인 배치 반도체 냉동 온도 피드백 장치를 사용하여 마우스에서 매우 낮은 온도의 공기 자극 모델을 제공합니다. 저온과 관련된 임상 실험은 다양한 질병의 발병률 및 예후와 밀접한 관계가 있음이 확인되었습니다. 중국의 272개 주요 도시를 대상으로 한 시계열 연구에서는 총 1,826,186건의 비사고 사망 사례가 발생했습니다. 온도와 사망률 사이의 관계는 일관되게 반전된 J자형 곡선을 나타내며, 추위로 인한 사망률이 높은 단계는 다른 온도보다 훨씬 깁니다. 이것은 뇌졸중과 심혈관 질환에 대한 저온의 영향이 추운 단계에는 무제한임을 시사합니다. 한파가 가라앉은 후에도 지속적인 영향이 있습니다.

사고가 아닌 사망자 중 14.33%는 환경적 온도 요인에 기인하며, 중등도의 추위(-1.4-22.8°C)와 극심한 추위(-6.4--1.4°C)가 각각 10.49%와 1.14%를 차지합니다. 사망 원인은 심혈관 및 뇌혈관 질환 17.48%, 관상 동맥 심장 질환 18.76%, 허혈성 뇌졸중 14.09%, 출혈성 뇌졸중 18.10%, 호흡기 질환 10.57%, 만성 폐쇄성 폐질환 12.57%1 순이다. 중국에서 뇌졸중에 대한 역학 연구는 북쪽에서 남쪽으로 명확한 기울기를 시사합니다2. 중국 북동부의 추운 기후에서 뇌졸중 유병률은 남부 지역에 비해 2.36배 더 높다3. 상당한 연구를 통해 저온 환경이 사망률과 뇌졸중 발병률에 직접적인 영향을 미친다는 사실이 확인되었습니다 4,5,6. 결과적으로, 현저한 기후 온도 차이는 무시할 수 없는 환경적 요인을 나타냅니다.

저온 환경과 뇌졸중 및 심장 질환 발병률 증가 사이의 상관 관계를 설명하는 효과적인 과학적 추론이 부족하다는 점은 여전히 연구 주제로 남아 있습니다. 일반적인 통념에 따르면 추운 온도는 피부 자극과 교감신경 흥분을 통해 혈압을 높일 수있지만7, 개인은 일반적으로 자신을 단열하고 추운 조건에 대응하여 체온 평형을 유지하기 위한 조치를 취합니다. 추운 온도에 노출되면 현대인은 피부 대신 호흡계를 주요 방어 메커니즘으로 사용합니다. 두꺼운 옷은 외부의 추위로부터 피부를 보호할 수 있지만 찬 공기를 호흡기로 흡입하여 기관과 폐포를 강렬한 냉기 자극에 노출시키는 것을 막을 수는 없습니다. 저온 자극을 위한 동물 모델을 구성하는 현재 방법은 크게 두 가지 측면으로 나뉩니다. 첫째, 수많은 연구가 저온 자극에 대한 쥐 피부의 반응 및 조절 메커니즘을 탐구하는 데 중점을 두었습니다. 한 가지 방법은 온도 변화(4-25°C)를 조절할 수 있는 접시에 쥐를 올려 놓고 차가운 자극에 대한 반응으로 체온 조절 및 회피 행동의 특정 조절 메커니즘을 조사하는 것입니다 8,9. 다른 연구에서는 체온 조절에서 신경 회로의 역할을 탐구하기 위해 쥐의 등에 냉각 장치를 배치했습니다10.

반대로, 여러 연구에서는 다양한 온도(4-30°C)의 작은 방에 쥐를 배치했습니다. Lal과 동료들, Qian 등의 연구는 이 방법을 사용하여 추위 유도 섭식 행동의 신경내분비 조절을 조절하는 신경 회로를 탐구하기 위해 냉기 자극의 마우스 모델을 구축했습니다11,12. 그러나 언급된 두 가지 방법에는 한계가 있습니다. 첫째, 최저 온도는 4°C로, 극도의 저온 공기 자극을 시뮬레이션하기에 충분하지 않습니다. 이 방법은 추운 환경에 대한 피부와 신경 회로의 조절 효과를 배제할 수 없습니다. 공기 교환의 주요 장소인 폐는 추위에 민감한 뉴런이 집중되어 있는 기관이기도 하다13,14. 다양한 질병에서 추위에 민감한 뉴런의 조절 역할은 여러 연구자에 의해 확인되었습니다 15,16,17. 이에 따라 호흡기 저온 동물모델을 안정적, 대규모적, 규범적으로 구축할 수 있는 방법이 시급히 필요하다. 극한의 저온 공기 자극 하에서 다양한 만성 질환에서 폐와 추위에 민감한 뉴런의 조절 역할을 이해하는 것은 추운 지역에서 뇌졸중, 관상 동맥 심장 질환 및 호흡기 질환을 예방하고 치료하기 위한 이론적 기초를 제공하는 데 필수적입니다. 우리 팀은 지난 2년 동안 저온 장치를 구축하여 이 중요한 격차를 해결했습니다. 이 장치는 반복성, 실용성, 간단한 구조 및 저렴한 비용이 특징이므로 이러한 연구에 적합합니다.

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프로토콜

실험동물윤리위원회(Experimental Animal Ethics Committee)는 하얼빈 의과대학 제1부속병원에서 동물을 대상으로 하는 모든 시술을 승인했다.

1. 장치의 조립

참고: 장치 구성 요소에 대해서는 그림 1 을 참조하십시오.

  1. 금속 커넥터를 사용하여 두 세트의 황동 쉘을 두 세트의 반도체 냉각 칩에 고정합니다. 황동 쉘과 반도체 냉각 칩 사이에 열전도성 실리콘 그리스를 바르십시오.
  2. 황동 쉘과 반도체 냉각 칩 사이에 열 그리스를 바르십시오.
  3. 아래의 모든 반도체 냉동 부품에 두 그룹의 팬을 연결합니다. 황동 쉘, 팬, 반도체 냉각 칩 및 열전도성 실리콘 그리스가 완전한 장치로 단단히 연결되어 있는지 확인하십시오.
  4. 가스 수집 용기와 슬롯의 두 개의 덮개 플레이트에 장치 전체를 놓습니다.
  5. 가스 수집 용기 위와 아래에 플레이트를 설치하십시오.
  6. 급수관과 급수관을 각각 황동 쉘의 급수구와 배출구에 연결합니다.
  7. 파이프를 사용하여 가스 수집 용기의 상단과 하단에 4개 그룹의 황동 껍질을 연결합니다.
  8. 워터 펌프를 급수 파이프에 연결합니다.
  9. 물 배출 파이프를 수조에 놓습니다.
  10. 4세트의 반도체 냉각기와 워터 펌프를 2세트의 전원 공급 장치(12V 및 40A)에 연결합니다.

2. 실험을위한 동물의 준비

참고: 이 실험에는 4주 된 C57Bl/6 수컷 마우스를 사용했습니다. 모델 준비 전에 3-5일 동안 마우스가 고정 장치에 적응할 수 있도록 하는 것이 좋습니다. 실험 환경은 실온에 있어야 하며 전체 실험 동안 소음을 피하기 위해 조용히 유지해야 합니다.

  1. 고정 장치에 마우스 고정: 고정 장치에 마우스를 놓고 마우스 코 앞부분을 고정 장치의 입구에 배치합니다. 일치하는 스폰지 플러그를 사용하여 고정 장치의 뒤쪽 부분을 채우고 고정하여 통풍구가 있는지 확인합니다. 그런 다음 마우스 고정 장치를 가스 수집 용기의 원통형 슬롯에 놓습니다(그림 1D).

3. 실험적 작업 흐름

  1. 얼음물과 물을 섞어 물통에 넣는다.
    알림: 이 단계에서는 얼음-물 혼합물의 수위가 펌프보다 높은지 확인하여 실험 전반에 걸쳐 혼합물이 제 시간에 추가되도록 합니다. 실온에서 물을 사용하는 것은 권장하지 않습니다
  2. 얼음-물 혼합물 내에 워터 펌프를 배치하고 배출 호스가 잠겨 있는지 확인합니다.
  3. 온도 센서 프로브를 가스 수집 용기의 온도 측정 구멍 안에 놓습니다.
  4. 워터 펌프를 전원에 연결하고 전원을 켭니다.
  5. 전원 공급 장치를 온도 컨트롤러에 연결하고 냉동 장치의 전원 어댑터를 온도 컨트롤러의 전원 소켓에 꽂은 다음 컨트롤러에서 원하는 온도 범위를 설정합니다.
  6. 온도 조절기 온도 범위를 설정합니다.
  7. 실험이 끝나면 마우스를 제거하고 하우징 환경에 다시 놓습니다.
  8. 온도 컨트롤러의 전원 공급 장치를 끕니다.
  9. 워터 펌프를 끕니다.

4. 열화상 촬영

참고: 생쥐가 이 장치 내에서 정상 체온을 유지하면서 매우 낮은 온도의 공기를 흡입할 수 있음을 시연하고 확인하기 위해 열화상 카메라를 사용하여 가스 수집 용기의 온도를 측정했습니다(그림 2).

  1. 휴대용 열화상 카메라를 사용하여 최적의 거리에서 가스 포집 용기의 공기 구멍과 온도 측정 구멍의 온도를 모두 확인합니다.
  2. 측정 위치를 나타내는 빨간색 레이저 포인트를 지정된 온도 측정 영역의 중앙에 정확하게 배치합니다.
  3. 동일한 방법론을 사용하여 마우스의 체온을 다시 측정합니다.

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결과

반도체 냉동 칩, 열전도성 실리콘 그리스, 가스 수집 용기, 온도 조절기, 팬, 수냉식 순환 시스템, 마우스 고정 장치 및 전원 어댑터를 포함하는 이 장치의 전체 구조를 관찰할 수 있습니다. 단일 장치는 최대 16개 마우스의 모델링 요구 사항을 동시에 수용할 수 있습니다(그림 1A, B). 가스 수집 용기, 수냉식 순환 시스템, 반도체 냉동 칩, 팬 및 마우스 고정 장치가 장치의 본체를 구성합니다(그림 1C). 장치 본체 내부에서 마우스 고정 장치의 전면 끝을 가스 수집 용기에 삽입하여 마우스의 코가 저온 가스를 직접 흡입하도록 할 수 있습니다(그림 1D). 장치 본체의 내부 상단에서 4세트의 팬을 관찰할 수 있으며, 팬의 뒷면은 열 전도성 실리콘 그리스를 통해 반도체 냉동 칩에 연결됩니다(그림 1E

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토론

저온 자극 모델을 구축할 때 실험의 정확성과 동물의 복지를 보장하기 위해 몇 가지 주요 단계와 예방 조치가 필요합니다. 실험 내내 실온의 물 대신 얼음물 혼합물을 사용하여 냉각수의 저온 상태를 유지하면 극도로 낮은 온도 환경을 시뮬레이션하는 데 도움이 됩니다. 냉동 시스템의 효율적인 작동을 보장하기 위해 재순환 냉각수 시스템이 방해받지 않는지 확인하십시오. 얼음-물 혼합물을 준비할 때 다음 사항을 고려하십시오: (1) 얼음-물 혼합물은 단단한 얼음 아래에 있는 단단한 얼음과 단단한 얼음 위에 있는 물을 의미합니다. (2) 얼음이 뜨는 원인이 될 수 있으므로 실험 중 고체 얼음의 용융 과정을 주의 깊게 관찰하십시오. 이러한 부유 얼음은 잠재적으로 펌프 표면을 막아 효과적인 열 방출을 방해할 수 있습니다. 실험이 끝나면 워터 펌프 전에 냉동 장치의 전원 공급 장치를 끄십시오. 이를 통해 재순환 용수 시스템이 셧다운 후에도 냉동 반도체에서 열을 계속 발산할 수 있으므로 결과...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
황동 쉘Shenzhen Haida 하이테크 전자 장비 회사
수조, Shenzhen Gongdecheng 플라스틱 산업
팬ChaoJingYin electoronic., LTD401012 V
가스 수집 항아리Shenzhen Gongdecheng 플라스틱 산업
흡기 / 배출구 파이프상하이 Shenchen 고무 및 플라스틱 제품 공장
마우스 고정기 Lanjieke 기술 
전원심천 Haida 하이테크 전자 장비 회사12 V 40
A 반도체 냉각 칩심천 Haida 하이테크 전자 장비 회사TEC2-19006이중층 냉동
스폰지 플러그심천 Gongdecheng 플라스틱 산업
스테인레스 스틸 패스너심천 Haida 하이테크 전자 장비 회사
열전도성 실리콘 그리스Shenzhen Haida 하이테크 전자 장비 회사DRG102
워터 펌프Shenzhen Jutai pump Co., LTDDC00512 V
워터 펌프 전원 어댑터Chaoke 전원 어댑터 공장1210100-240 V 50-60 HZ 12 V

참고문헌

  1. GBD 2016 Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: A systematic analysis for the global burden of disease study 2016. Lancet Neurol. 18 (5), 459-480 (2016).
  2. Wang, W., et al. Prevalence, incidence, and mortality of stroke in china: Results from a nationwide population-based survey of 480 687 adults. Circulation. 135 (8), 759-771 (2017).
  3. Report on Stroke Prevention and Treatment in China Writing Group. The Chinese stroke prevention report 2019 profile. Chinese Journal of Cerebrovascular Disease. 17 (05), 272-281 (2020).
  4. Gasparrini, A., et al. Mortality risk attributable to high and low ambient temperature: A multicountry observational study. Lancet. 386 (9991), 369-375 (2015).
  5. Yang, J., et al. The burden of stroke mortality attributable to cold and hot ambient temperatures: Epidemiological evidence from China. Environ Int. 93, 232-238 (2016).
  6. Guo, Y., et al. Global variation in the effects of ambient temperature on mortality: A systematic evaluation. Epidemiology. 25 (6), 781-789 (2014).
  7. Bai, L., et al. Increased coronary heart disease and stroke hospitalisations from ambient temperatures in Ontario. Heart. 104 (8), 673-679 (2018).
  8. Jung, S., et al. A forebrain neural substrate for behavioral thermoregulation. Neuron. 110 (2), 266-279 (2022).
  9. Liu, R., et al. Lateral habenula neurons signal cold aversion and participate in cold aversion. Neurochem Res. 49 (3), 771-784 (2024).
  10. Feng, C., et al. Cold-sensitive ventromedial hypothalamic neurons control homeostatic thermogenesis and social interaction-associated hyperthermia. Cell Metab. 34 (6), 888-901 (2022).
  11. Lal, N. K., et al. Xiphoid nucleus of the midline thalamus controls cold-induced food seeking. Nature. 621 (7977), 138-145 (2023).
  12. Qian, S., et al. A temperature-regulated circuit for feeding behavior. Nat Commun. 13 (1), 4229(2022).
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  14. Balestrini, A., et al. A trpa1 inhibitor suppresses neurogenic inflammation and airway contraction for asthma treatment. J Exp Med. 218 (4), e20201637(2021).
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  16. De Almeida, A. S., et al. Role of trpa1 expressed in bone tissue and the antinociceptive effect of the trpa1 antagonist repeated administration in a breast cancer pain model. Life Sci. 276, 119469(2021).
  17. Wang, Q., et al. Trpa1 regulates macrophages phenotype plasticity and atherosclerosis progression. Atherosclerosis. 301, 44-53 (2020).

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