방법 논문

세포 내 LC3 양성 소포의 축적과 관련하여 세포외 소포를 통한 LC3-II 방출 평가

DOI:

10.3791/67385

⸱

2024년 10월 18일

 , 
1Biochemistry Unit, Faculty of Veterinary Medicine, Okayama University of Science

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 면역블로팅을 통해 세포외 소포체(EV)에서 자가포식 마커 LC3-II 수준을 간결하게 평가하는 방법론을 제시합니다. EV에서 LC3-II 수준, 자가리소좀 형성 및 오메가솜 형성에 대한 분석은 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 STX6의 새로운 역할을 시사합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

(매크로)자가포식은 근본적인 세포 분해 경로를 나타냅니다. 이 과정에서 자가포식소체(autophagosome)로 알려진 이중막 소포(double-membraned vesicles)가 세포질 내용물을 집어삼키고, 이후 리소좀(lysosome)과 융합하여 분해됩니다. 자가포식 관련 유전자는 일반적인 역할 외에도 염증 분자, 조직 복구 인자, 세포외 소포체(EV)의 방출과 관련된 분비 경로를 조절합니다. 특히, 특히 뇌와 척수에 영향을 미치는 신경퇴행성 질환에서 세포 간에 병리학적 단백질을 전파하는 과정은 이 현상을 이해하는 것의 중요성을 강조합니다. 최근 연구에 따르면 근위축성 측삭 경화증 및 전두측두엽 변성의 핵심 원인인 전이 반응 DNA 결합 단백질 43kDa(TDP-43)는 특히 자가포식체-리소좀 융합이 억제될 때 자가포식 마커 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3B-II(LC3-II)가 풍부한 EV를 통해 자가포식 의존적 방식으로 방출됩니다.

LC3-II 양성 EV의 형성 및 방출의 기전을 규명하기 위해서는 세포 내 및 세포 외 LC3-II 양성 소포를 평가하기 위한 접근 가능하고 재현 가능한 방법을 확립하는 것이 필수적입니다. 이 연구는 차등 원심분리를 통해 얻은 세포 및 EV 분획에서 면역블로팅을 통해 LC3-II 수준을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 자가포식소체-리소좀 융합 억제제인 바필로마이신 A1(Baf)은 세포내 및 세포외 LC3-II 양성 소포의 수준을 향상시키는 양성 대조군 역할을 합니다. 종양 감수성 유전자 101(TSG101)은 다낭체의 마커로 사용됩니다. 이 프로토콜을 적용하면 산발성 크로이츠펠트-야콥병의 유전적 위험 인자인 syntaxin-6(STX6)의 siRNA 매개 knockdown이 Baf로 처리된 세포의 EV 분획에서 LC3-II 수준을 증가시키지만 TSG101 수준에는 유의한 영향을 미치지 않는 것으로 입증되었습니다. 이러한 발견은 STX6가 특히 자가포식체-리소좀 융합이 손상된 조건에서 EV를 통한 LC3-II의 세포외 방출을 부정적으로 조절할 수 있음을 시사합니다. 자가포식을 평가하기 위한 확립된 방법과 결합된 이 프로토콜은 LC3-II 양성 EV의 형성 및 방출에서 특정 분자의 역할에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

트랜스활성화 반응 DNA 결합 단백질 43(TDP-43)은 세포 생존에 필수적인 엑손 스플라이싱, 유전자 전사 및 mRNA 안정성 조절에 관여하는 널리 발현되는 이질적인 핵 리보핵단백질입니다 1,2. 근위축성 측삭 경화증(ALS) 및 전두측두엽 변성(FTLD)과 같은 신경 퇴행성 질환에서는 핵 단백질 TDP-43이 세포질에 비정상적으로 축적됩니다. 이러한 변화는 핵에서 TDP-43 기능의 상실과 세포질에서 독성 기능 이득을 초래합니다. TDP-43의 병리학적 축적은 뇌와 척수의 특정 영역에서 시작되어 프리온과 같은 방식으로 이 영역을 통해 퍼져나가는데, 이는 질병 진행과 밀접한 관련이 있는 과정이다3. 그러나 TDP-43 병리가 뇌와 척수를 통해 퍼지는 정확한 메커니즘은 아직 알려져 있지 않습니다.

TDP-43은 세포외 소포체(EV)를 통해 분비되며, ALS 및 FTLD-TDP 환자의 혈장 및 뇌척수액(CSF)에서 TDP-43 수치가 상승하는 것이 감지됩니다 4,5,6. ALS 및 FTLD로 진단된 환자의 뇌척수액은 인간 신경교종 세포에서 내인성 TDP-43의 세포 내 오국소화 및 응집을 유도한다7. 따라서, EV를 통해 세포 외로 방출되는 TDP-43은 TDP-43 병리의 세포 간 확산을 매개할 수 있다.

자가포식(autophagy)은 잘 보존된 세포 분해 기전으로, LC3로 표시된 자가포식체(autophagosome)로 알려진 이중막 소포체(double-membrane vesicles) 내에 원치 않는 물질을 포함하는 것입니다. 이 자가포식체는 리소좀 관련 막 단백질 1(LAMP1) 양성 리소좀과 융합하여 자가리소좀(LC3+/LAMP1+)을 형성하여 함량을 저하시킵니다8. 조직학적 분석에 의하면 내포물을 둘러싸고 있는 자가포식체(autophagosome)가 산발적인 ALS 환자의 뉴런에 축적되는 것으로 나타났다9. 가족성 ALS 및 FTLD-TDP의 일부 원인 유전자는 자가포식 10,11,12의 조절과 관련이 있습니다. 이러한 결과는 ALS 및 FTLD-TDP 환자에서 자가포식이 억제됨을 시사합니다.

이전 연구는 TDP-43이 자가포식소체-리소좀 융합이 억제될 때 자가포식 마커 LC3-II에 양성인 EV를 통해 분비된다는 것을 나타냈다13. 자가포식-리소좀 경로의 조절 장애는 TDP-43의 세포 내 축적뿐만 아니라 EV를 통한 TDP-43의 세포 외 방출을 유발할 수 있다14. 그러나 LC3-II 양성 EV가 어떻게 방출되는지, 그리고 이것이 TDP-43 병리학의 확산에 얼마나 중요한지는 아직 알려지지 않았습니다.

EV는 세포 표면의 발아로 생성되는 대형 EV(직경 100-1000nm)와 엔도솜(엑소좀이라고 함) 및 Golgi apparatus의 내부를 향한 엔도솜 막의 발아에서 생성되는 소형 EV(직경 50-150nm)로 분류됩니다. 대형 EV와 소형 EV를 별도로 수집하기 위해 순차적 원심분리를 수행하고 각각 20,000 × g 및 110,000 × g에서 원심분리로 펠릿을 수집합니다. P1 EV 분획(20,000 × g 펠릿)은 대형 EV를 수집하기 위해 제조되고, P2 EV 분획(110,000 × g 펠릿)은 소형 EV(15)를 수집하기 위해 제조된다. 면역블로팅에 의한 순차적 원심분리에서 파생된 대형 및 소형 EV에서 LC3-II 수준을 평가하는 방법론은 안정적이고 재현성이 있습니다16. EV의 LC3-II 수준을 분석하는 것 외에도 자가포식 및 오메가솜 형성을 분석하면 자가포식 조절 장애가 어떻게 LC3-II 양성 EV의 방출로 이어지는지에 대한 이해를 높일 수 있습니다. 여기에서, 본 연구는 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 LC3-II 양성 EV의 방출에서 표적 막(17)으로의 수송 소포의 이동을 촉진하는 SNARE 단백질인 syntaxin 6(STX6)의 억제 역할을 보여줍니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HeLa 세포의 배양 배지에서 세포, P1 및 P2 EV 분획의 준비

  1. HeLa 세포의 배양 배지로부터 P1 및 P2 EV 분획의 제조
    1. 1일차
      1. 세포 계수기를 사용하여 세포 수를 세고 DMEM High Glucose, 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된 배양 배지가 포함된 6cm 플레이트에 1 × 106 개의 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
    2. 2일차(선택 사항)
      1. 20μM siRNA 용액을 준비합니다.
      2. 저머무름 튜브에 100μL의 환원 혈청 배지와 3μL의 siRNA를 혼합하여 용액 A를 준비합니다.
      3. 100 μL의 환원 혈청 배지와 5 μL의 transfection 시약을 저머무름 튜브에 혼합하여 용액 B를 준비합니다.
      4. 용액 A와 용액 B를 혼합한 다음 혼합물을 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.
      5. 용액 A와 B의 혼합물을 HeLa 세포 배양에 사용되는 배지에 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
    3. 3일차
      1. PBS로 세포를 세척하고 500 % CO2 및 5 분 동안 습도가 조절 된 37 ° C에서 500 μL의 0.25 % 트립신 및 1 mM EDTA 용액에 노출시킵니다.
      2. 배양 배지 2.5mL를 세포에 추가하고 200μL 피펫 팁이 부착된 파스퇴르 전사 피펫을 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
      3. 세포 계수기를 사용하여 세포를 세고 1cm 접시에 1 × 106 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
        참고: 면역블로팅 분석에 필요한 배양 배지에서 EV를 수집하기 위해 최소 1 × 106 개의 세포를 준비해야 합니다.
    4. 4일차
      1. 비히클(DMSO) 또는 100nM Bafilomycin A1(Baf)을 포함하는 배양 배지(1.1.1.1단계 참조)를 준비합니다.
      2. 세포를 차량 또는 100nM Baf를 함유하는 배지에 노출시키고 37 ° C에서 5 % CO2 및 24 시간 동안 습도가 조절 된 상태로 배양합니다.
    5. 5일차
      1. 10cm 플레이트에서 배양액을 모두 채취하여 15mL 튜브에 옮기고 3,000× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거합니다.
        알림: 10cm 플레이트의 나머지 셀은 섹션 1.2.1에서 사용됩니다.
      2. P1 EV 분획의 분리를 위해 3,000× g 에서 원심분리 후 상층액을 원심분리 튜브에 옮긴 다음 4°C에서 20,000× g 에서 1시간 동안 원심분리합니다.
      3. P2 EV 분획의 분리를 위해 20,000× g 에서 원심분리 후 상층액을 초원심분리 튜브에 옮긴 다음 4°C에서 110,000 ×g 으로 1시간 동안 원심분리합니다.
      4. 실험실 물티슈로 튜브 내부의 과도한 수분을 닦아낸 후 원심분리 튜브에 남아 있는 펠릿을 50μL의 2x 샘플 버퍼[2.5% SDS, 125mM Tris-HCl 버퍼(pH 6.8), 30% 글리세롤, 10% 2-메르캅토에탄올, 0.4% 브로모페놀 블루]에 재현탁하여 P1 EV 분획을 준비합니다.
      5. 디캔팅으로 상층액을 제거하고 실험실 물티슈로 튜브 내부의 과도한 수분을 닦아낸 다음 초원심분리 튜브에 남아 있는 펠릿을 50μL의 2x 샘플 버퍼에 재현탁하여 P2 EV 분획을 준비합니다.
      6. P1 및 P2 EV 분획을 100°C에서 열 블록에서 10분 동안 배양합니다.
        알림: 20,000 × g 및 110,000 × g 에서 원심분리 후 튜브를 흔들지 마십시오. 나머지 펠릿을 실수로 버리지 않도록 하십시오. 상층액을 이송하기 위해 튜브를 기울인 후 펠릿이 남아 있는 상층액에 다시 잠기지 않도록 튜브의 위치를 유지하십시오.
  2. 배양된 HeLa 세포에서 세포 분획 제조
    1. 5일차
      1. 배양 배지를 10cm 플레이트에서 15mL 튜브로 옮긴 후 10cm 접시의 세포를 PBS로 세척하고 37°C에서 5%CO2 로 0.25% 트립신 2mL 및 1mM EDTA 용액에 노출시키고 5분 동안 습도를 조절합니다.
      2. 세포에 8mL의 성장 배지를 추가한 다음 200μL 피펫 팁이 있는 파스퇴르 전사 피펫을 사용하여 세포를 피펫팅하고 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
      3. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮기고 4°C에서 10분 동안 1,000× g 으로 원심분리합니다.
      4. 흡입기로 상층액을 제거하고 세포 펠릿에 PBS를 첨가한 다음 1,000× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
      5. 흡인기(aspirator)를 사용하여 PBS를 제거하고 1% 사르코실을 함유한 A68 완충액 1mL[10mM Tris-HCl 완충액, pH 7.5, 0.8M NaCl, 1mM 에틸렌 글리콜 비스(β-아미노에틸 에테르)-N,N,N,N-테트라아세트산(EGTA)]에서 세포 펠릿을 초음파 처리합니다.
      6. BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 세포 용해물의 단백질 농도를 측정합니다.
      7. 세포 용해물 300μL를 4x 시료 완충액 100μL와 혼합하고 혼합물을 100°C의 열 블록에서 10분 동안 배양하여 세포 분획을 준비합니다.

2. 면역블로팅 분석

  1. SDS-PAGE18에 의해 샘플에서 동등한 양의 단백질을 분리합니다.
  2. 분리된 단백질을 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮깁니다.
  3. 이송 후 차단제로 멤브레인을 20분 동안 차단합니다.
  4. RT에서 10%(v/v) 송아지 혈청을 함유하는 Tris 완충액에 표시된 1차 항체와 함께 막힌 막을 밤새 배양합니다.
  5. 멤브레인을 Tris buffer로 5초 동안 세척한 다음 RT에서 2시간 동안 비오틴 접합 2차 항체로 배양합니다.
  6. 멤브레인을 Tris 완충액으로 5초 동안 세척한 다음 키트의 0.4%(v/v) 용액 A와 용액 B를 포함하는 Tris 완충액으로 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
  7. 멤브레인을 PBS로 세척한 다음 0.04%(w/v) 디아미노벤지딘, 0.8%(w/v) NiCl2·6H2O및 0.3%(v/v) H2O2 를 함유한 PBS로 배양합니다.
    알림: 신호 감지를 위해 화학 발광 방법도 허용됩니다.
  8. 스캐너로 멤브레인의 이미지를 디지털화하고 Fiji를 사용하여 밀도 측정 분석을 수행합니다.
    1. Fiji를 사용하여 디지털화된 이미지를 열고 이미지 | 유형 | 8비트.
    2. 사각형 도구를 클릭하고 사각형을 드래그하여 밴드를 둘러싸도록 사각형의 크기를 조정합니다. Analyze(분석) | 젤 | 첫 번째 차선을 선택합니다.
    3. 두 번째 밴드와 그 다음 밴드에 사각형을 배치하고 분석을 클릭하여 분석할 밴드를 식별합니다 . 젤 | 다음 차선을 선택합니다.
    4. 마지막 밴드를 인식한 후 Analyze | 젤 | 플롯 레인을 클릭합니다.
    5. 대역의 신호 영역을 직선으로 둘러싸고 막대 도구를 클릭한 다음 해당 영역을 클릭하여 대역의 신호 강도를 계산합니다.

3. 자가포식소체(autophagosome)와 자가리소좀(autolysosome)의 수 분석

  1. 1일차
    1. 세포 카운터를 사용하여 HeLa 세포의 수를 세고 3.5cm 접시에 LAMP1-GFP 및 mCherry-LC3를 발현하는5 개의 HeLa 세포 1 × 10개를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
  2. 2일차(선택 사항)
    1. 1.1.2cm 접시에서 섹션 3.5에 설명된 단계를 수행합니다.
  3. 3일차
    1. 3.5cm 접시에서 배양 배지를 버립니다.
    2. PBS로 세포를 세척하고 400μL의 0.25% 트립신 및 1mM EDTA 용액에 노출시킨 다음 37°C에서 5% CO2 및 5분 동안 습도 조절로 배양합니다.
    3. 성장 배지 1.6mL를 세포에 추가하고 파스퇴르 전사 피펫으로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다.
    4. 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 세고 8 챔버 커버슬립에 1 × 104 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
      참고: 챔버 커버슬립의 두 개의 웰은 섹션 3.4.2에 설명된 대로 DMSO 또는 Baf 처리 후 각각 제어 및 STX6 녹다운 셀을 위해 준비됩니다.
  4. 4일차
    1. 비히클(DMSO) 또는 DMSO에 용해된 100nM Baf를 포함하는 페놀 레드(페놀 레드가 없는 DMEM, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신)가 없는 성장 배지를 준비합니다.
    2. 배양 배지를 비히클 또는 100nM Baf를 함유한 페놀 레드가 없는 배지로 교체하고 4시간 동안 배양합니다.
      참고: 자가포식체 및 자가리소좀 수에 대한 Baf의 효과를 평가하려면 차량 처리 세포를 대조군으로 준비하십시오.
    3. 관찰하기 전에 30분 동안 0.33μg/mL Hoechst 33342로 핵을 염색합니다.
    4. 컨포칼 레이저 현미경에서 60x 대물 렌즈를 사용하여 라이브 셀 이미징을 수행하고 10개의 서로 다른 프레임을 캡처합니다.
      1. 피지에서 RGB 병합 이미지를 열고 이미지 | 색상 | 채널 분할.
      2. 를 클릭하여 각 영상의 적색 신호와 녹색 신호에 대한 일정한 임계값 을 설정합니다 . 조정 | 각 실험에 대한 임계값입니다.
      3. 적색 또는 녹색 신호에 대해 양수인 영역의 개수를 계산하려면 Analyze | 입자를 분석합니다. Summarize( 요약 ) 상자를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. Count 의 값을 기록하여 autophagosome- 및 lysosome-associated vesicles를 식별합니다.
      4. 빨간색 이미지에 녹색 이미지를 오버레이하려면 Edit(편집) | 붙여넣기 컨트롤을 클릭합니다. 녹색 이미지를 복사한 다음 빨간색 이미지에 붙여 넣어 병합하면 빨간색 신호와 녹색 신호 모두에 대해 양수인 영역이 강조 표시됩니다.
      5. autolysosome 수를 식별하려면 Analyze | 입자를 분석합니다. Summarize( 요약 ) 상자를 선택하고 OK(확인)를 클릭한 다음 Count(카운트 ) 섹션에 값을 기록하여 autophagosomes 및 lysosome과 관련된 소포를 식별합니다.
    5. autolysosome과 autophagosome의 총 수를 총 세포 수로 나누어 세포당 autolysosome과 autophagosome의 수를 계산합니다.
      참고: 3개의 독립적인 실험 각각에서 35개 이상의 셀을 계산합니다.

4. 오메가솜 형성 분석

  1. 1일차
    1. 세포 계수기를 사용하여 HeLa 세포의 수를 세고 3.5cm 접시에 1 × 105 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
  2. 2일차(선택 사항)
    1. 섹션 1.1.2에 설명된 단계를 수행합니다.
  3. 3일차
    1. 3.3.1-3.3.2단계에 설명된 대로 단일 셀 현탁액을 준비합니다.
    2. 셀 카운터를 사용하여 셀을 세고 3.5cm 접시에 1 × 105 셀을 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
  4. 4일차
    1. pEGFP-C1-hAtg13 1μg, DNA transfection 시약 3μL, 저머무름 튜브에 환원 혈청 배지 100μL를 혼합합니다. 혼합물을 20분 동안 배양한 다음 배양 배지에 첨가합니다.
    2. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
  5. 5일차
    1. 3.3.1-3.3.2단계에 설명된 대로 세포를 트립시화합니다.
    2. 2.5mL의 성장 배지를 세포에 추가합니다. 파스퇴르 전사 피펫을 사용하여 혼합물을 피펫팅하여 단세포 현탁액을 준비합니다.
    3. 세포 카운터를 사용하여 세포를 세고 8 챔버 커버슬립에 1 × 104 세포를 파종합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 와 24 시간 동안 습도를 조절하여 세포를 배양합니다.
  6. 6일째
    1. 3.4.1-3.4.4단계에 따라 컨포칼 레이저 현미경을 사용하여 4.5.3단계에서 세포의 라이브 셀 이미징을 수행합니다. 10개의 서로 다른 이미지 프레임을 캡처할 수 있습니다.
      1. 3.4.4.1-3.4.4.3 단계에 따라 RGB 병합 이미지를 각각의 빨간색, 녹색 및 파란색 이미지 구성 요소로 분할하고, 각 이미지의 녹색 신호에 대한 일정한 임계값을 설정하고, GFP 신호 강도를 결정합니다. GFP-ATG13의 신호 강도를 결정하기 위해 전체 면적 섹션의 값을 기록합니다.
      2. 총 신호 강도를 검사된 셀의 수로 나누어 셀당 신호 강도를 계산합니다.
        참고: 3개의 독립적인 실험 각각에서 최소 34개의 셀을 계산합니다.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이전 연구에서 나타난 바와 같이, Baf 처리는 EV가 풍부한 분획에서 TSG101(P1: P < 0.01, P2: P = 0.012, EZR19에서 양방향 ANOVA로 결정) 및 LC3-II(P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨)의 수치를 증가시켰다. 특히, Baf 처리는 EV 분획에서 STX6(P1: P < 0.01, P2: P < 0.01, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨)를 증가시켰으며, 이는 STX6가 EV의 구성 요소일 수 있음을 시사합니다. 증식하는 세포 핵 항원(PCNA)은 EV 분획에서 관찰되지 않았습니다. 세포 분획에서 STX6의 면역블로팅(Immunoblotting)은 siRNA knockdown으로 STX6 수준이 절반으로 감소한 것으로 나타났습니다(그림 1B). STX6 knockdown은 차량 및 Baf 처리 조건 모두에서 세포 및 EV 분획의 TSG101 수준에 영향을 미치지 않았습니다(그림 1C). 그러나 STX6 knockdown은 비히클 처리 조건에서 세포 분획의 LC3-II 수준을 증가시켰지만 Baf 처리 조건에서는 증가시키지 않았습니다. STX6 넉다운은 또한 Baf 처리 조건에서 EV 분획의 LC3-II 수준을 증가시켰습니다(그림 1D). 이러한 결과는 면역블로팅을 통해 EV에서 LC3-II를 검출하는 데 사용되는 방법이 knockdown 효율이 크지 않더라도 충분히 민감하다는 것을 시사합니다. 또한 이러한 결과는 STX6 knockdown이 Baf 처리 하에서 세포 내 자가포식 개체 수를 증가시키고 자가포식 관련 소포의 세포 외 방출을 향상시킨다는 것을 나타냅니다.

STX6 knockdown이 세포 내 자가포식 및 자가리소좀 수에 영향을 미치는지 여부를 추가로 조사하기 위해 자가포식 마커 mCherry-LC3 및 리소좀 마커 LAMP1-GFP를 사용하여 자가포좀 및 리소좀을 시각화했습니다. 컨포칼 라이브 셀 이미징은 LAMP1-GFP 및 mCherry-LC3를 발현하는 HeLa 세포에서 GFP 및 mCherry 양성 소포를 나타냈습니다(그림 2A). 자가포좀은 GFP 및 mCherry 양성 소포로 확인되었으며, 자가포좀은 GFP 음성 및 mCherry 양성 소포로 확인되었습니다. STX6 knockdown은 비히클 처리 조건에서 자가포식소체와 자가리소좀의 수를 증가시켰습니다(그림 2B,C). 그러나 STX6 knockdown은 Baf 처리 조건에서 자가포식소체 및 자가리소좀 수에 영향을 미치지 않았습니다(그림 2B,C).

STX6 knockdown으로 인한 세포 내 자가포식 수의 증가가 향상된 자가포식 형성에 의한 것인지 확인하기 위해 자가포식 형성에 필요한 과정인 오메가솜 형성을 오메가솜 마커 GFP-ATG13 신호 강도를 사용하여 검사했습니다. 컨포칼 라이브 셀 이미징은 GFP-ATG13의 조립 이미지를 제공하여 오메가솜 형성을 나타냅니다(그림 3A). STX6 넉다운은 GFP-ATG13 신호 강도를 감소시켰습니다(P = 0.023, EZR19의 양방향 ANOVA에 의해 결정됨). STX6 knockdown은 차량 처리 조건에서 GFP-ATG13 신호 강도에 큰 영향을 미치지 않았지만 Baf 처리 조건에서는 신호를 크게 감소시켰습니다(그림 3B). 종합적으로 이러한 결과는 STX6 knockdown이 자가포식 관련 소포의 축적과 관련된 LC3-II 양성 소포의 방출을 증가시킨다는 것을 나타냅니다.

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그림 1: 비히클 또는 Baf 처리 하에 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection된 HeLa 세포의 세포, P1 및 P2 분획의 면역블로팅 결과. HeLa 세포는 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection한 후 24시간 동안 비히클(DMSO) 또는 100nM Baf로 처리했습니다. 세포, P1(20,000 × g 펠릿) 및 P2(110,000 × g 펠릿) 분획을 분리하였다. (A) STX6, TSG101, LC3 및 PCNA를 보여주는 각 분획의 대표 면역블로팅 이미지. (B-D) (B) STX6, (C) TSG101 및 (D) LC3-II에 대한 농도 분석은 면역블롯 이미지로부터 수행하였다. 신호 강도는 vehicle 또는 Baf로 처리된 대조군 또는 STX6 siRNA-transfection된 세포로 정규화되었습니다. 막대 그래프는 S.E.M.(N = 3)± 평균값을 나타냅니다. *는 Excel의 양측 쌍을 이루지 않은 t-검정에 의해 P < 0.05를 나타냅니다. 약어: STX6 = 구문 6; Baf = 바필로마이신 A1; DMSO = 디메틸 설폭사이드; TSG101 = 종양 감수성 유전자 101; LC3 = 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3B; PCNA = 증식 세포 핵 항원; S.E.M. = 평균의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-2
그림 2: 비히클 및 Baf 처리 조건에서 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection된 Lamp1-GFP 및 mCherry-LC3를 동시 발현하는 HeLa 세포의 컨포칼 이미지 분석. (A) LAMP1-GFP 및 mCherry-LC3를 안정적으로 발현하는 HeLa 세포의 컨포칼 이미지를 대조군 또는 STX6 siRNA로 48시간 동안 transfection한 후 DMSO 또는 400nM Baf에 4시간 동안 노출시켰습니다. 눈금 막대 = 20 μm. (B,C) (B) 자가포식좀(LAMP1-GFP 음성 및 mCherry-LC3 양성 점) 및 (C) 자가포식좀(LAMP1-GFP 및 mCherry-LC3 이중 양성 점)의 정열화는 피지 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 막대 그래프의 데이터는 S.E.M.(N = 3)± 평균값으로 표시됩니다. *는 P< 0.05를 나타내며, Excel의 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정을 기반으로 합니다. 약어: Lamp1 = 리소좀 관련 막 단백질 1; LC3 = 미세소관 관련 단백질 1A/1B 경쇄 3B; STX6 = 구문 6; Baf = 바필로마이신 A1; GFP = 녹색 형광 단백질; S.E.M. = 평균의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: GFP-ATG13을 발현하는 HeLa 세포의 컨포칼 이미징으로, 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection하고 vehicle 또는 Baf 처리를 거쳤습니다. (A) HeLa 세포를 대조군 또는 STX6 siRNA로 transfection한 후 pEGFP-C1-hAtg13 transfection하고 DMSO 또는 400nM Baf로 4시간 동안 처리했습니다. 척도 막대 = 20 μm. (B) 상대 신호 강도는 각 조건의 신호를 Baf로 처리된 대조군 siRNA-transfection된 세포의 신호로 정규화하여 측정하였다. 막대 그래프는 데이터를 평균 ± S.E.M.(N = 3)으로 표시합니다. *는 Excel의 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정에 의해 P < 0.05를 나타냅니다. 약어: hAtg13 = 인간 자가포식 관련 유전자 13; STX6 = 구문 6; Baf = 바필로마이신 A1; DMSO = 디메틸 설폭사이드; S.E.M. = 평균의 표준 오차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 대조군 siRNA로 transfection하고 Baf로 처리한 HeLa 세포의 세포, P1 및 P2 분획의 면역블롯 분석. HeLa 세포는 control siRNA로 transfection하고 100nM Baf에 24시간 동안 노출시켰습니다. 그런 다음 세포, P1(20,000 × g 펠릿) 및 P2(110,000 × g 펠릿)의 분획을 준비했습니다. ULK1 및 PCNA의 대표적인 면역블롯 이미지로, 비교를 위해 각 분획의 수치를 보여줍니다. 약어: Baf = bafilomycin A1; ULK1 = kinase 1을 활성화하는 자가포식과 같은 unc-51; PCNA = 증식 세포 핵 항원. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

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면역블로팅 연구에서는 세포 분획, 미세소포가 풍부한 P1 EV 분획, 엑소좀이 풍부한 P2 EV 분획에서 LC3-II 및 TSG101 수치가 밝혀졌습니다. 자가포식체(autophagosome), 자가리소좀(autolysosome) 및 오메가솜(omegasome)을 검사하기 위해 생세포 이미징을 사용하여 STX6 knockdown이 자가포식에 영향을 미치는지 여부에 대한 통찰력을 제공했습니다. 이러한 결합된 결과는 STX6 knockdown이 LC3-II 양성 EV의 방출에 영향을 미치며, 이는 잠재적으로 자가포식 경로의 조절 장애와 관련이 있음을 시사합니다. 이 방법의 주요 장점은 서로 다른 소스에서 생산된 대형 EV와 소형 EV를 구별할 수 있다는 것입니다. 미세소포, 엑소좀 또는 골지체에 대한 특정 마커를 사용한 유세포 분석 분석은 STX6 knockdown이 LC3-II 양성 소포의 방출에 어떤 영향을 미치는지 더욱 명확하게 할 수 있습니다.

그러나 면역블로팅 연구의 한계는 Baf 처리 하에서 STX6 knockdown 후 EV 분획에서 관찰된 LC3-II 수치의 증가가 방출되는 LC3-II 양성 소포의 수 증가 때문인지 아니면 EV당 LC3-II 수치의 증가 때문인지가 불분명하다는 것입니다. 이러한 가능성을 구별하기 위해 나노입자 추적 분석 또는 유세포 분석을 사용하여 소포를 계수하면 LC3-II 양성 소포의 수가 증가하는지 또는 소포당 LC3-II 수준이 상승하는지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜의 중요한 단계는 EV 분획을 준비하기 위한 배양 매체의 분획입니다. EV는 원심분리 튜브에서 작은 펠릿으로 관찰됩니다. 비교 가능한 EV 분획을 제조하려면 EV 펠릿의 단백질 농도가 희석되지 않도록 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 옮기거나 버리는 것이 중요합니다. 세포 분획에서 EV 분획으로의 오염을 조사하기 위해 세포질 단백질, unc-51 유사 자가포식 활성화 키나아제 1(ULK1) 및 핵 단백질, PCNA의 수준을 본 연구에서 분획 간에 비교했습니다(보충 그림 S1). 세포 분획에서의 단백질 농도는 일반적으로 세포 수를 반영하지만, 세포 단백질 농도는 세포주기 단계(20 ) 또는 단백질 침착성(proteostasis)21의 교란에 의해 영향을 받는다. 자가포식은 단백질 유지에 매우 중요하다22. STX6 knockdown 또는 Baf 처리에 의한 자가포식 조절 장애는 세포 수에 관계없이 단백질 농도를 변화시킬 수 있습니다.

STX6 knockdown은 siRNA transfection을 통해 이루어지며, GFP-ATG13의 과발현은 DNA transfection을 통해 이루어집니다. transfection 효율은 세포 유형, 밀도 및 숫자에 의해 영향을 받습니다. siRNA 염기서열의 효율적인 정렬도 knockdown 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. transfection 효율이 낮을 때는 조정이 필요합니다.

본 결과는 STX6 knockdown이 Baf 처리 조건에서 EV 분획에서 autophagosome marker LC3-II의 수준을 증가시켰지만 TSG101 수준에는 영향을 미치지 않았음을 나타냅니다. 이는 STX6가 자가포식체-리소좀 융합이 억제될 때 MVB가 아닌 자가포식소체에서 유래한 소포의 방출을 억제한다는 것을 시사합니다.

STX6 knockdown은 또한 성장 조건에서 세포 LC3-II 수치를 증가시켰으며, 이는 STX6가 자가포식을 조절한다는 것을 시사합니다. 실제로, STX6 knockdown은 autophagosome과 autolysosome의 수를 증가시켰지만, omegasome 형성을 향상시키지는 않았습니다. 자가리소좀의 성숙은 자가포식 리소좀 재형성을 일으킨다23. STX6는 자가포식 리소좀의 성숙 과정을 매개할 수 있으며, STX6의 기능 상실은 미성숙한 자가리소좀의 수를 증가시켜 자가포식 리소좀 개혁의 억제로 인한 자가포좀-리소좀 융합의 조절 장애를 초래할 수 있습니다.

Baf 처리는 발현이 하향 조절된 경우에도 EV 분획에서 STX6 수준을 증가시켰습니다. 이전 연구에서는 리소좀 기능이 억제될 때 자가포식체 관련 소포가 EV로 방출된다고 제안했습니다13,14. STX6는 Group A Streptococcus (GAS) 함유 자가포좀 유사 액포24와 같은 자가포좀 관련 소포에 국한되는 것으로 알려져 있습니다. 따라서 STX6는 자가포식체-리소좀 융합이 억제될 때 EV로 방출되는 자가포식체 관련 소포에 국한될 수 있습니다.

TDP-43 병리학의 확산은 ALS 및 FTLD-TDP3의 진행과 밀접한 관련이 있습니다. TDP-43 병리가 뇌와 척수를 통해 어떻게 퍼지는지는 아직 불분명하지만, EV 경로는 확산을 매개할 수 있습니다. 이전 연구에서는 자가포식-리소좀 경로의 조절 장애로 인해 TDP-43을 포함하는 LC3-II 양성 EV가 방출되는 것으로 나타났습니다13. 본 연구는 STX6가 자가포좀-리소좀 융합이 억제될 때 EV 방출을 조절하는 역할을 제안한다. 면역블로팅을 통해 세포 내 LC3-II 수치와 EV 분획을 평가하는 방법론은 향후 연구에 도움이 될 것입니다.

공개 사항

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저자는 이 기사의 내용과 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 일본 과학 진흥 협회 KAKENHI [보조금 번호 23K06837](일본 도쿄)와 다케다 과학 재단(일본 오사카)의 Y.T.에 대한 자금 지원으로 이루어졌습니다. 저자들은 HeLa 세포를 공급한 David C. Rubinsztein 박사(영국 케임브리지 케임브리지 의학 연구소)에게 감사를 표합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25 % 트립신 EDTA후지 필름 Wako201-16945
10cm 접시Thermo Fisher Scientific150464
15 mL 튜브Thermo Fisher Scientific339650
200 μ L 피펫 팁Nippon GeneticsFG-301피펫팅
2-MercaptoethanolNacalai Tesque21417-52
샘플 버퍼 용액용 재료
3,3'-Diaminobenzidine TetrahydrochlorideNacalai Tesque11009-41DAB 용액용 재료
3.5 cm 접시 Thermo Fisher Scientific150460
6cm 접시 TrueLineTR4001
알루미늄 블록 온도 조절 수조(건식 열욕)EYELA273860
흡인기SANSYOSAP-102흡입 용액
, Avanti JXN-30Beckman CoulterB34193
Bafilomycin A1AdipogenBVT-0252
비오틴 접합 염소 항토끼 IgG 항체벡터 실험실 블로팅을 위한BA-1000
비오틴 접합 말 안티마우스 IgG 항체Vector Laboratories BA-2000면역 블로팅을 위한 2차 항체
블로킹 OneNacalai Tesque03953-95
Bromophenol BlueNacalai Tesque05808-61
샘플 버퍼 용액
Calf SerumcytivaSH30073.03
CanoScan LiDE 220CanonCSLIDE220스캐너
Centrifuge 5702 Reppendolf5703000039
카운팅 슬라이드 듀얼 챔버Bio-Rad1450015J셀 카운팅
디지털 Sonifier 450BRANSON
디메틸 설폭사이드Nacalai Tasque09659-14차량
DMEM High GlucoseNacalai Tesque08458-45
페놀 레드가 없는 배양 배지 DMEMNacalai Tesque08489-45문화 매체
EGTA동인지 348-01311A68 솔루션 Excel용 재료
Microsoft버전 16.16.27위성 분석
EZR참조 번호 24버전 1.68위성 분석
FBS시그마173012문화 매체
피지NIH이미지 분석 도구
GlycerolNacalai Tesque09886-05
샘플 버퍼 용액
Hoehst33342Dojindo H342
과산화수소후지필름 Wako080-0186DAB 용액
재료 Kimwipe S-200NIPPON PAPER CRECIA62011세척 와이프
저보유 튜브Nippon GeneticsFG-MCT015CLBsiRNA 및 DNA transfection
LSM780 컨포칼 레이저 현미경Carl Zeiss
단클론 마우스 Anti-LC3 항체MBLM186-3면역 블로팅을 위한 1st 항체
니켈(II) 염화물 헥사하이드레이트후지필름 Wako149-01041DAB 용액
N-라우로일사르코신 나트륨 염Nacalai Tesque20117-12
Optima XE-90 초원심분리기Beckman CoulterA94471
Opti-MEM I 환원 혈청 매체Thermo Fisher Scientific31985-070siRNA 및 DNA transfection
pEGFP-C1-hAtg13Addgene22875
페니실린/스트렙토마이신Nacalai Tesque26253-84배양 배지
Pierce BCA 단백질 분석 키트Thermo Fisher Scientific23225
Polyclonal Rabbit Anti-PCNA 항체BioAcademia70-0801st 항체 면역 블로팅
Polyclonal Rabbit Anti-syntaxin 6 항체ProteinTech10841-1-AP면역 블로팅을 위한 1st 항체
Polyclonal Rabbit Anti-TSG101 항체ProteinTech28283-1-AP면역 블로팅을 위한 1st 항체
Polyclonal Rabbit Anti-ULK1 항체ProteinTech20986-1-AP를 위한 1st 항체
멤브레인밀리오레IPVH00010면역 블로팅을 위한 재료
RR 개발 핵심 팀버전, 4.4.1satistical analysis
RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778siRNA transfection 시약
siRNA STX6Thermo Fisher ScientificHSS115604siRNA for transfection
Sodium ChlorideNacalai Tesque31320-05Tris
완충액 및 A68 용액용 재료
도데실황산나트륨후지필름, Wako192-13981,
시료 완충액용 재료
SPARK Microplate ReaderTECAN,
Stealth RNAi, Negative Control Duplexes, Med GCThermo Fisher Scientific, 12935300siRNA 형질주입
SucroseFujifilm, Wako193-00025A68 용액
TC20 자동 세포 계수기용 재료, 열전사 프린터Bio-Rad1450109J1세포 계수
thermobathTOKYO RIKAKIKAIMG-3100배양
TransIT-293Mirus BioMIR 2700DNA 형질주입 시약
TransIT-LT1Mirus BioMIR2300DNA 형질주입 시약
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneNacalai Tesque35406-75Tris 버퍼, 샘플 버퍼 및 A68 용액용 재료
Trypan Blue Dye 0.40%Bio-Rad1450021세포 계수
Ultra-Clear Open-Top Tube, 16 x 96mm Beckman Coulter361706P1 EV 분획
Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Coulter344059P2 EV 분획
Vectastain ABC 표준 키트Vector Laboratories 수집 중 PK-4000면역 블로팅
세척 병As One1-4640-02세척
μ-슬라이드 8 웰 하이ibidi80806
, , , , 면역 2차 항체 면역 블로팅 폴리비닐리덴 디플루오라이드, , , , , , , , , 막

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