방법 논문

키메라 항원 수용체 T 세포에서 체외 게놈 와이드 CRISPR 녹아웃 스크리닝 수행

DOI:

10.3791/67338

⸱

2025년 1월 31일

 ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, 3Department of Molecular Pharmacology and Experimental Therapeutics, Mayo Clinic, 4Center for Regenerative Biotherapeutics, Mayo Clinic, 5Division of Hematology, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

이 논문에서

요약

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이 논문은 건강한 기증자 키메라 항원 수용체 T 세포에서 게놈 전체 CRISPR 녹아웃 스크리닝을 완료하기 위해 고갈에 대한 체외 모델을 적용하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

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키메라 항원 수용체 T(CART) 세포 요법은 암 치료에 혁명을 일으킨 혁신적인 형태의 표적 면역 요법입니다. 그러나 지속적인 응답은 여전히 제한적입니다. 최근 연구에 따르면 주입 전 CART 세포 제품의 후성유전학적 환경이 치료에 대한 반응에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났으며, 이에 대한 해결책으로 유전자 편집이 제안되고 있습니다. 그러나 최적의 유전자 편집 전략을 결정하기 위해서는 더 많은 작업이 필요합니다. 게놈 차원의 CRISPR 스크리닝은 내성 메커니즘을 조사하고 유전자 편집 전략을 최적화하는 데 널리 사용되는 도구가 되었습니다. 그러나 일차 세포에 적용하는 데는 많은 어려움이 있습니다. 여기에서는 건강한 기증자의 CART 세포에서 게놈 전체의 CRISPR 녹아웃 스크리닝을 완료하는 방법에 대해 설명합니다. 개념 증명 모델로서, 우리는 CD19 항원을 표적으로 하는 CART 세포의 고갈 발달을 조사하기 위해 이 방법을 설계했습니다. 그러나 우리는 이 접근법이 다양한 CAR 구조 및 종양 모델에서 치료에 대한 다양한 내성 메커니즘을 해결하는 데 사용될 수 있다고 믿습니다.

서론

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키메라 항원 수용체 T(CART) 세포 요법은 B 세포 악성 종양 치료에서 인상적인 성공을 거두었습니다. 그러나 내구성 있는 응답은 30-40%1,2,3,4,5로 제한됩니다. 연구자들은 CAR 설계의 최적화, 유전자 편집 및 조합 요법을 포함하여 CART 세포 요법에 대한 내성 메커니즘을 해결하기 위한 여러 접근 방식을 개발하고 테스트했지만 내성의 발달은 거의 알려지지 않았습니다. 최근에는 주입 전 CART 세포 제품의 기본 유전자 발현 프로파일이 CART 요법의 독성과 효능을 결정하는 중요한 요인이라는 증거가 증가하고 있습니다 6,7,8,9. 따라서 CART 세포 생산 중 유전자 편집은 CART 세포 치료 성공을 개선하기 위한 인기 있는 접근 방식이 되었습니다.

예를 들어, 우리 연구실은 이전에 CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9 기술을 사용하여 GM-CSF(Granulocyte-Macrophage Colony Stimating Factor) 유전자를 제거하면 CART 세포 활성이 향상되고 CART 관련 독성 징후가 감소하는 것으로 나타났습니다 10,11,12. 또한, CRISPR로 조작된 세포 치료제는 임상 시험에서 검증되었으며 효능과 안전성을 입증했습니다13. 이는 CRISPR 기술을 사용한 유전자 편집이 CART 세포 생물학에 대한 이해를 높일 수 있을 뿐만 아니라 번역 가능한 CART 세포 산물을 생성할 수 있음을 나타냅니다.

게놈 와이드 CRISPR 녹아웃 스크리닝은 치료제에 대한 내성 메커니즘을 이해하기 위한 암 생물학 연구에서 점점 더 인기 있는 도구가 되고 있습니다. 이 기술에서는 수만 개의 가이드 RNA(gRNA)가 세포 풀로 전달되어 세포당 하나의 gRNA가 진입하도록 유도합니다14. 그런 다음 세포는 필수 유전자를 표적으로 하는 gRNA로 transduction된 세포가 죽고 억제 유전자를 표적으로 하는 gRNA로 transduction된 세포가 살아남아 증식하는 압력 유발 조건을 겪습니다. 차세대 염기서열분석을 사용함으로써, CRISPRscreen14 전체에서 gRNA 표현이 어떻게 변화하는지 확인할 수 있습니다.

그러나 게놈 전체의 유전자 교란에 필요한 규모와 선택 시간은 CART 세포와 같은 일차 세포에서 달성하기 어려울 수 있습니다. 따라서 그룹은 치료 내성의 메커니즘을 더 잘 이해하기 위해 표적 CRISPR 스크리닝을 활용했습니다15,16. targeted screening은 적절한 library representation을 달성하기 위해 더 적은 수의 cell이 필요한 더 작은 라이브러리를 가지고 있기 때문에 primary cells에서 더 쉽게 완료할 수 있는 경우가 많습니다. 이러한 연구는 CART 세포 치료에 대한 내성 기전에 대한 이해를 향상시켰지만, 표적 스크리닝은 유전자 표적을 수동으로 선택하기 때문에 편향을 유발합니다. 이 논문은 건강한 기증자의 CART 세포에서 체외 게놈 전체 CRISPR 녹아웃 스크리닝을 완료하는 방법을 설명하고자 합니다. 따라서 이러한 고처리량 접근법은 치료 반응을 개선하기 위해 편집할 수 있는 주요 경로와 유전자를 효율적이고 편향되지 않게 식별할 수 있습니다 17,18,19.

특히, 이 기사에서 설명한 프로토콜은 고갈에 대한 체외 모델로 게놈 전체 CRISPR 녹아웃 스크리닝을 완료하여 CART 세포 고갈에 대한 현장의 이해를 높이도록 설계되었습니다. 탈진은 CART 세포 요법에 대한 무반응과 관련된 기능 장애인 CART 세포의 운명입니다 20,21,22. 이 세포의 운명은 후성유전적으로 조절되는 것으로 알려져 있으며, CART 세포 증식의 감소, 효과기 사이토카인 생산의 감소, 억제 수용체의 발현 증가를 특징으로 한다23. 이전 문헌에서 유전자 편집은 주요 유전자를 상향 또는 하향 조절하여 탈진의 진행을 예방할 수 있었습니다 24,25,26. CART 세포가 고갈됨에 따라 증식 능력이 감소하고 유전자 편집이 발병을 예방할 수 있다는 증거를 모두 고려하여 우리는 이 세포의 운명에 대해 체외 게놈 차원의 CRISPR 녹아웃 스크린을 모델링했습니다. 그러나 이 프로토콜은 향후 CART 세포 요법에 대한 다른 내성 기전을 탐색하기 위해 수정될 수 있습니다.

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프로토콜

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중요한 것은 아래에 설명된 프로토콜이 Mayo Clinic의 기관 검토 위원회(IRB 18-005745) 및 기관 생물 안전성 위원회(IBC HIP00000252.43)의 지침을 따르고 승인을 받았다는 것입니다. 렌티바이러스 생산을 포함한 모든 세포 배양 작업은 적절한 개인 보호 장비와 함께 세포 배양 후드에서 수행해야 합니다. 특히, 렌티바이러스 작업은 폐기 전 물품을 소독하기 위해 10% 표백제를 사용하는 것을 포함하여 생물 안전성 레벨 2(BSL-2) 예방 조치에 따라 수행해야 합니다.

1. CRISPR 라이브러리의 증폭

  1. 제조업체의 권장 사항에 따라 CRISPR 라이브러리를 증폭합니다. 간단히 말해서, 다음을 완료하여 CRISPR 라이브러리를 4개의 전기 competent 세포 부분 표본으로 electroporating합니다.
    1. 1.0mm 큐벳에서 25μL의 전기 컴피턴트 셀에 2μL의 50ng/μL CRISPR 라이브러리 플라스미드를 추가합니다.
    2. 10μF, 600Ohms, 1,800V 및 3.5ms에서 4.5ms 사이의 시간 상수를 사용하여 샘플을 전기천공합니다.
    3. 975μL의 회수 매체에서 회수하고 1mL의 추가 회수 매체가 있는 튜브로 옮깁니다.
    4. 모든 부분 표본을 37°C에서 1시간 동안 250RPM으로 회전합니다.
  2. 변형을 플레이트화합니다.
    1. 전기천공된 세포의 모든 분취액을 모으고 잘 섞습니다.
    2. 100μg/mL 카르베니실린으로 예열된 10cm 루리아 육수(LB) 플레이트에 형질전환 혼합물 400μL를 펴 전기천공된 모든 세포를 플레이트화합니다. 플레이트를 32°C의 인큐베이터에 14시간 동안 놓습니다.
  3. 식민지 수확:
    1. LB 배지 1mL + 카르베니실린 100μg/mL를 각 플레이트에 피펫팅합니다. 각 플레이트에서 콜로니를 긁어내어 50mL 원뿔형 튜브에 모읍니다.
    2. 각 플레이트에 LB 배지 1mL + 카르베니실린 100μg/mL를 더 추가하여 세척하고 완전한 회복을 보장합니다.
    3. maxi-prep 키트의 지침에 따라 maxi-prep을 수행합니다.
    4. 생성된 플라스미드 DNA를 풀링합니다.

2. CRISPR 라이브러리에서 baseline gRNA 발현을 검증하기 위한 차세대 염기서열분석

참고: 이 CRISPR 라이브러리에 대한 NGS 프라이머는 이전 간행물27에서 설계되었습니다. 각 샘플에 대해 다른 리버스 프라이머를 사용하면 각 샘플에 바코드를 부착하고 염기서열분석 중에 샘플을 풀링할 수 있습니다.

  1. 다음 반응 혼합물(총 부피 = 50 μL)로 PCR용 샘플을 준비합니다: 고충실도 PCR 마스터 믹스, 2x: 25 μL; 풀링된 주형 DNA, 0.5 μg: 1 μL; NGS 라이브러리 포워드 프라이머, 10 μM: 1.25 μL; NGS 라이브러리 리버스 프라이머, 10 μM: 1.25 μL; DNase가 없는 물: 21.5 μL.
  2. 다음 사이클링 조건으로 PCR을 수행합니다: 주기 1: 98°C에서 3분 동안 변성; 주기 2-23 : 98 °C에서 10 초 동안 변성, 10 초 동안 63 °C에서 어닐링, 25 초 동안 72 °C에서 연장; 사이클 24: 72°C에서 2분 동안 연장합니다.
  3. 제조업체의 지침에 따라 각 샘플에 대한 PCR 반응을 통합하고 PCR 정제 키트로 PCR 산물을 정제하여 PCR 반응을 정제합니다.
  4. 2%(w/v) 아가로스 겔에서 각 샘플에 대해 3μg의 PCR 산물을 실행합니다.
  5. 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 겔에서 DNA를 추출하여 겔에서 PCR 산물(~260-270 bp)을 제거합니다. 최소 500ng의 DNA를 목표로 합니다.
  6. 추출된 샘플은 -20°C에서 보관하십시오.
  7. 샘플로 차세대 염기서열분석(NGS)을 수행하고 gRNA27당 100회 판독을 목표로 합니다.
  8. MAGeCK-VISPR 파이프라인으로 염기서열분석 결과를 분석하고 라이브러리에 있는 gRNA의 99.5% 이상이28개 이상 표현되는지 확인합니다.

3. CRISPR 라이브러리 및 CAR 발현 렌티바이러스 생산

  1. 앞서 설명한 바와 같이 렌티바이러스를 준비한다10,29.
    1. 1일차: 10% 소 태아 혈청(FBS) (v/v), 1% 페니실린-스트렙토마이신-글루타민(PSG) (v/v) 및 Dulbecco의 변형된 독수리 배지로 구성된 D10 배지에서 성장한 80-90% 융합 293T 세포의 T175 플라스크로 시작합니다. 시작하기 전에 transfection 시약과 DNA를 실온으로 가열하고 DNA를 정량화합니다.
    2. 각 293T 플라스크에 대해 두 개의 50mL 원뿔형 튜브 A 및 B에 라벨을 붙입니다. 4.5mL의 환원된 혈청 배지를 튜브 A 와 튜브 B에 추가합니다.
    3. 멸균 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 다음 DNA를 혼합하고 1분 동안 방치합니다: pCMVR8.74 18 μg(gag, pol, tat, rev), 7 μg의 pMD2.G(VSV-G), 15 μg의 렌티바이러스 발현 벡터(CRISPR library A 또는 CAR19-28ζ 벡터).
    4. 129μL의 transfection 시약을 튜브 A에 추가합니다. 튜브 A 를 손가락 볼텍싱으로 잘 섞습니다.
    5. DNA 혼합물을 튜브 B에 추가합니다. 튜브 B 를 핑거 볼텍싱으로 잘 혼합합니다.
    6. 111μL의 중성 공지질 시약을 튜브 B에 추가합니다. 튜브 B 를 핑거 볼텍싱으로 잘 혼합합니다.
    7. 튜브 A 의 내용물을 튜브 B 에 넣고 손가락 볼텍싱으로 잘 섞습니다. 튜브 B 를 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    8. 30분의 배양 기간이 끝날 무렵 기존 배지를 흡인하여 293T 세포를 준비합니다. 10% FBS(v/v), 1% PSG(v/v) 및 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640으로 구성된 R10 배지 16mL를 추가합니다.
    9. 30분의 배양 기간이 지난 후 튜브 B (약 9mL)의 내용물을 293T 세포의 플라스크에 적가합니다. 플라스크를 내려놓고 부드럽게 회전시킨 후 37°C, 5% CO2에서 배양합니다.
    10. 2일차(transfection 후 약 24시간)에 다음과 같이 렌티바이러스를 수집합니다.
      알림: 모든 장비와 재료를 사전 냉각하고 얼음 위에서 다음을 수행하여 바이러스 상층액을 차갑게 유지하십시오.
      1. transfection된 293T 플라스크에서 사전 냉각된 50mL 코니컬 튜브로 상등액을 옮깁니다.
      2. 예열된 R10 매체 30mL를 293T 플라스크에 추가합니다.
      3. 닫힌 로터에서 900 × g 의 50 mL 코니컬 튜브를 4 °C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 펠렛화합니다.
      4. 원심분리 후 0.45μm 필터로 상층액을 여과합니다. 112,700 × g 의 초원심분리기에서 4°C에서 2시간 동안 여과액을 회전시킵니다.
      5. 2시간 탈수 후 약 5mL가 남을 때까지 상등액을 흡입합니다. 바이러스 입자를 위아래로 10회 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킵니다. 바이러스 현탁액을 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
    11. 3일차에는 다음과 같이 렌티바이러스를 수집하고 보관합니다.
      1. transfection된 293T 플라스크에서 사전 냉각된 50mL 코니컬 튜브로 상등액을 옮깁니다.
      2. 30T 플라스크에 10% 표백제 293mL를 추가합니다.
      3. 닫힌 로터에서 50mL 코니컬 튜브를 900 × g에서 10 분 동안 4 °C로 원심분리하여 상층액의 세포 파편을 펠렛화합니다.
      4. 원심분리 후 0.45μm 필터로 상층액을 여과합니다. 112,700 × g 의 초원심분리기에서 4°C에서 2시간 동안 여과액을 회전시킵니다.
      5. 2시간 원심분리 후 약 2mL가 남을 때까지 상등액을 흡입하고 10회 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁합니다. 바이러스 상층액을 300-500 μL 분취액에 보관하고 -80 °C에서 유지하십시오.

4. CAR 발현 렌티바이러스에 대한 바이러스 역가 계산

참고: CAR 렌티바이러스는 앞서 설명한 바와 같이 역가를 측정하였다10,12.

  1. 1일차에 T 세포를 활성화하고 플레이트를 만듭니다.
    1. 음성 선택 키트를 사용하여 건강한 donor PBMC에서 1 × 106 T 세포를 분리합니다.
    2. T 세포를 세십시오.
    3. CD3+/CD28+ 비드를 충분히 세척하여 3:1 비드:세포 비율로 T 세포를 자극합니다. 예를 들어, 1 × 106 T 세포를 자극하려면 3 × 106 구슬을 씻습니다. 이렇게 하려면 다음 3x를 완료하여 구슬을 씻으십시오.
      1. 자기 분리를 사용하여 현탁액에서 비드를 제거합니다.
      2. 상층액을 제거합니다.
      3. 10% 인간 혈청(v/v), 1% PSG(v/v) 및 조혈 세포 배지로 구성된 1000μL의 T 세포 배지(TCM)를 추가합니다.
        알림: TCM은 사용하기 전에 0.45μm 멸균 진공 필터로 여과한 다음 0.22μm 멸균 진공 필터로 여과하여 멸균해야 합니다.
      4. 3:1 bead:cell 비율로 T-cell 현탁액에 beads를 추가합니다.
      5. TCM에서 T 세포를 1 × 106 cells/mL로 재현탁합니다.
      6. 100μL의 활성 T 세포를 96웰 플레이트의 10웰에 추가합니다. 플레이트를 37 ° C, 5 % CO2 에서 배양합니다.
  2. 2일차에 다음과 같이 희석 플레이트를 만들어 CAR 렌티바이러스 희석액을 추가합니다.
    1. 100μL의 TCM을 96웰 플레이트의 7웰에 추가합니다.
    2. 첫 번째 웰에 관심 바이러스 50μL를 추가합니다. 잘 섞는다.
    3. 웰 1에서 웰 2로 50 μL를 첨가하여 바이러스를 더 연속적으로 희석합니다. 잘 섞는다.
    4. 웰 2에서 웰 3으로 50μL를 추가하고 웰 7까지 이 패턴을 계속합니다.
    5. 웰 7을 혼합한 후 50μL를 제거합니다. 모든 웰의 총 부피가 100μL인지 확인합니다.
    6. 희석 플레이트의 각 웰에서 1일차부터 T 세포 플레이트의 처음 7개 웰에 50μL를 추가합니다. 잘 섞는다.
    7. T 세포 플레이트의 마지막 3 개의 웰에 50 μL의 TCM을 첨가하십시오. 잘 섞는다. 플레이트를 37 ° C, 5 % CO2의 인큐베이터에 보관하십시오.
  3. 3일차에 T-세포 플레이트의 모든 웰에 100μL의 TCM을 첨가하여 세포에 공급합니다. 잘 섞는다.
  4. 4일차에 유세포 분석을 수행하여 CAR 발현의 대리 마커인 anti-kappa chain antibody로 CAR을 발현하는 세포의 비율을 검출하기 위해 다음을 완료하여 다음을 수행합니다.
    1. T 세포 플레이트를 1,000 ×g에서 3 분 동안 스핀 다운하고 디캔팅합니다.
    2. 200μL의 항카파 사슬 항체 완충액을 첨가하고 1,00×0g에서 3 분 동안 플레이트 를 회전시킨 후 디캔팅하여 항카파 사슬 항체 완충액(PBS(w/v)의 4% 소 혈청 알부민으로 구성)으로 플레이트를 3x 세척합니다.
    3. 각 웰에 비오틴 항-카파 사슬 항체를 추가합니다. 4 °C의 로커에서 45분 동안 배양합니다.
    4. 4.4.2단계와 같이 항카파 사슬 항체 완충액으로 플레이트를 3번 세척합니다.
    5. 유세포 분석을 위해 세포를 형광색소 접합 스트렙타비딘 항체와 살아있는/죽은 항체로 염색합니다. 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 샘플을 배양합니다.
    6. 200μL의 플로우 버퍼를 추가하고 1,000 × g 에서 3분 동안 플레이트를 회전시킨 다음 디캔팅하여 플로우 버퍼(PBS에서 2% FBS(v/v) 및 1% 아지드화나트륨(v/v)으로 구성)에서 샘플을 한 번 세척합니다.
    7. 100μL의 흐름 버퍼에 재현탁하고 세포분석기에서 실행합니다.
    8. 3개의 untransduced well에 대해 negative gating을 수행합니다.

5. CRISPR 라이브러리 렌티바이러스에 대한 바이러스 역가 계산

참고: 이 프로토콜은 CRISPR 라이브러리 렌티바이러스를 적정하기 위한 최소 T 세포 수를 설명하지만, 더 많은 T 세포를 수용하기 위해 확장할 수 있으므로 더 많은 양의 바이러스를 수용할 수 있습니다.

  1. 0일차에 6 × 10 6 T 세포에 18 ×10 6 CD3+/CD28+ 비드(3:1 비드:세포 비율)를 추가하고 TCM을 사용하여 최종 부피를 6mL로 만들어 T 세포를 활성화합니다. T 세포 현탁액 0.5mL를 48웰 플레이트의 12웰에 분취합니다. 37 ° C, 5 % CO2의 인큐베이터에 보관하십시오.
  2. 24시간 후인 1일차에 모든 웰에 MOI(Multiplicity of Infection)가 3인 CAR 바이러스를 추가합니다. 여러 차례 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 37 ° C, 5 % CO2의 인큐베이터에 보관하십시오.
  3. 48시간 후인 Day 2에 각 웰에 다음 부피의 CRISPR 바이러스 중 하나를 추가하여 일련의 CRISPR 라이브러리 바이러스 부피를 활성화된 CART 세포에 추가합니다(0 μL, 0 μL, 6.25 μL, 6.25 μL, 12.5 μL, 12.5 μL, 25 μL, 25 μL, 50 μL, 50 μL, 100 μL 또는 100 μL). 여러 차례 위아래로 피펫팅하여 잘 섞습니다. 37 ° C, 5 % CO2의 인큐베이터에 보관하십시오.
  4. 3일차에 CRISPR 바이러스 부피(0 μL, 6.25 μL, 12.5 μL, 25 μL, 50 μL 및 100 μL)를 각각 수용한 웰 1개를 포함하여 배지 mL당 1μg의 퓨로마이신을 추가합니다. 다른 웰은 퓨로마이신으로 처리되지 않습니다.
  5. 4일차부터 8일차까지 매일 T 세포를 계수하고 최종 세포 밀도를 1 × 106 cells/mL로 조정하고 퓨로마이신 처리 웰의 경우 TCM에 1 μg/mL, 처리되지 않은 웰의 경우 TCM으로 조정합니다.
  6. 8일차에 웰당 살아있는 세포의 수를 세고 다음 방정식을 사용하여 바이러스 상층액의 형질 도입 단위/mL를 계산합니다.
    figure-protocol-1
    어디에: 바이러스로 잘 형질전환된 살아있는 세포 수; B : 항생제 선택 제어없이 살아있는 세포 수; V: 각 우물에 있는 감염에 사용되는 바이러스 양; D: 희석 폴드.
  7. 약 20%의 형질도입 효율을 보이는 웰에서 계산된 TU/mL 웰을 사용하여 다음 공식을 사용하여 0.3의 MOI에서 1 × 106 개의 세포를 형질도입하는 데 필요한 바이러스의 부피를 계산합니다.
    figure-protocol-2

6. CRISPR 스크린의 CART 세포 생산 단계 (0 - 8일)

참고: 다음 프로토콜은 한 번의 생물학적 복제에서 CRISPR 스크리닝이 완료되는 것을 설명합니다. 그러나 이 프로토콜은 이전에 3개의 생물학적 복제물로 검증되었으며 이 프로토콜을 완료하는 다른 사람들에 대해 최소 3개의 생물학적 복제물을 사용할 것을 권장합니다30.

  1. 0일차: 앞서 설명한 대로 건강한 헌혈자의 혈액에서 T 세포를 분리하고 자극합니다10.
    1. 비식별화된 건강한 기증자 혈액에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리합니다.
      1. 15mL의 밀도 구배 배지를 밀도 구배 분리 튜브에 추가합니다.
      2. 1:2 농도 구배 분리 튜브의 상단에 1:2 희석된 혈액을 추가합니다. 실온에서 1,200 × g 에서 10분 동안 원심분리기.
        참고: 혈액은 분리 완충액(인산염 완충 식염수[PBS]에서 2% FBS(v/v))으로 희석해야 합니다.
      3. 상단 층을 새로운 50mL 코니컬 튜브로 분리하고 분리 버퍼로 부피를 두 배로 늘립니다. 시료를 300 × g 에서 4°C에서 8분 동안 원심분리합니다. 상층액을 흡인합니다.
      4. 분리 버퍼로 세포 펠릿을 재현탁하고 PBMC를 계수합니다.
    2. negative selection kit를 사용하여 PBMC에서 T 세포를 분리합니다. 키트에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다.
      참고: PBMC에서 T 세포가 10-20% 회수된다고 가정합니다.
    3. CD3+/CD28+ 비드로 T 세포를 자극합니다.
      1. T 세포를 세십시오.
      2. 3:1 bead:cell 비율로 T 세포를 자극할 수 있을 만큼 충분한 CD3+/CD28+ beads를 분취합니다. 예를 들어, 110 × 106 T 세포를 자극하려면 330 × 106 구슬을 분주합니다. 먼저 자기 분리로 현탁액에서 비드를 분리한 다음 1,000μL의 TCM을 첨가하여 비드를 3회 세척합니다.
      3. T 세포 현탁액에 비드를 추가합니다. TCM에서 T 세포를 1 × 106 cells/mL로 재현탁합니다.
      4. 최상의 transduction efficiency를 위해 6-well plate에서 T-cell을 분취합니다. 각 웰에 5 × 106 T 세포를 추가합니다. 세포를 37 ° C, 5 % CO2 에서 24 시간 동안 배양합니다.
  2. 1일차: BSL-2+ 조건에서 3.0의 감염 다중으로 T 세포를 transduction할 수 있을 만큼 CAR 렌티바이러스를 충분히 해동합니다. 3.0의 MOI로 5 × 106 T 세포를 형질도입하기 위해 적절한 양의 풀링된 렌티바이러스를 첨가하기 전에 T 세포 로제트를 부드럽게 분해합니다. 37 ° C, 5 % CO2 에서 세포를 배양합니다.
    참고: T 세포를 형질주입하기 전에 여러 생산에서 나온 렌티바이러스를 하나의 튜브에 풀링합니다. 이를 통해 모든 T 세포가 동일한 치료를 받을 수 있습니다. 또한 렌티바이러스는 한 번만 해동해야 합니다.
  3. 2일차: BSL-2+ 조건에서 CRISPR 렌티바이러스가 0.3의 MOI로 T 세포를 형질도입할 수 있을 만큼 충분히 해동합니다. T 세포 로제트를 부드럽게 분해하고 T 세포를 재현탁시킨 후 적절한 양의 풀링된 렌티바이러스를 첨가하여 0.3의 MOI로 5 × 106 T 세포를 형질도입합니다. 37 ° C, 5 % CO2 에서 세포를 배양합니다.
    참고: T 세포를 형질주입하기 전에 여러 생산에서 나온 렌티바이러스를 하나의 튜브에 풀링합니다. 이를 통해 모든 T 세포가 동일한 치료를 받을 수 있습니다.
  4. 3-5일차: CART 세포를 재현탁하여 로제트를 분해하고 세포를 계수합니다. 1 μg/mL 퓨로마이신을 사용하여 TCM에서 최종 세포 농도를 1 × 106 cells/mL로 가져옵니다. 37 ° C, 5 % CO2 에서 세포를 배양합니다.
  5. 6일차: CART 세포를 재현탁하여 로제트를 분해하고, 자기 분리를 통해 CD3+/CD28+ 비드를 제거하고, CART 세포를 계수합니다. TCM에 1 μg/mL 퓨로마이신을 첨가하여 최종 세포 농도를 1 × 106 cells/mL로 낮추고 37 °C, 5% CO2에서 세포를 배양합니다. 4.4단계에 설명된 대로 유세포분석으로 CAR 발현을 측정합니다.

7. CRISPR 스크리닝의 gRNA 선정 단계 (8일 - 22일)

  1. 8일차: 차세대 염기서열분석(NGS)을 위해 샘플을 보존하고 공동 배양을 시작합니다.
    1. 4°C에서 300× g 의 시료를 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡인하고 20mL의 TCM에 시료를 재현탁하여 CART 세포를 TCM에서 3회 세척합니다.
    2. CART 셀을 계산합니다.
    3. 다음을 완료하여 NGS용 샘플을 보존합니다.
      1. gRNA당 500개의 세포의 gRNA 발현을 유지하기 위해 50mL 코니컬 튜브에 충분한 CART 세포를 분취합니다(예: 65,383 gRNA가 있는 CRISPR 라이브러리를 사용하는 경우 약 33 ×10 6 CART 세포 분취). 샘플을 300 × g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.
      2. 세포 펠릿을 1mL의 PBS에 재현탁시키고 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 50mL 코니컬 튜브를 1mL의 PBS로 세척하고 세척액을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
      3. 500 × g 에서 4 °C에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 -20 °C에서 보관하십시오.
      4. CD19+ JeKo-1 세포에 CART 세포를 1:1 비율로 첨가하여 공동 배양을 시작합니다. 예를 들어, 80 × 106 CART 셀을 80 ×10 6 JeKo-1 셀에 추가합니다. TCM을 사용하여 공동 배양의 총 부피를 160mL로 가져옵니다. 샘플을 37 ° C, 5 % CO2의 인큐베이터에 보관하십시오.
        참고: 라이브러리 표현을 유지하고 15일차와 22일차에 샘플을 보존할 수 있는 충분한 세포를 확보하기 위해 최소 80 ×10 6 CART 셀로 시작하는 것이 좋습니다.
  2. 10일차: CART 세포를 재가열하기 위해 공동 배양을 50mL 코니컬 튜브에 수집하고 4°C에서 5분 동안 300× g 으로 샘플을 원심분리합니다. 각 샘플을 80mL의 TCM에 재현탁시키고 80mL의 TCM에 80 × 106 JeKo-1 세포를 추가합니다. 샘플을 37 ° C, 5 % CO2의 인큐베이터에 보관하십시오.
  3. 12일차 및 14일차: 7.2단계와 같이 CART 셀을 재조정합니다.
  4. 15일차: NGS용 샘플을 보존하고 CART 세포를 재복원합니다.
    1. CART-JeKo-1 공동 배양에서 T 세포를 분리하기 위해 먼저 세포를 계수한 다음 CD4+ T 세포에 대한 positive selection kit와 CD8+ T 세포에 대한 positive selection kit를 결합하여 공동 배양에서 CART 세포를 분리합니다. T 세포를 세십시오.
    2. 50 mL 코니컬 튜브에 33 × 106 CART 셀을 분주하고 4 °C에서 5분 동안 300 × g 의 시료를 원심분리하여 NGS용 샘플을 보존합니다. 1mL의 PBS에 샘플을 재현탁하고 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 50mL 코니컬 튜브를 1mL의 PBS로 세척하고 세척액을 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 샘플을 500 × g 에서 4 ° C에서 5 분 동안 원심 분리; 상등액을 제거하십시오. 세포 펠릿을 -20 °C에서 보관하십시오.
    3. 80 × 106 JeKo-1 세포에 80 × 106 CART 세포를 추가하여 고갈에 대한 체외 모델을 계속하도록 공동 배양을 설정합니다. 그런 다음 TCM을 사용하여 공동 배양의 총 부피를 160mL로 가져옵니다. 샘플을 37 ° C, 5 % CO2의 인큐베이터에 보관하십시오.
  5. 17일, 19일, 21일: 7.2단계와 같이 CART 셀을 재복원합니다.
  6. 22일차: NGS용 샘플을 보존합니다.
    1. 먼저 세포를 계수하여 공동 배양에서 CART 세포를 분리합니다. 그런 다음 CD4+ T 세포에 대한 양성 선택 키트와 CD8+ T 세포에 대한 양성 선택 키트를 결합하여 CART-JeKo-1 공동 배양에서 T 세포를 분리합니다. T 세포를 세십시오.
    2. NGS에 대한 샘플을 보존하려면 7.4.2단계를 반복합니다.

8. 차세대 염기서열분석을 위한 게놈 DNA 준비

참고: 적절한 적용 범위를 유지하려면 게놈 DNA(gDNA)를 최소 33개 × 10개의6 CART 세포에서 분리해야 합니다. 또한 33 × 106 CART 세포의 gDNA 전체를 염기서열분석을 위해 준비해야 합니다.

  1. gDNA 분리 키트를 사용하여 동결 세포 펠릿에서 gDNA를 분리합니다.
  2. 에탄올 침전을 통해 gDNA를 정제합니다.
    1. 100% EtOH를 -20°C로 예냉각합니다.
    2. 부분 표본은 DNA를 여러 개의 마이크로 원심분리기 튜브(200-250 μL)에 동일하게 용출했습니다. 각 분취액에 다음을 추가합니다: 100% EtOH 2개 부피(250μL 분취량의 경우 500μL 또는 200μL의 경우 400μL); 3M 아세트산 나트륨의 0.1 부피 (250 μL 부분 표본의 경우 25 μL 또는 200 μL의 경우 20 μL); 및 1μL의 20mg/mL 글리코겐. -20 °C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
    3. 둘째 날에는 13,000 × g 에서 20분 동안 샘플을 회전시켜 침전된 DNA를 펠릿화합니다. 상층액을 제거합니다. 7,500 × g 에서 10분 동안 회전하여 70% EtOH 1mL로 펠릿을 세척합니다.
    4. 잔류 EtOH를 완전히 제거합니다. 펠릿을 30-45분 동안 건조시킵니다.
    5. 펠릿을 50μL의 멸균수에 재현탁합니다.
  3. NGS용 gDNA를 준비합니다.
    참고: Illumina adapter sequence로 gRNA를 증폭하는 이 CRISPR 라이브러리의 NGS primers는 이전 간행물27에서 고안되었습니다. 각 샘플에 대해 다른 리버스 프라이머를 사용하면 각 샘플에 바코드를 부착하고 염기서열분석 중에 샘플을 풀링할 수 있습니다.
    1. 다음 반응 혼합물(총 부피 = 50 μL)로 PCR용 샘플을 준비합니다: 고충실도 PCR 마스터 믹스, 2x: 25 μL; 풀링된 주형 DNA, 0.5 μg: 1 μL; NGS 라이브러리 포워드 프라이머, 10 μM: 1.25 μL; NGS 라이브러리 리버스 프라이머, 10 μM: 1.25 μL; DNase가 없는 물: 21.5 μL.
    2. 다음 사이클링 조건으로 PCR을 수행합니다: 주기 1: 98°C에서 3분 동안 변성; 주기 2-23: 10 초 동안 98 °C를 변성시키고, 10 초 동안 63 °C에 어닐링하고, 25 초 동안 72 °C에 늘입니다; 사이클 24: 72°C에서 2분 동안 연장합니다.
    3. 각 샘플에 대한 PCR 반응을 풀링하고 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트로 PCR 산물을 정제합니다.
    4. 2%(w/v) 아가로스 겔에서 각 샘플에 대해 3μg의 PCR 산물을 실행합니다.
    5. 제조업체의 지침에 따라 겔 추출 키트를 사용하여 겔에서 DNA를 추출하여 겔에서 PCR 산물(~260-270 bp)을 제거합니다. 추출된 샘플은 -20°C에서 보관하십시오.
    6. 샘플로 차세대 염기서열분석(NGS)을 수행합니다. 라이브러리에서 gRNA당 500회 이상의 판독을 목표로 합니다.

9. 염기서열분석 결과 분석

  1. NGS를 분석하려면 MAGeCK-VISPR 플랫폼28을 사용하십시오. 최대우도 추정(MAGeCK-MLE) 알고리즘에 대한 표준 설정을 사용합니다. 분석을 위해 출력 파일을 준비하려면 다음을 수행합니다.
    1. FASTQC를 실행하여 시퀀스 파일 품질31을 평가합니다.
    2. 각 샘플에 대한 paired-end 염기서열분석 파일을 bbmerge32로 병합합니다.
    3. MAGeCK-MLE 알고리즘을 사용하여 MAGeCK-VISPR 플랫폼의 시료를 분석합니다. MAGeCK-MLE 분석을 위해 모든 gRNA 수를 1,000개의 비표적 gRNA 목록으로 정규화합니다.
    4. GC 콘텐츠, 기본 품질, 염기서열분석 판독 및 매핑된 판독을 평가하여 시퀀싱 파일 품질을 평가합니다.
    5. 지니 지수(Gini index), 주성분 분석(Principal Component Analysis, PCA) 클러스터링 및 음성으로 선택된 유전자 목록과 관련된 경로의 변화를 평가하여 CRISPR 스크리닝의 선택적 압력 단계의 성공 여부를 평가합니다32.
    6. 문헌 검색을 수행하고 경로 분석을 수행하여 상위 히트를 조사합니다.

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결과

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편향되지 않은 방식으로 CART 세포 활성을 개선하기 위해 편집할 수 있는 유전자와 경로를 조사하기 위해 체외 게놈 차원의 CRISPR 녹아웃 스크린을 설계했습니다(그림 1). 이 스크린은 CART 셀 생산 단계와 선택적 압력 단계의 두 단계로 구성됩니다. CART 세포 생산 단계에서는 먼저 110 × 106 T 세포를 건강한 공여자 PBMC에서 분리하고 CD3+/CD28+ 비드로 활성화합니다. 다음 날인 1일차에 MOI 3.0으로 CAR 렌티바이러스를 첨가하여 CD19 항원(CART19 세포)을 표적으로 하는 CART 세포를 생성합니다. 2일차에는 CRISPR 라이브러리 렌티바이러스가 0.3의 MOI로 CART 세포에 추가됩니다. 3-8일차

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토론

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유전자 편집은 치료제에 대한 내성 메커니즘을 이해하는 것뿐만 아니라 CART 세포의 수명과 활성을 개선하기 위한 새로운 CART 세포 치료법을 설계하는 데 강력한 도구가 되었습니다 16,17,26. 일부 유전자 편집 전략은 전임상 모델과 임상 시험 모두에서 CART 세포 활성을 개선한 것으로 나타났지만, 유전자 편집 전략을 최적화하기 위해서는 여전히 해야 할 일이 있습니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 연구자들은 CART 세포15,16에서 표적 CRISPR 스크리닝을 완료하기 시작했습니다. 그러나 이 접근 방식은 이전에 발표된 전략을 기반으로 하는 편향을 도입합니다. 여기에서는 CART 세포에서

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK는 Novartis(Mayo Clinic, University of Pennsylvania 및 Novartis 간의 계약을 통해), Humanigen(Mayo Clinic을 통해), Mettaforge(Mayo Clinic을 통해), MustangBio(Mayo Clinic을 통해) 및 Chymal therapeutics(Mayo Clinic을 통해)에 라이선스를 부여한 CAR 면역 요법 분야의 특허를 발명한 발명자입니다. CS, CMR 및 SSK는 Immix Biopharma에 라이선스가 부여된 특허의 발명자입니다. SSK는 Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc. 및 Lentigen으로부터 연구 자금을 지원받습니다. SSK는 Kite/Gilead, Calibr, Luminary Therapeutics, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio 및 Novartis와의 자문 회의에 참여했습니다. SSK는 Humanigen 및 Carisma의 데이터 안전 및 모니터링 위원회에서 활동했습니다. SSK는 토크(Torque), 캘리브르(Calibr), 노바티스(Novartis), 캡스턴 바이오(Capstan Bio), BMS, 카리스마(Carisma), 휴머니젠(Humanigen)의 컨설턴트를 해고했다. CMS와 SSK는 이 프로토콜로 인해 탄생한 지적 재산의 발명가입니다.

감사의 글

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이 연구는 Mayo Clinic Center for Individualized Medicine(SSK), Mayo Clinic Comprehensive Cancer Center(SSK), Mayo Clinic Center for Regenerative Biotherapeutics(SSK), National Institutes of Health K12CA090628(SSK) 및 R37CA266344-01(SSK), Department of Defense grant CA201127(SSK), Predolin Foundation(SSK) 및 Minnesota Partnership for Biotechnology and Medical Genomics(SSK)의 일부 지원을 받았습니다. CMS는 Mayo Clinic 의생명과학대학원의 지원을 받습니다. CRISPR 스크린 회로도(그림 1)는 BioRender.com(Siegler, L. (2022) https://BioRender.com/k71r054)로 생성되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
293T 세포ATCCCRL-3216렌티바이러스 생산에 사용되는 세포
비오틴 단백질L 항체GenScriptM00097CAR 검출용 항-카파 사슬 항체
소 혈청 알부민밀리포어 시그마A7906
카베니실린 이나트륨 염밀리포어 시그마C1389-1G카르베니실린 항생제
CD4 분리 구슬Miltenyi Biotec130-045-101 
CD8 분리 비즈Miltenyi Biotec130-045-201
CTS(세포 치료 시스템) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoflexBeckman CoulterNC2279958
DNase-Free WaterInvitrogenAM9937
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)Corning10-017-CV
Dulbecco의 인산염 완충 식염수Gibco14190-144
EasySep 인간 T 세포 분리 키트STEMCELL Technologies17951RF음성 분리 키트
Endura Electrocompetent Cells Biosearch Technologies60242-1회수 배지가 있는 전기 적격 세포
에탄올밀리포어 시그마E7023
소 태아 혈청(FBS)Corning35-010-CV
GeCKO v2 CRISPR 녹아웃 풀링 라이브러리 AAddGene1000000048CRISPR 라이브러리 플라스미드
유전자 펄서 II Bio-Rad165-2105전기천공기
글리코겐밀리포어 시그마10901393001
JeKo-1ATCCCRL-3006CD19+ 표적 세포 
Lipofectamine 3000 형질감염 시약ThermoFisher ScientificL3000075질감염 시약(Lipofectamine 3000 시약)과 중성 보조 지질 시약(p3000)이 포함된 형질감염 시약 키트
LIVE/DEAD AquaInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies7851밀도 구배 배지
Machery-Nagel NucleoBond Xtra Maxi 키트ThermoFisher Scientific 12748412Maxi-prep 키트
NEBNext High-Fidelity 2X PCR MasterMixNew England BioLabsM0541SHigh Fidelity PCR mastermix
Opti-MEM I 환원 혈청 배지Gibco31985-070환원 혈청 배지
pCMVR8.74AddGene22036렌티바이러스 포장 플라스미드
Pennicillin-streptomycin-glutamine (100X)Life Technologies10378-016
pMD2.GAddGene12259VSV-G 표피 발현 플라스미
링된 인간 AB 혈청 혁신적인 연구ISERABHI
PuromycinMillipore SigmaP8833
QIAquick 겔 추출 키트Qiagen28704Gek 추출 키트
Qucik-DNA Midiprep Plus 키트gDNA 분리에 사용되는Zymo ResearchD4075
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000자동 세포 분리기
Roswell Park Memorial Institute 1640 배지 (RPMI)Gibco21870092
SepMate-50STEMCELL Technologies85450밀도 구배 분리 튜브
아세테이트 나트륨InvitrogenAM9740
아지드 나트륨Fisher Scientific71448-16
스트렙타비딘 항체 (PE)BioLegend4052032차 항체 CAR 감지에 사용
T100 열 순환기Bio-Rad1861096
초원심분리기(Optima XPN-80)BeckmanCoulterA99839
진공 필터 시스템, 0.22 및 마이크로; mThermoFisher Scientific567-0020
진공 필터 시스템, 0.45 및 마이크로; mThermoFisher Scientific165-0045
X-VIVO 15 무혈청 조혈 세포 배지Lonza04-418Q조혈 세포 배지
형드 풀 키트

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