Nicotiana benthamiana에서 Plasmodesmata에 대한 단백질 분류의 컨포칼 현미경 분석

요약

이 프로토콜은 바이러스-플라스모데스마타 상호 작용 또는 플라스모데스마 수송 중 플라스모데스마타를 표적으로 하는 단백질의 컨포칼 현미경 기반 분석을 위한 최적의 플라스모데스마 마커 선택에 대해 설명합니다.

초록

Plasmodesmata는 인접한 식물 세포의 세포질을 연결하고 영양분, 거대분자 및 침입 바이러스의 세포 간 이동을 가능하게 하는 막질 나노 기공입니다. Plasmodesmata는 세포 간 통신 조절에 근본적인 역할을 하여 식물 발달, 환경 반응 및 바이러스 병원체와의 상호 작용에 기여합니다. 식물 또는 바이러스 단백질의 plasmodesmal localization을 발견하는 것은 단백질에 대한 유용한 기능적 정보를 제공할 수 있으며 식물-바이러스 상호 작용의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이러한 연구를 용이하게 하기 위해 바이러스-플라스모데스마타 상호 작용 또는 플라스모데즘 수송을 연구하기 위한 최상의 플라스모데즘 마커를 선택하기 위해 다양한 플라스모데스 표적 단백질의 컨포칼 현미경 기반 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 구체적으로, 순무 정맥 청소 바이러스 (TVCV)의 세포 간 이동 단백질(MP), 애기장대 Plasmodesmata-Localized Protein 5(PDLP5) 및 Plasmodesmata Callose-Binding Protein 1(PDCB1)을 사용하여 이러한 이벤트의 분석을 설명합니다. 단백질 plasmodesmal localization 데이터는 샘플링된 조직의 아닐린 블루 염색을 사용하여 plasmodesmata의 전체 시각화와 병행하여 분석됩니다. 이러한 접근법은 planta의 세포 또는 병원체 단백질의 plasmodesmal localization을 분석하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

서론

Plasmodesmata (PD)는 세포 간 통신 조절을 통해 식물 발달, 환경 반응 및 바이러스 병원체와의 상호 작용을 제어하는 데 근본적인 역할을 합니다 ^1,2. PD는 초기에 사이토키네시스(cytokinesis) 중에 형성되며, 수백 개의 PD가 두 딸 세포 사이의 새로운 세포에 삽입되어 세포 간 통신을 위한 채널을 공급합니다 ^3,4. PD는 원형질막^(3,4)에 의해 늘어선 기공의 중앙 부분에 소포체(ER) 유래 막, 트랜스-PD 데스모튜불(trans-PD desmotubule)을 포함하는 막이 풍부한 구조입니다. 비교 단백질체학 접근법은 β-1,3-glucanases(BG), callose synthase(CALS), plasmodesmata-located proteins(PDLP), callose-binding proteins(PDCB), multiple C2 domains transmembrane region ....

프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 식물 성장

1. Nicotiana benthamiana 씨앗을 23 ° C의 통제 된 환경 챔버에서 16 시간의 빛과 8 시간의 어둠 아래에서 젖은 토양에서 성장시킵니다.
2. 약 2 주 후, 뿌리 주위의 이탄 알갱이가있는 묘목을 조심스럽게 더 큰 화분으로 옮기고 그로인 여과 실험을 위해 4-5 주 동안 동일한 조건에서 성장을 계속합니다.
   참고 : 꽃이 피기 시작할 때 식물을 사용하지 마십시오., GFP 축적은 꽃이 핌^{단계 18}에서 감소합니다.

2. 벡터 구성

1. PCR을 사용하여 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase로 관심 있는 코딩 염기서열을 증폭하고 상업적으로 이용 가능한 BP Clonase kit를 사용하여 BP 반응¹⁹ 에 의해 entry vector pDONR207로 클로닝합니다....

결과

식물 생리학에서 PD 기능 및 병원체와의 상호 작용에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 PD 국소화를 위해 간단하고 신뢰할 수 있는 세 가지 참조 단백질이 개발되었습니다. 2개의 세포 PD 단백질과 식물 토바모바이러스 TVCV에 의해 암호화된 병원체 유래 MP 단백질을 선택하였다. 이러한 단백질의 세포 내 국소화는 각 단백질의 C-말단에 융합된 자가형광 리포터 EGFP를 사용하여 시각화되었습니다. 다른 접근법으로, PD 관련 칼로스 침전물의 아닐린 블루 염색을 사용하여 PD를 시각화했습니다. 실험은 PDLP5와 MP 모두 반점 PD 국소화를 나타냈으며, MP도 세포핵에서 국소화되어 있음을 보여주었습니다(그림 1A), 앞서 언급한^{바와 같이 25}. 대조적으로, PDCB1은 PD와 ER 사이에서 분할되는 것처럼 보였다(그림 1A). GFP 태그 단백질의 세포 내 국소화를 해석한 경험이 적.......

토론

정상적인 식물 발달 및 형태 형성 중 및 식물-병원체 상호 작용 중 식물 세포 간 통신 및 세포 간 수송에 대한 모든 세포 생물학적 연구는 내인성 및 병원체로 암호화된 단백질과 식물 세포 간 연결, 즉 플라스모데스마타(PD)의 분류를 검출하고 모니터링해야 합니다. 이러한 실험은 내인성 또는 병원체 유래 여부에 관계없이 PD에 충실하고 일관되게 국한되어 이러한 구조를 장식하고 시각화하는 참조 단백질을 사용함으로써 실질적으로 촉진될 것입니다. 이러한 필요성은 여기에서 세 가지 알려진 PD 국소화 단백질, 즉 애기장대(Arabidopsis) PDLP5 및 PDCB1, 그리고 토바모바이러스 병원체 TVCV의 MP를 선택하여 해결됩니다. 이 단백질은 자가형광 리포터 EGFP로 C-말단에 태그를 지정했으며, 생성된 융합 단백질이 PD로 분류하는 능력은 Nicotiana benthamiana 의 잎에서 일시적인 발현과 발현 조직의 컨포칼 현미경 분석에 따라 결정되었.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ABT AC 1상 모터	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
오염 제어	CCI
Gateway BP Clonase II 효소 혼합물	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II 효소 혼합물	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad 소프트웨어 Inc.
이미지: J	미국 국립보건원(National Institutes of Health) 및 광학 및 컴퓨터 계측 연구소(Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
레이저 스캐닝 컨포칼 현미경	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5, High-Fidelity DNA Polymerase	넵	#M0491S

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