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방법 논문

유세포 분석법으로 퓨로마이신 혼입을 측정하기 위해 화학을 사용하여 림프 세포의 대사를 연구하는 방법

978 조회수

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DOI:

10.3791/67377

⸱

2025년 8월 15일

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 2Department of Pediatrics, Kyoto University Graduate School of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 세포의 에너지 대사를 연구하기 위해 화학을 사용하는 유세포 분석 기반 방법을 보여줍니다.

초록

항원 자극 시 나이브 T 세포는 급속한 증식을 거치고 이펙터 T 세포로 확장됩니다. 대사는 이러한 빠르게 증식하는 세포에 필요한 바이오매스 생성과 감염이나 암에서 적응 면역 반응의 결과에 영향을 미치는 이펙터 T 세포 분화 및 기능에 필요한 분자 생성에 중요한 역할을 합니다. 나이브 T 세포는 항원 자극 시 신진대사를 재프로그래밍하여 성장, 생합성 및 이펙터 기능을 지원하는 데 필요한 ATP 생성을 증가시킵니다. ATP는 미토콘드리아 산화 인산화(OXPHOS) 경로 또는 해당작용 경로에 의해 세포에서 생성될 수 있습니다. 분열하고 성장하는 세포에서 생성된 대부분의 ATP는 단백질 합성에 사용되기 때문에 단백질 합성은 ATP 수준의 대용물로 사용되었습니다. 단백질 합성은 변형된 티로신으로 충전된 tRNA의 3' 아데노신을 모방하고 단백질 번역의 자발적인 종료를 유도하는 퓨로마이신의 통합에 의해 측정될 수 있습니다. 해당작용 경로를 차단하는 2-데옥시글루코스(2DG)와 전자전달쇄(ETC)의 복합체 5를 차단하는 올리고마이신(O)과 같은 대사 억제제는 SCENITH라는 방법에서 단백질 합성 평가와 함께 이 두 경로에 대한 세포 ATP 생성의 의존성을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 화학을 사용하여 유세포 분석법으로 퓨로마이신 혼입을 검출하는 이 방법의 변형을 설명합니다. 대사를 연구하는 이 방법은 비교적 쉽고 유세포 분석을 통해 희귀 세포 집단과 환자 샘플을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서론

최근 몇 년 동안 T 세포 조절에서 신진대사의 중요한 역할에 대한 인식이 높아지고 있습니다. 세포 대사는 병원체 특이적 T 세포의 클론 확장 및 병원체를 죽이는 데 필요한 염증성 사이토카인 및 세포용해성 그란자임을 포함한 다양한 이펙터 분자를 합성하는 이펙터 세포 하위 집합으로의 분화를 포함하여 림프구의 많은 중요한 기능을 조절합니다1. 따라서 T 세포 대사에 대한 연구는 정상적인 T 세포 기능을 평가하고 잠재적인 치료법 개발에 중요합니다.

나이브 T 세포는 대사적으로 정지하며 에너지 요구를 위해 이화 대사 및 산화적 인산화(OXPHOS)에 의존합니다 1,2. T 세포 수용체(TCR) 활성화 시 T 세포는 부분적으로 세포 표면의 영양 수송체의 상향 조절에 의해 유도되는 빠른 대사 재프로그래밍을 거치며, 이는 환경에서 포도당과 글루타민을 포함한 여러 아미노산의 흡수를 증가시킵니다. 그런 다음 이러한 영양 구성 요소는 단백 동화 경로에서 세포 성장에 기여하고 세포 성장 및 분열 증가와 관련된 증가된 에너지 요구를 지원하는 거대분자를 만드는 데 사용됩니다 1,2,3. 활성화된 T 세포의 대사 재프로그래밍은 세포가 에너지 요구량을 위해 호기성 해당작용 및 글루타미노분해에 더 의존하게 만듭니다 1,2,3. TCR 자극 시 영양소 흡수는 다운스트림 분자 경로를 활성화하는 데 중요한 역할을 합니다3. 예를 들어, 아미노산의 흡수와 국소 아미노산 농도 증가는 mTORC1 신호 전달을 활성화합니다4. 반대로, 세포내 아미노산의 가용성을 감소시키면 mTORC1 신호 전달 경로 2,3,5,6,7이 감소합니다. 따라서 이펙터 T 세포에서는 신진대사와 세포 기능이 밀접하게 연결되어 있습니다.

빠르게 분열하는 T 세포에 필요한 바이오매스의 큰 증가는 단백질 합성/번역의 상향 조절을 필요로 합니다8. 단백질 합성은 리보솜 9 번역에서 길어지는 폴리펩티드 사슬을 통합, 표시 및 방출하여 번역을 차단하는 티로실-tRNA 모방체인 퓨로마이신9의 통합을 연구함으로써 세포에서 정량화할 수있습니다. 단백질 번역은 고에너지 의존 과정입니다. 실제로, 분열, 성장하는 세포에서 생성되는 대부분의 ATP는 단백질 합성에 사용됩니다. 따라서 단백질 합성은 세포 ATP10에 대한 대리 측정으로 사용되었습니다. ATP를 생성하기 위해 세포는 일반적으로 해당작용 및/또는 미토콘드리아 OXPHOS 경로에 의존합니다11. 해당작용은 포도당 분자당 2개의 ATP 분자를 생성합니다. OXPHOS 경로는 포도당 36개의 ATP를 생성하지만12,13 해당작용은 ATP를 더 빠르게 생성할 수 있습니다14. 따라서 암세포와 같이 빠르게 분열하는 활성화 T 세포는 ATP 생성을 위한 해당작용 경로에 크게 의존합니다.

각 대사 경로에 대한 세포의 의존성은 특정 억제제를 사용하여 연구할 수 있습니다. 포도당 유사체인 해당작용 경로 억제제 2-데옥시글루코스(2-DG)는 해당작용 효소 헥소키나아제15에 대한 경쟁적 억제제로 작용합니다. 2-DG는 헥소키나아제에 의해 2DG-인산염(2DG-P)으로 인산화됩니다. 2DG-P는 일반적으로 포도당-6-인산염(G-6-P)을 과당-6-인산염으로 전환하는 포스포헥소스효소에 의해 더 이상 대사될 수 없습니다16. 따라서 2DG-P는 세포에 갇혀 축적되어 해당작용을 억제하고 세포 ATP를 고갈시켜 단백질 합성을 차단합니다17. 유사한 방식으로, 미토콘드리아 OXPHOS 경로에 대한 세포의 의존성은 전자 전달 사슬(ETC)18의 ATP 합성효소의 양성자 채널에 결합하여 미토콘드리아 ATP 합성을 차단하는 올리고마이신을 사용하여 연구할 수 있습니다(그림 1). 단백질 합성의 평가와 함께 이러한 억제제를 사용하면 세포의 대사 상태에 대한 그림을 제공할 수 있으며, 유세포 분석법을 사용하여 퓨로마이신 혼입을 평가하는 SCENITH로 알려진 강력한 단일 세포 방법에 사용되어 왔다10. 그러나 SCENITH 시약의 가용성은 제한적일 수 있습니다. 해당작용 및 OXPHOS를 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 다른 기술로는 더 많은 세포 수가 필요하며 실험적으로 실현 가능하지 않을 수 있는 Seahorse 세포외 플럭스 분석이 있습니다. 이 기사에서는 시중에서 판매되는 Click-it 화학 시약을 사용하여 퓨로마이신 혼입을 평가하는 대체 방법에 대해 설명합니다. 이 방법의 용이성 덕분에 희귀 세포 집단 및 환자 샘플을 포함한 림프구의 대사 상태를 신속하게 평가할 수 있습니다.

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프로토콜

축산 및 실험은 국립 인간 게놈 연구소의 동물 사용 및 관리 위원회(NIH)에서 승인한 프로토콜 G98-3과 국립 알레르기 및 전염병 연구소 동물 관리 및 사용 위원회(NIH)에서 승인한 프로토콜 LISB 22E에 따라 수행되었습니다. 특정 병원체 없는(SPF) 조건에서 사육 및 사육된 6-12주 수컷 C57Bl/6J 마우스를 본 연구에 사용했습니다. 암컷 마우스에서도 유사한 결과를 얻었습니다. 인간 전혈은 NIH 임상 센터 IRB 승인 프로토콜 99-CC-0168 체외 연구용을 위한 건강한 기증자로부터 혈액 성분의 수집 및 분배에 따라 NIH 혈액 은행에서 채취되었습니다. 헬싱키 선언에 따라 모든 피험자로부터 서면 동의서를 얻었습니다.

1. 마우스 나이브 CD4+ T 세포 분리 및 배양

  1. 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 세포 분리 시스템을 사용하여 6주에서 12주 령령의 수컷 마우스로부터 마우스 비장 또는 림프절의 풀링된 단일 세포 현탁액에서 음성 선택에 의해 나이브 CD4+ T 세포를 정제합니다.
  2. L-알라닐-L-글루타민 디펩티드를 함유하고 10% 소태아 혈청, 2mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 U/mL 스트렙토마이신 및 0.05 mM 2-β-메르캅토에탄올을 보충한 IMDM 배지에서 세포(아래에 설명된 대로)를 배양합니다.
  3. 미토마이신-C 처리된 T-고갈된 비장세포(아래에 설명됨)와 1:8의 비율로 미토마이신-C 처리된 T-고갈된 비장세포(아래에 설명됨)를 비분극(1μg/mL의 항-CD3[클론 2C11] 및 3μg/mL의 항-CD28[클론 37.51]) 및 Th0 조건(1μg/mL의 항-CD3, 3μg/mL의 항-CD28, 각각 10μg/mL의 항-IFNg[클론 XMG1.2]), 항-IL-12[클론 C17.8] 및 항-IL-4[클론 11B11])를 37°C에서 72시간 동안 투여합니다. 48웰 플레이트의 웰당 1 x 106 APC 및 0.13 x 106 나이브 CD4 T 세포를 사용하여 배양 설정(재료 표)
  4. APC로서 미토마이신-C-처리된 T-고갈 비장세포의 생성: 간단히 말해서, 마우스 비장의 단일 세포 현탁액을 FITC-접합 CD4 및 CD8 항체로 염색합니다. 그런 다음 Anti-FITC 마이크로비드로 세포를 자기적으로 라벨링합니다( 재료 표 참조). 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 자기 세포 분리 시스템을 사용하여 T 세포에서 APC를 음으로 선택합니다. 다음으로, APC를 50μg/mL 미토마이신 C로 37°C 인큐베이터에서 40분 동안 처리한 후 1x PBS로 3회 세척합니다.

2. 인간 PBMC 분리 및 배양

  1. 림프구 분리 배지를 사용하고 제조업체의 프로토콜에 따라 전혈에서 PBMC를 분리합니다( 재료 표 참조).
  2. 2 mM L-글루타민, 0.01 M HEPES, 1 mM 피루브산나트륨, 1% 비필수 아미노산, 100 U/mL 페니실린 및 스트렙토마이신, 0.05 mM 2-β-메르캅토에탄올 및 5% 인간 혈청이 보충된 RPMI 배지에서 PBMC를 배양합니다.
  3. 37°C에서 18-24시간 동안 5μg/mL의 Phytohemagglutinin-L(PHA-L)으로 U-바닥 96웰 플레이트의 웰당 1 x 106 PBMC를 배양합니다.

3. 대사 분석

참고: 모든 세포, 억제제[올리고마이신(O), 2-데옥시글루코스(2-DG), DMSO(Co)] 및 O-프로파길-퓨로마이신(OPP) 시약을 가능한 한 37°C에 가깝게 유지하는 것이 중요합니다. 세포, 억제제 및 OPP 시약을 U-바닥이 있는 96 플레이트에 분취하고 플레이트를 가능한 한 37°C 인큐베이터에 둡니다. 여러 번의 동결-해동을 피하기 위해 억제제 2-DG 및 O를 더 작은 부피로 분취합니다.

  1. 2-DG의 2M(20x) 원액과 O의 40μM(40x) 원액을 만듭니다. OPP의 경우 1μL의 OPP를 49μL의 배지에 희석하여 농도가 400μM가 되도록 합니다.
  2. 실험을 시작하기 전에 OPP 단백질 합성 키트( 재료 표 참조)의 다른 모든 구성 요소가 실온(RT)에 있는지 확인하십시오.
  3. 성분 C 병의 분취량을 탈이온수로 1:10으로 희석하여 1x OPP 반응 완충액을 준비합니다. 사용 후 남은 1x 용액을 2-8°C에 보관하십시오.
  4. 100μL의 완전한 IMDM(마우스 CD4 T 세포의 경우) 또는 완전한 RPMI(인간 PBMC의 경우) 또는 선택한 완전한 배지에 각 조건(Co/DG/O/DGO)에 대한 둥근 바닥 96웰 플레이트의 웰당 0.1-2 x 106 개의 세포를 시종합니다. 플레이트를 가능한 한 인큐베이터에 보관하십시오.
  5. 원액(20x DG, Co 5μL)에서 억제제 1개(40x O 2.5μL)를 첨가하고 37°C, 5% CO2에서 15분 동안 배양합니다. 세포에 대한 최종 농도는 100mM DG 및 1μM O입니다. 피펫으로 억제제를 세포와 조심스럽게 혼합합니다. 편의를 위해 96웰 플레이트에 억제제를 분취하고 억제제에 세포를 추가하고 위아래로 몇 번 피펫팅하여 잘 혼합합니다.
  6. DGO 샘플에 DG 1배(5μL)를 첨가하고 피펫으로 조심스럽게 혼합한 다음 37°C, 5% CO2에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 1x O(2.5μL)를 첨가하고 피펫을 몇 번 피펫팅한 다음 37°C, 5% CO2에서 5분 동안 배양합니다.
  7. 억제제를 씻어내지 않고 20x(400μM) 원액에서 5μL의 OPP를 각 샘플에 첨가하여 세포 내 농도가 20μM가 되도록 하고, 위아래로 여러 번 피펫팅하고, 37°C, 5% CO2에서 30분 동안 배양합니다. 쉽게 OPP를 96웰 플레이트에 분취하고 억제제가 있는 세포를 OPP 시약에 추가한 다음 잘 혼합합니다.
    참고: 대사 활성이 낮은 세포 및 생체 외에서 직접 분리된 세포의 경우 OPP 첨가 후 배양 시간을 늘립니다. OPP를 사용한 배양 시간은 각 세포 유형에 대해 표준화되어야 합니다.
  8. OPP와 함께 배양한 후, 100-150μL의 얼음처럼 차가운 FACS 완충액(1x PBS에 2% FBS 및 1mM EDTA)을 첨가합니다. 4°C에서 2분 동안 750 x g 에서 원심분리합니다. 상청액을 버리고 세척 단계를 반복합니다.
  9. 적절한 표면 마커, 항마우스 CD4 항체(1/200 희석으로 사용) 또는 항인간 CD4 항체(1/50 희석로 사용), Live/Dead 시약(1/600 희석으로 사용), Fc 블록(1/200 희석으로 사용)이 있는 상태에서 세포를 염색합니다. 어두운 곳에서 4°C에서 25-30분 동안 배양합니다.
  10. 플레이트를 150-200μL의 FACS 완충액으로 세척하고 4°C에서 2분 동안 750 x g 으로 원심분리합니다. 플레이트를 부드럽게 튕겨 상청액을 버린 다음 세척 단계를 반복합니다. 이 단계에서 세포는 표면에 염색됩니다.
  11. PBS의 1% PFA에 세포를 재현탁하고 잘 혼합한 다음 4°C에서 10-15분 동안 배양합니다. 빛으로부터 보호하십시오.
  12. FACS 완충액으로 세척하고 4°C에서 2분 동안 750 x g 으로 원심분리한 후 세척을 반복합니다.
  13. 200μL의 차가운 1x 사포닌 투과화 완충액(1x PBS에서 0.1%(wt/vol) 사포닌 + 3% FBS)에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 5-15분 동안 빛으로부터 보호된 RT에서 배양합니다. 이때 세포는 고정되고 투과화됩니다.
  14. 10x 용액을 탈이온수에 1:10으로 희석하여 1x OPP 반응 완충액 첨가제(성분 E)를 준비합니다. 이 용액을 신선하게 준비하여 당일 사용하십시오.
  15. 표 1에 따라 OPP 반응 칵테일을 준비합니다. 준비 후 15분 이내에 반응 칵테일을 사용하십시오.
  16. 3.13단계의 샘플을 750 x g 에서 2분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 200μL의 1x 사포닌 투과화 완충액으로 세포를 2회 세척합니다. 상청액을 돌려 버립니다.
  17. 50-100μL의 OPP 반응 칵테일(3.12단계에서 준비됨)을 각 웰에 넣고 잘 혼합합니다. 빛으로부터 보호한 RT에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트를 750 x g 또는 4°C에서 2분 동안 회전시킵니다. 상청액을 버리십시오.
  18. 펠릿을 200μL의 1x 사포닌 투과화 완충액에 재현탁하고 샘플을 750 x g 에서 4°C에서 2분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
  19. 웰당 50μL의 반응 헹굼 완충액(성분 F)에 재현탁하고 4°C에서 2분 동안 750 x g 로 원심분리합니다. 염색된 세포를 200μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다.
  20. 당일 유세포 분석법( 보충 그림 1 참조)으로 샘플을 분석하거나 세포를 4°C의 어두운 곳에 보관하고 다음날 분석합니다.

4. 대사 분석

  1. 다음 조건에서 단백질 합성을 위한 대용물로서 퓨로마이신(OPP)의 통합을 측정합니다: 1) 대조군 조건(Co); 2) 해당작용 경로가 2-DG에 의해 차단되는 세포에서; 3) 미토콘드리아 OXPHOS 경로가 O에 의해 차단되는 세포에서; 4) OPP의 평균 형광 강도(MFI)를 평가하여 해당작용 및 미토콘드리아 경로가 모두 억제제(DGO)에 의해 차단되는 세포에서(그림 2).
  2. 각 조건에서 OPP의 MFI를 확인하여 특정 경로에 대한 세포의 의존성을 분석합니다. 단백질 합성의 척도로 MFI를 직접 평가합니다. 포도당 의존성, 해당작용 능력, 지방산 산화(FAO) 및 아미노산 산화(AAO) 능력, 미토콘드리아 의존성을10에 따라 계산합니다.

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결과

나이브 CD4+ T 세포를 마우스의 비장 및 림프절에서 분리하고 72시간 동안 Th0 또는 비분극(NP) 계통으로 분화시켰습니다. 배양 0시간, 48시간 및 72시간 후에 세포를 수확하고, OPP의 MFI를 관찰하여 OPP 혼입을 측정하였다. 나이브 CD4+ T 세포는 OPP의 MFI에서 볼 수 있듯이 활성화된 T 세포보다 합성이 적었다(그림 3). 나이브 세포는 해당작용에 부분적으로 의존했지만 MFI 및 OPP 통합의 배수 변화에 의해 평가된 OXPHOS 경로에 더 의존했습니다. 대조군(Co)을 100%로 설정하면 해당작용을 차단하면 단백질 합성이 대조군의 60%로 낮아집니다. OXPHOS 경로를 차단하면 45%로 더 낮아집니다.

활성화 시 CD4+ T 세포는 증가된 MFI(그림 3)에서 알 수 있듯이 단백질 합성...

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토론

이 논문은 SCENITH 기술을 기반으로 하지만 통합된 퓨로마이신의 화학적 표지를 사용하여 유세포 분석을 통해 림프 세포의 대사를 연구하는 방법을 제공합니다. 우리는 림프구에 초점을 맞추었지만 이 프로토콜은 모든 세포 유형의 대사를 연구하도록 조정할 수 있습니다. 이 방법은 또한 Seahorse와 같은 다른 기술에는 더 많은 수의 세포가 필요한 희귀한 세포 집단 및 환자 샘플에서 대사를 연구하는 데 유리합니다.

프로토콜의 중요한 단계는 달리 지정되지 않는 한 세포, 억제제 및 사용된 모든 시약이 실온에 있는지 확인하는 것입니다. 냉장고에 너무 오래 방치된 세포는 세포가 생리학적 온도에 도달할 때까지 37°C에서 배양해야 합니다. 이상적으로는 세포, 억제제 및 기타 시약을 실제 실험을 시작하기 전에 인큐베이터에 잠시 동안 방치해야 합니다.

이 방법은 OPP 염색과 함께 세...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

PBMC 샘플과 귀중한 실험 제안을 제공해 주신 Qin Xu 박사와 Avik Dutta 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH의 NIAID 교내 연구 부서에서 부분적으로 지원했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-메르캅토에탄올Thermo Fisher21985-023
Alexa Fluor 488 항-Puromycin 항체Biolegend381506사용 희석액: 1/100
Alexa Fluor 647 항-인간 CD4 항체Biolegend357422사용 희석액:  1/50
BD Horizon BUV737 쥐 항마우스 CD4BD Biosciences612761희석 사용:  1/200
Click-iT Plus OPP Alexa Fluor 488 단백질 합성 분석 키트Thermo FisherC10456
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
인간 혈청Millipore SigmaH4522
IMDM, GlutaMAX 보충제, 500 mlThermo Fisher31980030
InVivoMAb 항 마우스 CD28, 클론:  37.51BioXcellBE0015-1
InVivoMAb 항마우스 CD3&엡실론;, 클론:  145-2C11BioXcellBE0001-1
InVivoMAb 항마우스 IFN&감마;, 클론:  XMG1.2BioXcellBE0055
InVivoMAb 항마우스 IL-12 p40, 클론:  C17.8BioXcellBE0051
InVivoMAb 항마우스 IL-4, 클론:  11B11BioXcellBE0045
L-글루타민(200mM)Thermo Fisher25030081
LIVE/DEAD 고정 가능한 아쿠아 데드 셀 염색 키트, 405nm 여기용Thermo FisherL34966사용 희석액:  1/600
LSM 림프구 분리 배지MP Biomedicals50494X
MEM 비필수 아미노산 용액(100X)Thermo Fisher11140050
Streptomyces caespitosusSigmaM0503-10X2MG
Naive CD4 분리 키트, 마우스Miltenyi Biotec130-104-453
파라포름알데히드 16% 수용액 EM 등급전자 현미경 Sciences15710
PBS (1X), pH 7.4, 500 mLQuality Biologics114-058-101
Penicillin-Streptomycin(10,000 U/mL). 100mLThermo Fisher15140122
Phytohemagglutinin-L(PHA-L)Millipore Sigma11249738001
프리미엄 등급 소 태아 혈청(FBS)Avantor97068-085
RPMI 1640 중간, 글루타민 없음Thermo Fisher21870076
사포닌Thermo FisherA18820.22
피루빈산나트륨(100mM)Thermo Fisher11360070

참고문헌

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  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324, 1029-1033 (2009).
  14. Pfeiffer, T., Schuster, S., Bonhoeffer, S. Cooperation and competition in the evolution of ATP-producing pathways. Science. 292, 504-507 (2001).
  15. Brown, J. Effects of 2-deoxyglucose on carbohydrate metabolism: review of the literature and studies in the rat. Metabolism. 11, 1098-1112 (1962).
  16. Weindruch, R., et al. Caloric restriction mimetics: metabolic interventions. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 56 Spec No1, 20-33 (2001).
  17. Gronostajski, R. M., Pardee, A. B., Goldberg, A. L. The ATP dependence of the degradation of short- and long-lived proteins in growing fibroblasts. J Biol Chem. 260, 3344-3349 (1985).
  18. Hearne, A., Chen, H., Monarchino, A., Wiseman, J. S. Oligomycin-induced proton uncoupling. Toxicol In Vitro. 67, 104907(2020).

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