방법 논문

Correlative Optical Spectroscopy 및 Mass Spectrometry Imaging methodology를 통해 연조직 절편에서의 약물 분포를 시각화합니다.

DOI:

10.3791/67383

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2025년 6월 20일

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1Chemical & Biological Sciences Department, National Physical Laboratory, 2Department of Life Sciences, University of Bath, 3Haleon CH SARL, 4School of Chemistry & Chemical Engineering, University of Surrey

이 논문에서

요약

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이 연구는 비선형 광학 분광법 및 질량 분광 이미징을 사용하여 연조직 내 약물의 상관 이미징 방법을 제시합니다. 고해상도 피부 이미징과 민감한 약물 검출을 결합하면 피부 내 약물 분포를 연구할 수 있는 유용한 접근 방식을 얻을 수 있으며, 이는 우수한 국소 제품 개발에 매우 중요합니다.

초록

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서브 마이크론 공간 해상도와 광학 분광법 및 질량 분광 이미징에 의한 민감한 약물 검출을 결합한 새로운 상관 이미징 방법론은 연조직 내 약물 적용 시 화학적 분포를 시각화하기 위해 개발되었습니다. 이 예시에서, 이 방법은 16시간 동안 상업용 비스테로이드성 항염증 약물을 시험관 내에서 국소 도포한 후 절제된 피부 조직에 대해 테스트되었습니다. 유도 라만 산란, 2차 고조파 생성, 이광자 형광 현미경을 포함한 비파괴 광학 분광법이 처음으로 사용되어 피부 구조와 형태를 매핑했습니다. 그 후, ToF-SIMS(Time-of-Flight 2차 이온 질량 분석법)를 통해 동일한 피부 조직 샘플을 분석했으며, 이를 통해 가장 바깥쪽 피부층(표피와 진피)에서 디클로페낙 검출에 대한 감도를 높일 수 있었습니다. 이미지 등록 방법은 광학 및 질량 분석 데이터를 통합하기 위해 고안되었습니다. 이 접근 방식은 조직 구조의 무표지 고해상도 시각화와 민감한 화학 물질 검출을 결합하며, 피부 및 잠재적으로 다른 연질 생물학적 조직에서 약물 분포를 조사하는 데 유용한 도구입니다.

서론

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국소 또는 전신 적용 후 연질 생물학적 조직 내에서 활성 제약 성분의 분포 속도, 범위 및 동인을 이해하는 것은 조직 특이적 약물 흡수, 대사 및 제거의 기저에 있는 메커니즘을 밝히는 데 중요합니다(즉, 약물 약동학에 대한 심층적인 이해). 여기에서는 비선형 광학 분광법과 질량 분광법 이미징을 통합하여 조직 구조와 동일한 조직 샘플 내에서 국소 약물 분포를 표지 없이 시각화하기 위한 새로운 상관 이미징 방법을 제시합니다1.

라만 분광법(RS)은 높은 공간 분해능과 분자 특이성으로 세포와 조직 내 약물 분포를 매핑하는 데 유용한 도구로 부상했습니다2. RS는 관심 샘플에 의한 빛의 비탄성 산란3에 의존하여 외부 표지 없이 내부 분자의 특징적인 진동 모드를 통해 상세한 화학적 특성을 규명할 수 있습니다. 그러나 고해상도 이미지를 생성하기 위한 획득 시간이 길면 민감한 생물학적 샘플의 무결성이 손상될 수 있습니다. 또한 더 깊은 조직층을 조사할 때 조직에 의한 빛의 산란 및 흡수는 라만 신호를 감쇠시켜 감도를 더욱 제한할 수 있습니다. SRS(Stimulated Raman Scattering) 현미경은 펄스 레이저 여기(pulsed laser excitation)와 유도된 라만 신호(stimulated Raman signal)의 검출을 활용하여 기존 RS에 비해 상당한 발전을 이뤘습니다4. SRS 현미경 검사는 높은 공간 해상도로 2D 및 3D의 신속한 이미지 획득을 가능하게 하며, SHG(Second Harmonic Generation) 및 TPEF(Two Photon Excited Fluorescence) 현미경과 함께 수행할 경우 결합 조직, 콜라겐 및 엘라스틴 1,5,6,7,8,9의 포괄적인 이미지를 제공할 수 있습니다.. SHG 현미경은 샘플의 비중심 대칭 구조와 빛의 상호 작용에 의존하는 비선형 광학 기술로, 입사광 파장의 절반에서 신호를 생성합니다. 생체 조직에서 콜라겐과 같은 정렬된 구조를 이미징하는 데 특히 유용합니다. TPEF는 두 개의 저에너지 광자가 동시에 형광단을 여기시켜 형광을 방출하는 또 다른 비선형 현미경 기술입니다. TPEF는 여기광이 근적외선 범위에 있기 때문에 광손상이 적은 심층 조직 이미징을 가능하게 하여 생물학적 샘플에 더 깊이 침투할 수 있습니다.

질량 분석 이미징(MSI)은 질량 분석법의 기능과 공간 정보를 결합하여 광범위한 분자10,11,12를 표지 없이 식별할 수 있는 강력한 분석 기술입니다. ToF-SIMS(Time-of-Flight 2차 이온 질량 분석법)는 고에너지 1차 이온으로 샘플 표면을 충격하여 표면에서 2차 이온을 방출하는 방식으로 작동합니다. 그런 다음 이러한 2차 이온은 비행 시간 분석기로 가속되어 질량 대 전하 비율이 결정됩니다. 이 분석을 통해 높은 감도와 분해능으로 분자 단편과 동위원소 변이를 식별할 수 있습니다. ToF-SIMS의 가치있는 응용은 세포13, 조직14, 15 및 장기15의 화학 물질 및 생체 분자 연구를위한 생물학 및 제약 연구에서 입증되었습니다.

SRS와 ToF-SIMS는 서로 다른 피부 모델의 약물 분포를 연구하기 위해 독립적으로 사용되었습니다. 그러나 이러한 기술을 조합하여 상호 상보성을 활용하는 것이 가장 중요합니다. 이 연구에서는 광학 현미경 (SRS, TPEF 및 SHG)을 ToF-SIMS와 결합하여 우수한 감도 (ToF-SIMS에서 제공)로 감지 된 약물 신호와 오버레이 된 서브 미크론 공간 해상도 (광학 방법으로 제공)로 피부 형태의 이미지를 얻는 워크 플로우를 설명합니다. 이 접근법은 상용 국소 제형(Voltaren gel)으로 처리된 절제된 피부 조직에서 디클로페낙의 분포를 시각화하는 어려운 예를 해결하는 데 사용되었습니다. 성공 기준에는 치료 농도에서 디클로페낙을 검출할 수 있는 높은 화학적 민감도와 피부 구조를 분해하기에 충분한 공간 해상도가 포함되었습니다. 테이프 스트리핑 후 정량화16 또는 개방 흐름 미세관류17와 같은 힘들고 기술적으로 까다로운 방법을 통해 국소 처리 후 다양한 피부층의 디클로페낙 함량을 정량화할 수 있지만, 이러한 접근법은 제품 개발 단계를 돕는 필수 요소인 개별 피부층의 부형제 의존성 디클로페낙 분할, 침투, 유지 및 깊이 분포를 규명할 수 없습니다.

아래에 설명된 측정 방법론에 앞서, Voltaren Forte 겔(2.32% 디클로페낙 디에틸암모늄 함유) 또는 해당 위약 겔(Haleon CH SARL에서 공급)을 다른 기간(4시간, 12시간, 16시간 또는 24시간) 동안 피부 표면에 도포했습니다. 잔류 제형을 제거한 후, 동일한 피부 샘플에 대해 SRS 및 ToF-SIMS 측정을 수행했습니다. 방법론에 대한 자세한 내용은 원고1에 설명되어 있습니다.

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프로토콜

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윤리적 선언문: 인간 피부 샘플은 영국 에든버러에 있는 CRL(Charles River Laboratories)에 의해 영국 글래스고에 소재한 Tissue Solutions Ltd에서 획득하였다. 모든 익명의 샘플은 수집 국가의 법적 및 윤리적 기준에 따라 수집되었으며, 기증자 또는 가장 가까운 친척의 윤리적 승인과 정보에 입각한 동의를 받았습니다.

1. 피부 단면화

피부 조직의 일부를 생성하기 위해 저온 유지 장치를 사용했습니다.

  1. 처리된 스킨 디스크를 -20°C 냉동고에서 꺼내 디스크 중앙에서 작은 조각(~1.0cm x 1.0cm)을 자릅니다.
  2. 샘플을 냉동 유지 장치의 척에 얼어붙은 물방울 위에 장착합니다. 최적 절단 온도(OCT) 화합물 또는 기타 매립 매체를 사용하지 마십시오.
  3. 블레이드와 샘플 온도를 각각 -20°C 및 -16°C로 설정합니다.
  4. 30μm 두께의 단면을 유리 커버슬립에 올려 놓습니다(#1.5, Fisher Scientific).
  5. SRS 및 ToF-SIMS를 즉시 수행하거나 대안적으로 샘플을 -80 ° C에서 보관하기 위해 진공 포장 할 수 있습니다.
  6. 사용하기 전에 20분 동안 건조시키십시오.

2. SRS 이미징

SRS, SHG 및 TPEF 현미경은 코히어런트 라만 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 두 개의 피코초 레이저 펄스가 1031.2nm 스톡스 빔에 의해 생성되었으며, 조정 가능한 펌프 빔과 공간적으로 및 시간적으로 중첩되었습니다. 20MHz로 변조된 스톡스 빔은 전송을 통해 자극된 라만 손실 신호의 감지를 용이하게 했습니다. 신호 감지를 위해 락인앰플리파이어(lock-in amplifier)와 결합된 실리콘 기반 검출기가 사용되었습니다. 또 다른 채널은 두 번째 고조파 및 방출 형광 신호를 수집하기 위해 사용되었으며, 감지를 위해 광전자 증배관을 사용했습니다.

  1. 다광자 조직 이미징에 적합한 대물렌즈 및 콘덴서 렌즈를 설치하며, 이 경우 짧은 작동 거리 공기 응축기 렌즈(0.9NA)와 함께 침수 40배 배율 렌즈(1.1NA)를 설치합니다.
  2. 장착된 조직 섹션을 SRS 현미경 샘플 스테이지에 배치하여 조직이 콘덴서 렌즈와 현미경 슬라이드의 동일한 면에 있도록 합니다. 대물 렌즈를 조직 부분에 초점을 맞춘 다음 콘덴서 높이를 최적화합니다.
  3. 레이저 출력을 적절한 값으로 설정하여 조직을 손상시키지 않고 우수한 신호 대 잡음비를 얻을 수 있습니다. 이 예에서는 펌프 빔에 약 10mW, 스톡스 빔에 약 30mW가 샘플에 적용되었습니다. SRS 측정에 대한 실질적인 고려 사항은 Tsikritsis 등을 참조하십시오4.
  4. 이미징 속도 400Hz와 CH2 스트레칭에 해당하는 2850cm-1에서 라인 평균 1로 X1 줌에서 290μm x 290μm에 해당하는 512 x 512 픽셀 해상도로 전체 섹션의 모자이크 이미지를 획득합니다.
  5. 전체 섹션의 모자이크 이미지 내에서 다음 사항을 고려하여 관심 영역(ROI)을 선택합니다: (i) Franz cell 장치에 클램핑된 투여되지 않은 피부가 있을 수 있는 샘플 둘레의 가장 바깥쪽 20%를 피하면서 중앙에 위치합니다. (ii) 동일한 광학 깊이 수준 내에서 검사할 수 있을 만큼 충분히 평평합니다. (iii) 샘플이 ToF-SIMS로 전송될 때 시각적 식별을 돕는 뚜렷한 구조적 특징을 가지고 있습니다.
  6. SRS 및 SHG/형광 검출기에 대한 연구 전반에 걸쳐 일관된 이득 설정을 적용하고 (i) C-H 스트레칭 영역(CH3, CH2 및 오프 공진 제어에 각각 해당하는 2945cm-1, 2850cm-1 및 2650cm-1에서)에서 이미지를 획득합니다. (ii) 지문 영역(1666 cm-1 및 1723 cm-1에서 각각 아미드 I 및 오프 공진 제어에 해당); (iii) 적용된 약물과 관련된 온(on) 및 오프 공명(off-resonance)에 해당하는 파수; 이 예에서 1586cm에서-1 및 1530cm-1은 각각 C=C 및 오프 공진에 해당합니다.

SRS 이미징 후 분석을 위해 샘플을 즉시 ToF-SIMS 설정으로 옮깁니다.

3. ToF-SIMS 이미징

Time-of-flight 2차 이온 질량 분석 이미징은 전류가 0.2pA인 30keV Bi3+ 1차 이온 빔을 사용하여 수행되었습니다.

  1. 적절한 획득 설정을 선택합니다. 이 예에서는 100ms 듀티 사이클 시간, m/z 0-900의 질량 범위 및 5μm의 빔 직경과 함께 음이온 극성이 사용되었습니다. 5μA에서 20eV 전자 플러드 건이 전하 보상에 사용되었습니다.
  2. 스테이지 매크로 래스터 모드로 전체 이미지를 획득하여 조직 치수에 따라 시야로 전체 조직 섹션을 매핑합니다(이 경우 2.5-3.0mm x 8.5-9.0mm 사용). 이 전체 이미지는 더 작은 이미지의 모자이크로 형성됩니다. 이 예에서 각각은 픽셀당 1개의 이온 빔 샷으로 0.5mm x 0.5mm(256 x 256픽셀)의 시야를 가졌으므로 8.18 x 108 ions/cm2의 이온 선량이 발생했습니다.
  3. 적절한 시야를 선택하여 ROI의 이미지를 캡처하는 동일한 방법을 사용합니다. 이 경우 1.0mm x 0.5mm였으며 프레임당 픽셀당 4발, 패치당 10프레임으로 이온 선량은 1.31 x 1011 ions/cm2에 해당합니다.
  4. 품질 관리를 위해 각 피부 절편을 검사하기 직전과 후에 조직 균질화 샘플을 분석하십시오. 0.5mm x 0.5mm(256 x 256픽셀)의 시야각을 사용하여 픽셀당 1발, 스캔당 1프레임으로 총 15회 스캔을 수행합니다. 이 설정은 3.27 x 1010 ion/cm2의 이온 선량 밀도에 해당합니다.
  5. 획득 후 생성된 질량 스펙트럼은 H−, C−, C2− 및 C3− 이온을 사용하여 보정할 수 있습니다.
  6. 데이터 수집 및 추출은 Surface Lab 7.1 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다.

4. MATLAB을 사용한 이미지 정합 및 데이터 분석

  1. SIMS 및 SRS 이미지를 각각 3차원으로 축소하여 음수가 아닌 행렬 분해를 사용하여 빨간색, 녹색 및 파란색 채널로 시각화합니다.
  2. Matlab 제어점 선택 툴 "cpselect"(Matlab, Mathworks, 2019b 및 Image Processing Toolbox)를 선택하여 이 두 비행렬 분해 이미지 간에 일치하는 특징을 선택합니다.
  3. "cp2tform" 및 "imtransform" 기능을 사용하여 SIMS 데이터를 고정 이미지로, 광학 분광학 데이터를 동영상 이미지로 사용하여 아핀 변환을 적용하여 정합을 수행합니다.
  4. 관심 약물에 대한 ToF-SIMS 데이터에서 여러 피크가 검출되는 경우 이러한 피크의 강도를 합산하여 결합된 약물 이온 강도를 생성합니다.
  5. 각 해당 피부 조직 샘플에 대해 두 개의 homogenate 데이터 세트(이전 및 이후)의 평균 총 이온 수를 추출합니다. 이 해당 값을 사용하여 각 피부 이미지에서 약물 이온의 ToF-SIMS 데이터의 강도를 정규화합니다.
  6. 등록 후 RGB 채널에 각 이미지를 할당하여 광학 분광법 및 SIMS 데이터의 오버레이를 만듭니다: 빨간색(CH2용 SRS 이미지), 녹색(콜라겐용 SHG 이미지) 및 파란색(m/z 214.04, 216.04, 250.02, 252.02, 294.01 및 296.01에서 다양한 이온의 신호 포함).

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결과

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그림 1은 특징 기반 이미지 정합 결과를 보여주며, 두 개의 피부 샘플(하나는 위약(그림 1a)로 처리되고 다른 하나는 4시간(그림 1b) 및 16시간(그림 1c) 동안 볼타렌 겔로 처리됨)에 대한 SRS, SHG 및 SIMS의 등록된 오버레이 이미지를 표시합니다. 이 이미지에서 합산 된 약물 강도 신호 (ToF-SIMS 측정에서)는 파란색의 지질이 풍부한 조직 구조, 특히 각질층 (SRS를 사용하여 2850cm-1에서 CH2 스트레칭 대비로 식별 됨)은 빨간색으로 표시되고 콜라겐이 풍부한 조직 영역 (SHG 신호로 식별 됨)은 녹색으로 표시됩니다. 관심 영역의 고해상도 이미지에 대한 일반적인 획득 시간은 SRS 및 SI...

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토론

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이 방법을 사용하면 비선형 광학 분광법 및 질량 분광 이미징을 통한 상관 이미징을 통해 서브미크론 공간 해상도와 높은 감도로 연조직의 약물 분포를 감지할 수 있습니다. 중요한 것은 형광 기반 현미경 검사에 필요한 잠재적으로 간섭할 수 있는 라벨을 사용하지 않고 이미징이 이루어진다는 것입니다. 워크플로우에 대한 추가 검증에는 피부 구조를 밝히기 위해 조직 단면을 기존의 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색과 관련된 것이 포함되었으며, 결과 SRS 및 SIMS 이미지를 등록할 수 있었습니다1. 피부 형태학은 광학 분광학 데이터에 클러스터링을 적용하여 쉽게 구별되었으며, H&E 염색을 사용한 기존의 조직학적 이미징보다 피부층을 더 명확하게 구별하는 이 비표적 접근 방식의 힘을 입증했습니다. 새로운 상관 방법론을 통해 Voltaren gel을 사용한 국소 치료 후 피부 디클로페낙 저장소의 존재를 입증하고 그 형성 및 성장의 역학을 처음...

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공개 사항

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MBB는 연구의 자금 지원 기관인 Haleon CH SARL의 직원입니다.

감사의 글

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이 연구는 Haleon CH SARL의 지원을 받았습니다. NAB와 RHG의 기부금은 미국 보건복지부(HHS)의 식품의약국(FDA)이 재정 지원금(1-U01-FD006533)을 통해 부분적으로 지원했습니다. 이 작업은 영국 국가 측정 시스템의 NMS/ID74 및 NMS/ST18 프로젝트를 통해 영국 비즈니스, 에너지 및 산업 전략부의 자금 지원을 받았습니다. 이 기사의 내용은 저자의 내용이며 반드시 FDA/HHS 또는 미국 정부의 공식 견해나 보증을 나타내는 것은 아닙니다. NAB는 분석 화학 신탁 기금(Analytical Chemistry Trust Fund)에서 자금을 지원하는 2020 CAMS 펠로우십 어워드(2020 CAMS Fellowship Award)를 위한 분석 측정 과학 커뮤니티(Community for Analytical Measurement Science)의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
코히어런트 라만 현미경 라이카 마이크로시스템즈https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-cars/
인간 피부 샘플 Tissue Solutions Ltd, 글래스고
라이카 CM 1850 Cryostat 라이카 바이오시스템즈https://www.leicabiosystems.com/en-fr/histology-equipment/cryostats/leica-cm1850/종
PicoEmerald-S 레이저 시스템APE 베를린https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/
ToF SIMS 5IONToF GmbHhttps://spectral.se/products/tof-sims-5
단된

참고문헌

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