방법 논문

Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 종양 미세환경에서 당단백질체의 포괄적인 프로파일링을 용이하게 합니다.

DOI:

10.3791/67405

⸱

2025년 2월 7일

 ,  ,  ,  , 
1School of Natural Sciences, Faculty of Science and Engineering, Macquarie University, 2Institute for Glyco-core Research (iGCORE), Nagoya University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 암의 당생물학을 더 잘 이해하는 데 필요한 복잡한 종양 미세환경에서 이질적인 당단백질체에 대한 포괄적인 통찰력을 제공하는 통합 오믹스 기술인 당체학 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)에 대해 자세히 설명합니다.

초록

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당화(glycosylation)는 광범위한 종양 형성 과정에 영향을 미치는 일반적이고 구조적으로 다양한 단백질 변형입니다. 질량 분석 기반 글리코믹스(glycomology) 및 글리코프로테오믹스(glycoproteomics)는 각각 유리된 글라이칸과 온전한 글리코펩타이드를 분석하는 강력한 접근 방식으로 부상했으며, 종양 미세환경(TME)의 이질적인 글리코프로테옴에 대한 더 깊은 이해를 제공합니다. 이 프로토콜은 통합 오믹스 기술인 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)에 대해 자세히 설명하며, 이 방법은 먼저 다공성 흑연화 탄소-LC-MS/MS 기반 글리코믹스를 사용하여 연구 중인 종양 조직, 세포 집단 또는 체액의 글리콤에서 글리칸 구조와 그 정량적 분포를 밝힙니다. 이를 통해 비교 당체학 분석을 통해 환자 그룹, 질병 단계 또는 상태 전반에 걸쳐 변경된 당화(glycosylation)를 식별할 수 있으며, 중요한 것은 알려진 글라이칸 구조의 라이브러리를 생성하여 동일한 샘플의 다운스트림 당단백질체학 분석을 향상시켜 데이터 검색 시간과 당단백질 오식별 비율을 줄이는 역할을 합니다. N-글리코프로테옴 프로파일링에 중점을 두고 글리코믹스 유도 당단백질체학 분석법에 대한 샘플 준비 단계가 이 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 데이터 수집 및 분석의 주요 측면에 대해 설명합니다. 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics method)은 TME에 존재하는 당단백질과 당화(glycosylation) 부위, 부위 점유 및 부위 특이적 글라이칸 구조에 대한 정량적 정보를 제공합니다. 대표적인 결과는 대장암 환자의 포르말린 고정 파라핀 포매 종양 조직에서 제시되었으며, 이는 이 방법이 바이오뱅크에서 흔히 발견되는 조직 절편과 민감하고 호환된다는 것을 보여줍니다. 따라서 Glycomics-guided glycoproteomics는 복잡한 TME에서 당단백질체의 이질성과 역학에 대한 포괄적인 관점을 제공하여 암의 당생물학을 더 잘 이해하는 데 필요한 강력한 생화학적 데이터를 생성합니다.

서론

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단백질 당화(glycosylation)는 계통발생학적 생명의 나무(phylogenetic tree of life) 1,2,3 전반에 걸쳐 종에 의해 생산되는 단백질의 일반적이고 복잡한 유형의 공동 및 번역 후 변형입니다. 단백질 결합 글라이칸은 세포 상호 작용 및 통신 이벤트의 중재 및 조절을 포함하여 인체 건강에 중요한 광범위한 생물학적 과정에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다 4,5. 비정상적인 단백질 당화(glycosylation)는 악성 변형, 종양 진행 및 확산의 원인으로 생각되어 왔습니다 6,7,8. 이는 글라이칸이 종양 미세환경(TME)의 주요 종양 생성 과정에 관여한다는 것을 의미하며, 글라이칸 기반 바이오마커 및 치료 응용 분야의 발견을 위한 상당하고 미개척 잠재력을 제공합니다. 따라서 당생물학(glycobiology)은 암 연구와 생명과학 분야에서 점점 더 많은 관심을 받고 있다9.

지난10년 동안 당분석 및 정보학의 주요 발전에 힘입어 10,11,12,13,14,15,16,17, 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS) 기반 글리코믹스 및 당단백질체학은 복잡한 혼합물에서 유리된 글라이칸 및 온전한 글리코펩타이드의 시스템 전체 프로파일링을 위한 강력한 도구로 확립되었습니다. 다양한 유형의 암 환자 표본 (예 : 종양 조직, 세포 집단, 체액)과 같은 생물학적 샘플 기원에서 직접 추출한 당 단백질 3 , 13 , 18 , 19 , 20 .

Glycomics는 세포, 조직, 심지어 전체 유기체에 의해 동적으로 생성되는 글리칸 레퍼토리(글리솜)의 구조와 양에 대한 정보를 제공합니다. 반면에, 당단백질체학(glycoproteomics)은 단백질 운반체 및 당화(glycosylation) 부위, 부위 점유율(거시 이질성), 부위 특이적 글라이칸 조성 및 부위 분포 패턴(미세이질성)에 대한 정량적 정보를 제한된 글라이칸 구조 정보(종종 글라이칸 조성으로 제한됨)와 함께 제공합니다15,16,21 . 따라서 글리코믹스(glycomics)와 글리코프로테오믹스(glycoproteomics)는 글리코프로테오메(glycoproteome)의 생화학적 세부 사항을 조사하기 위한 보완적인 접근 방식입니다22.

글리코믹스 및 글리코프로테오믹스에 대한 수많은 방법론적 설계 및 분석 전략이 개발되어 관심 있는 글리코분석물(예: N-/O-/C-연결, 글리칸/글리코펩타이드/당단백질, 라벨링/비라벨링), 샘플의 특성(예: 세포, 조직, 체액), 양(나노그램/마이크로그램/밀리그램 단백질 수준) 및 사용 가능한 분석 기기에 따라 실험실 전반에 걸쳐 적용되었습니다23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32. 병행 사용의 알려진 이점에도 불구하고 글리코믹스 및 글리코프로테오믹스는 일반적으로 함께 적용되지 않고 분석 전문 지식과 전문 기기에 대한 높은 요구로 인해 글리코생물학 및 암 연구 연구에서 독립적인 접근 방식으로 사용됩니다.

이러한 기술적 격차를 인식한 우리는 10여 년 전에 복잡한 생물학적 표본에서 얻은 당체학 및 당단백질체학 데이터를 통합할 수 있는 당체학 보조 당단백질체학(glycomics-assisted glycoproteomics) 방법을 도입했습니다33. 요컨대, 글리코믹스 보조(또는 이 프로토콜에서와 같이 글리코믹스 유도) 글리코프로테오믹스 기술은 확립된 다공성 흑연화 탄소(PGC) LC-MS/MS 방법(34,35)을 통해 N- 및/또는 O-글리칸을 프로파일링한 다음, 글라이칸 검색 공간(36)의 경계를 정의하여 동일한 샘플(들)에서 획득한 온전한 N- 및/또는 O-글리코펩티드 데이터의 분석에 사용됩니다. PGC-LC-MS/MS는 높은 감도와 구조적 분해능으로 글리콤에 대한 정량적 통찰력을 제공하여 복잡한 혼합물 35,37,38 내에서도 글라이칸의 토폴로지(단당류 서열 및 분기 패턴) 및 글리코시드 결합에 대한 정보를 제공하기 때문에 특히 강력한 글리코믹스 방법입니다. 당단백질체학(glycoproteomics) 워크플로우에는 펩타이드 생성, 선택적 펩타이드 라벨링, 다중화 및 사전 분획뿐만 아니라 역상 LC-MS/MS 분석 전 농축이 포함되며, 이는 분석물 식별을 위해 단계적 충돌 에너지/고에너지 충돌 해리(sceHCD, N-글리코펩티드의 경우) 및 전자 전달/고에너지 충돌 해리(EThcD, O-글리코펩티드의 경우)를 포함한 다양한 단편화 방법을 이상적으로 사용합니다. N-글리코프로테옴 분석의 경우, 병렬 de-N-글리코프로테오믹스는 단백질/펩타이드 검색 공간을 정의하고 점유된 N-글리코실화 부위 및 부위 점유율에 대한 자세한 정보를 제공하여 온전한 N-글리코펩타이드 데이터 분석을 안내할 수 있으며, 비변형 펩타이드의 병렬 분석은 연구된 조건 간의 단백질 수준 변화를 보여줍니다.

이 백서는 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법에 대한 상세하고 따르기 쉬운 단계별 프로토콜을 제공합니다(워크플로우 개요는 그림 1 참조). 이 프로토콜은 시료 전처리 단계와 LC-MS/MS 기반 당체학 및 당단백질체학 실험에 대한 실험적 세부 정보를 제공하고, 결장직장암(CRC) 환자에서 절제된 종양의 포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직 절편에 이 방법을 적용하는 것을 보여주는 대표적인 결과를 제시하여 전 세계 암 바이오뱅크에 보관된 귀중한 샘플 유형에서 TME의 당생물학에 대한 통찰력을 제공합니다. 글리코믹스(glycomics) 및 글리코프로테오믹스(glycoproteomics) 데이터의 분석 및 통합도 간략하게 논의됩니다.

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그림 1: 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법의 개요. 개요는 글리코믹스(왼쪽) 및 당단백질체학(오른쪽) 워크플로우의 자세한 실험 단계를 보여주며, 얻은 정보에 대한 개요(굵게 표시)와 향상된 데이터 분석 및 해석을 통해 두 가지 접근 방식이 어떻게 통합되는지를 보여줍니다. 삽입: (i) 글리코믹스 및 (ii-iii) 글리코프로테오믹스 워크플로우에 사용되는 자체 제작 SPE 마이크로 컬럼. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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프로토콜

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이 연구는 호주 시드니 맥쿼리 대학의 인간 연구 윤리 위원회(의학)의 승인을 받았습니다(프로토콜 5201800073).

참고: 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법은 낮은 당단백질 복잡성에서 극도의 당단백질 복잡성에 이르기까지 다양한 생물학적 샘플 세트에 적용할 수 있습니다. label-free 당단백질체학(label-free glycoproteomics) 접근법(시료 통합이 수행되지 않음)의 경우, 펩타이드 집단의 1%-10%만 구성할 수 있는 글리코펩타이드에 대한 농축 후 높은 당단백질(glycoproteome) 커버리지를 보장하기 위해 복합 혼합물에서 약 100-200 μg의 총 단백질이 출발 물질로 필요합니다. 공간 제약으로 인해, 세포나 조직으로부터 단백질을 처음 추출하는 것은 생략되고, 독자는 다른 자료를 참조하게 된다15. Glycomics는 심층 글리콤 프로파일링을 위해 분석당 ~10-20μg의 단백질을 보수적으로 소비하며, 대부분의 단백질 추출물은 당단백질체학을 위해 남겨둡니다. 달리 명시되지 않은 경우 최종 농도가 언급되었으며 화학 물질은 아래 프로토콜에서 수용액을 만들기 위해 초고급 물에 용해되어야 합니다.

1. 단백질 준비

  1. 확립된 방법(예: bicinchoninic acid 또는 Bradford protein assay)을 사용하여 추출물의 단백질 농도를 측정합니다. 단백질 농도를 50mM TEAB에서 10μg/μL로 조정합니다(pH 8.5).
  2. 56°C에서 45분 동안 10mM DTT로 샘플을 배양하여 이황화 결합을 줄입니다. 20-25 °C에서 30분 동안 어둠 속에서 40 mM IAA로 샘플을 배양하여 유리 티올기를 알킬레이트합니다. 과도한 DTT(~40mM)로 알킬화 반응을 담금질합니다.
  3. 각 단백질 샘플을 분리합니다. 글리코믹스(glycomics)의 경우 약 10-20 μg의 총 단백질을, 글리코프로테믹스(glycoproteomics) 워크플로우의 경우 100-200 μg의 총 단백질을 허용합니다.
    참고: 관심 단백질 샘플 외에도 절차의 효율성과 재현성을 평가하고 LC-MS/MS 성능을 모니터링하기 위해 알려진 모델 당단백질(예: 소 페투인) 또는 단백질 혼합물(예: 세포주 용해물, 혈장)을 포함합니다.

2. N-글리코믹스 워크플로우

  1. PVDF 멤브레인에서 단백질의 고정화
    1. 단일 구멍 펀처를 사용하여 발견할 단백질 샘플의 수에 따라 PVDF 멤브레인 피팅을 자릅니다.
    2. 절제된 멤브레인을 에탄올 또는 메탄올로 적신 다음 멤브레인을 바닥이 평평한 96웰 플레이트로 옮깁니다.
    3. 멤브레인이 거의 건조되면 단백질 샘플을 스폿당 최대 2.5μL의 부피로 증착하여 증착된 단백질 샘플의 표면적을 최소화합니다. 필요한 경우 현장에서 고정화된 단백질의 총량이 ~10-20 μg이 되도록 샘플을 다시 스폿합니다. 이렇게하려면 스포팅 절차를 반복하기 전에 스폿을 공기 중에서 건조시키십시오.
      참고: 스포팅하는 동안 멤브레인이 건조되어 완성되는 것을 방지하기 위해 멤브레인을 에탄올 또는 메탄올로 다시 적셔야 할 수 있습니다.
    4. 멤브레인을 20-25 °C에서 최소 3 시간 동안, 가급적이면 밤새 자연 건조하십시오. 건조하는 동안 멤브레인이 오염되지 않도록 하십시오.
      참고: 선택적인 품질 관리 단계로, 멤브레인에 발견된 단백질은 앞서 설명한 대로 Direct Blue 71 용액으로 염색하여 시각화할 수 있습니다34.
  2. 단백질 결합 N-글리칸의 방출
    1. 메탄올 100μL의 1%(w/v) PVP40을 점박이 멤브레인이 포함된 각 웰에 추가합니다. 단백질 샘플이 발견된 멤브레인의 측면이 샘플 준비 전반에 걸쳐 위쪽을 향하고 있는지 확인합니다.
    2. PVP40 용액의 플레이트를 20-25°C에서 5분 동안 흔든 다음 PVP40 용액을 버립니다.
      참고: PVP40 용액은 PVDF 멤브레인과 웰을 차단하여 후속 단계에서 PNGase F(및 병렬 실험에서 연결 특이적 정보를 얻기 위해 적용될 수 있는 모든 엑소글리코시다아제, 아래 논의 참조)의 비특이적 결합을 방지합니다.
    3. 막힌 단백질 반점이 포함된 각 웰을 초순수 100μL로 세척하고 플레이트를 5분 동안 흔듭니다. 이 단계를 3회 반복합니다. 세탁할 때마다 물을 완전히 버리십시오.
    4. 샘플당 15μg 단백질이 증착되었다고 가정하고 15μL의 PNGase F 용액(0.5U/μL, 10U/μL 원액의 초순수에 희석)을 각 웰에 추가합니다.
    5. 주변의 빈 우물에 물을 추가하여 후속 배양 단계에서 샘플 탈수를 방지하고 투명 필름을 사용하여 플레이트를 조심스럽게 밀봉합니다. 37 ° C에서 최소 8 시간 동안 플레이트를 배양하십시오.
    6. 플레이트를 5분 동안 초음파 처리하여 웰 측면의 증발된 물방울이 플레이트 바닥에 모일 수 있도록 합니다.
    7. 방출된 N-글라이칸 샘플을 개별 마이크로 원심분리 튜브(1.5mL)로 조심스럽게 옮깁니다. 샘플 웰을 초순수 20μL로 2x 세척하고 분주하고 여러 번 흡인합니다. 각 웰의 남은 샘플을 N-글라이칸 샘플이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브에 결합합니다.
      참고: 친수성 글라이칸이 코팅된 튜브에 비가역적으로 결합할 수 있으므로 N-글리코믹스 샘플 준비에 저결합 튜브를 사용하지 마십시오.
    8. pH 5.0 100mM 암모늄 아세테이트 10μL를 추가하고 20-25°C에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다.
      참고: 이 단계는 방출된 N-글라이칸의 환원 말단에서 아민화된 N-아세틸글루코사민 잔기를 하이드록실화하여 후속 단계에서 완전한 감소를 허용합니다. 분리된 N-글라이칸의 환원 말단에서 높은 글리코실아민-하이드록실 전환율이 용액의 약한 산도에 따라 달라지므로 100mM 암모늄 아세테이트를 pH 5.0으로 조정합니다.
    9. 진공 농축기 시스템에서 N-글라이칸 샘플을 건조시킵니다.
  3. 유리된 N-글리칸의 환원
    1. 건조된 N-글라이칸 샘플에 50mM KOH에서 갓 준비한 1M NaBH4 20μL를 추가하고 완전히 혼합합니다.
      참고: NaBH4 는 사용 당일 KOH에서 신선하게 준비해야 합니다.
    2. 각 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 50°C에서 3시간 동안 샘플을 배양합니다.
      참고: N-글리칸은 환원 말단의 α 및 β 아노머를 단일 알디톨 형태로 변환하는 환원을 거쳐 PGC-LC-MS/MS 분석에서 단일 크로마토그래피 피크를 생성합니다.
    3. 배양 후 마이크로 원심분리기에서 샘플 튜브를 회전시켜 액체를 튜브 바닥으로 가져옵니다.
    4. 각 샘플에 100μL의 초순수를 추가합니다. 2μL의 빙초산을 첨가하여 알칼리성 N-글라이칸 샘플을 중화합니다. 마이크로 원심분리기에서 샘플 튜브를 돌려 샘플을 튜브 바닥으로 가져옵니다.
      참고 : 빙초산은 알칼리 샘플을 중화시켜 반응 중에 수소 가스 (H2 ) 형성 및 후속 발포를 유발합니다.
  4. PGC-C18-SPE를 사용한 N-글라이칸 탈염
    1. 아래 설명과 같이 집에서 만든 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼을 준비합니다.
      1. 적절한 주사기를 사용하여 C18 디스크를 적절한 피펫 팁(10μL)에 꽂아 옮깁니다.
        참고: 여기에서는 상업용 C18-SPE 마이크로 컬럼도 사용할 수 있습니다.
      2. 50%(v/v) 메탄올에 현탁된 PGC 수지의 10μL 슬러리를 C18-SPE 마이크로 컬럼에 피펫으로 분사합니다. 마이크로 원심분리기 어댑터가 장착된 2mL 튜브에 마이크로 컬럼을 놓습니다. 튜브를 돌려 컬럼 높이가 ~0.5cm인 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼을 만듭니다( 그림 1i 참조). 각 샘플에 대해 하나의 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼을 준비합니다.
        알림: 어댑터를 사용하면 마이크로 컬럼이 튜브 중앙에 매달려 있습니다.
      3. 후속 세척 및 시료 로딩 단계를 위해 탁상형 원심분리기를 6,000rpm(~2,000 x g)으로 설정하고 60초 동안 회전하여 이동상이 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼을 쉽게 통과할 수 있도록 합니다. 각 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼을 ACN에서 50μL 0.1%(v/v) TFA로 3회 세척 및 컨디셔닝한 후 50μL 0.1%(v/v) TFA를 3회 순차적으로 세척 및 컨디셔닝합니다.
        참고: PGC-SPE 마이크로 컬럼은 몇 시간 전에 미리 준비할 수 있지만 사용하기 전에 실온에서 수화하여 보관해야 합니다.
    2. N-글라이칸 샘플을 최대 40μL의 로딩 부피로 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼에 적용하고 추가할 때마다 60초 동안 6,000rpm(~2,000 x g)으로 회전합니다. 전체 N-글라이칸 샘플이 마이크로 컬럼에 적용될 때까지 로딩 단계를 반복합니다.
      참고: 플로우스루 분획에는 글라이칸이 포함되어서는 안 되지만, PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼에서 불완전한 머무름이 발생한 경우 글리코믹스 데이터를 성공적으로 획득할 때까지 이러한 분획을 유지하는 것이 좋습니다.
    3. PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼을 20μL의 초순수로 세척합니다. N-글라이칸 용리를 준비하기 위해 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    4. 각 PGC-C18-SPE 마이크로 컬럼에 50%(둘 다 v/v) ACN에 40μL의 0.1% TFA를 첨가하여 N-글라이칸을 용리한 다음 스핀합니다. 이 절차를 반복하고 용리액을 결합합니다.
      참고: 각 스핀 후에 마이크로 컬럼을 모니터링하여 용액이 완전히 스핀되었는지 확인하는 것이 중요하며, 이는 효율적인 용리를 촉진하기 때문입니다.
    5. 탈염된 N-글리칸을 진공 농축기 시스템에서 건조시킵니다.
  5. PGC-LC-MS/MS 획득
    1. 아래 설명된 대로 LC 용매를 준비합니다.
      1. 용매 A: 초순수에 100mM 중탄산암모늄(NH4HCO3) 원액 100mL를 준비합니다. 진공 여과 장치를 사용하여 0.2μm 나일론 필터 디스크를 통해 원액을 여과하여 미립자를 제거합니다. 그런 다음 100mM NH4HCO3 원액 100mL를 초순수 900mL에 희석하여 10mMNH4HCO3용액(용매 A)1L를 준비합니다. 용매 A를 15분 동안 초음파 처리하여 용액의 가스를 제거합니다. 용매 A는 20-25 °C에서 1 주일 동안 보관할 수 있으며, 100 mM NH4HCO3 원액은 4 °C에서 1 개월 동안 보관할 수 있습니다.
      2. 용매 B : 100 mL의 100 mM NH4HCO3 원액 (이전 단계 2.5.1.2 참조)을 ACN 700 mL에 첨가하여 초순수(용매 B)에 10 mM NH 4 HCO 3 in 10 mM NH4HCO3 in 1 L를 준비하고 초순수로 총 부피 1 L로 희석합니다. 용매 B를 15분 동안 초음파 처리하여 가스를 제거합니다. 용매 B는 20-25 °C에서 2 주 동안 보관할 수 있습니다.
    2. 탈염된 N-글리칸을 초순수 10μL에 재현탁시키고 철저히 혼합합니다. 14,000 x g 에서 5분 동안 샘플을 회전시킨 다음 LC-MS/MS 시스템을 손상시킬 수 있는 가시적이거나 보이지 않는 미립자 및 파편이 이동하지 않도록 약 0.5μL를 남겨두고 상등액을 MS 샘플 바이알로 조심스럽게 옮깁니다.
    3. HPLC 시스템의 용매 A에서 0%-70%(v/v) 용매 B의 60분 선형(또는 기타 적절한) 그래디언트를 사용하여 50°C로 가열된 PGC-LC 모세관 컬럼에 N-글라이칸을 주입하고 분리합니다. HPLC 시스템이 질량분석기에 연결되어 있고 20μL/min의 일정한 유속으로 작동하는지 확인합니다(PGC-LC 컬럼의 기하학적 구조에 맞게 유속 조정).
    4. 전기 분무 이온 소스와 함께 설치되고 음이온 극성 모드에서 작동하는 선형 이온 트랩 사중극자 질량 분석기(또는 다른 적합한 저분해능 또는 고분해능 MS 시스템)를 사용하여 분리된 N-글라이칸을 검출합니다.
    5. MS1 획득 스캔 범위를 m/z 150-2,000으로 설정하고 줌 스캔 피크 너비는 m/z 0.25, m/z 200에서 FWHM(full-width, half maximum)을 설정합니다. 소스 전압을 3.2kV로 설정합니다. MS1 스캔의 경우 자동 게인 제어(AGC)를 최대 누적 시간이 50ms인 5 x 104 이온으로 설정합니다(또는 기타 적절한 설정).
      참고: 낮은 시작 m/z 는 종종 N- 및 O-글리솜에 기여하는 모노 및 디당류의 검출을 포함하는 것입니다.
    6. MS/MS의 경우 분해능을 m/z 200에서 m/z 0.25FWHM으로, AGC를 2 x 104 이온으로, 최대 축적 시간을 300ms로 설정합니다. DDA(data-dependent acquisition)를 활성화하고 33%의 정규화된 충돌 에너지(NCE)에서 공명 활성화(이온 트랩) 충돌 유도 분해(CID)를 사용하여 각 MS1 전체 스캔에서 가장 풍부한 5개의 전구체를 선택합니다. 밀접하게 용리되는 동중원소 N-글라이칸 이성질체가 누락되지 않도록 동적 배제를 선택 해제합니다.
  6. LC-MS/MS 글리코믹스 데이터의 데이터 분석
    1. 좁은 LC 피크 폭, 효과적인 N-글라이칸 이성질체 분리, 높은 MS 정확도, 분리능, 신호 대 잡음비, 높은 CID-MS/MS 단편화 효율을 확인한 후 높은 데이터 품질을 보장하기 위해 적절한 소프트웨어를 사용하여 생성된 LC-MS/MS 원시 데이터를 찾아볼 수 있습니다.
    2. 단일 동위원소 전구체 질량, CID-MS/MS 단편화 패턴, 상대 및 절대 PGC-LC 머무름 시간을 기준으로 샘플에서 N-글라이칸을 수동으로 식별합니다.
      참고: RawMeat v2.1, GlycoMod 및 GlycoWorkBench v2.1은26에 설명된 대로 식별 프로세스를 지원할 수 있습니다. 관찰된 분석물 간의 알려진 생합성 제약 조건 및 구조적 관련성은 또한 식별된 N-글라이칸에 대한 신뢰성을 더할 수 있습니다26. 또는 반자동 글라이칸 식별 및 스펙트럼 주석은 상용 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다.
    3. 상대 N-글라이칸 정량을 위해 식별된 모든 N-글라이칸 이성질체의 단일 동위원소 전구체 m/z 를 포함하는 전이 목록을 생성하고 상용 소프트웨어를 사용하여 설명된 대로 모든 N-글라이칸 전구체 이온의 추출된 이온 크로마토그램(EIC)을 기반으로 AUC(Area-under-the-Curve) 값을 측정합니다26.

3. N-글리코프로테오믹스 워크플로우

  1. 단백질 혼합물의 소화
    1. 각 샘플에 트립신(1:50 효소:단백질 비율, w/w) 및/또는 선택한 기타 프로테아제를 첨가하여 환원 및 알킬화된 단백질 추출물(파트 1)을 100-200μg으로 분해합니다.
      참고: 글리코믹스 시료 전처리와 달리, 최대 펩타이드 회수를 위해 당단백질체학 시료 전처리 단계에는 가능하면 저결합 미세원심분리 튜브를 사용하십시오.
    2. 37 ° C에서 8-12 시간 동안 샘플을 배양합니다. pH가 ~8.5인지 확인하면 약알칼리성 용액이 트립신 소화 효율을 향상시키므로
      참고: 예측 가능한 절단 패턴을 생성하고 트립신 및 Lys-C와 같은 단일 염기서열(당화 부위)을 가진 대부분의 N-글리코펩티드를 남기는 특정 프로테아제가 선호됩니다. 트립신 또는 다른 프로테아제에 의한 단백질의 비특이적 절단을 줄이기 위해 샘플을 과도하게 배양하지 마십시오.
    3. 1%(v/v) TFA를 첨가하여 산성화(장시간의 소화로 인한 비특이적 분열을 방지하기 위해)에 의한 분해를 중지합니다.
  2. Oligo R3-C18-SPE를 이용한 펩타이드 탈염
    1. 아래와 같이 집에서 만든 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 준비합니다.
      1. 적절한 주사기를 사용하여 C18 디스크를 10μL 피펫 팁에 꽂아 옮깁니다.
        참고: 여기에서는 상업용 C18-SPE 마이크로 컬럼도 사용할 수 있습니다.
      2. 깔끔한 ACN에 현탁된 Oligo R3 수지 슬러리를 C18-SPE 마이크로 컬럼에 증착합니다. 마이크로 원심분리기 어댑터가 장착된 2mL 튜브에 마이크로 컬럼을 배치하여 마이크로 컬럼이 튜브 중앙에 부유하고 회전하여 컬럼 높이가 ~1cm인 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 생성합니다( 그림 1ii 참조). 각 시료에 대해 하나의 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 준비합니다.
    2. 후속 세척 및 시료 로딩 단계를 위해 벤치탑 원심분리기를 6,000rpm(~2,000 x g)으로 조정하고 60초 동안 회전하여 이동상이 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 통과할 수 있도록 합니다. 각 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 50μL의 순수 ACN(3x)으로 순차적으로 세척한 다음 50μL의 0.1%(v/v) TFA, 3x로 세척 및 컨디셔닝합니다.
      참고: Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼은 미리 준비할 수 있으며 사용 전에 실온에서 몇 시간 동안 수화 상태로 보관할 수 있습니다.
    3. 컨디셔닝된 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 마이크로 원심분리기 어댑터와 함께 새 1.5mL 튜브에 넣습니다. 트립틱으로 분해된 펩타이드 혼합물을 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼에 적용하고 2,000 x g 에서 60초 동안 회전합니다. 50 μL보다 큰 시료 부피의 경우 여러 차례의 로딩이 필요할 수 있습니다.
    4. Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 50μL의 0.1%(v/v) TFA, 3x로 세척합니다. 탈염 펩타이드의 용리를 준비하기 위해 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼을 새로운 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
    5. 각 Oligo R3-C18-SPE 마이크로 컬럼에 50%(둘 다 v/v) ACN에 0.1% TFA 50μL를 적용한 다음 70%(둘 다 v/v) ACN에 0.1% TFA 50μL를 적용하여 탈염 펩타이드를 용리시킵니다. 각 단계 후에 회전합니다.
      참고: 각 스핀 후에 마이크로 컬럼을 모니터링하여 용액이 완전히 스핀되었는지 확인하는 것이 중요하며, 이는 효율적인 용리를 촉진하기 때문입니다.
    6. 탈염된 펩타이드를 진공 농축기 시스템에서 수집, 결합 및 건조합니다.
      참고: 병렬 단백질체학 및 de-N-당단백질체학을 수행하는 경우(논의 참조), 탈염된 펩타이드 샘플을 분리하고 건조하기 전에 별도의 분획을 따로 보관하십시오.
  3. ZIC-HILIC-C8-SPE를 사용한 N-글리코펩타이드 농축
    1. 아래 설명된 대로 집에서 만든 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 준비합니다.
      1. 적절한 주사기를 사용하여 C8 디스크를 10μL 피펫 팁에 꽂아 옮깁니다.
      2. 메탄올에 현탁된 ZIC-HILIC 수지 슬러리를 C8-SPE 마이크로 컬럼에 증착합니다. 마이크로 원심분리기 어댑터가 장착된 2mL 튜브에 마이크로 컬럼을 배치하여 마이크로 컬럼이 튜브 중앙에 부유하고 회전하여 컬럼 높이가 ~1cm인 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 생성합니다( 그림 1iii 참조). 각 샘플에 대해 하나의 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 준비합니다.
    2. 후속 세척 및 시료 로딩 단계를 위해 벤치탑 원심분리기를 6,000rpm(~2,000 x g) 으로 조정하고 60초 동안 회전시켜 이동상이 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 통과할 수 있도록 합니다. 각 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 50μL의 메탄올, 3x, 50μL의 초순수, 3x, 마지막으로 50μL의 1% TFA를 80%(둘 다 v/v) ACN, 3x로 순차적으로 세척 및 컨디셔닝합니다.
      참고: ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼은 몇 시간 전에 미리 준비할 수 있지만 사용하기 전에 실온에서 수화하여 보관해야 합니다.
    3. N-글리코펩타이드 농축을 위해 지정된 건조된 펩타이드 혼합물을 80%(둘 다 v/v) ACN에서 1% TFA 50μL에 재현탁시키고 완전히 혼합합니다.
      참고: 펩타이드가 HILIC 로딩 용매에 재용해되기 어려운 경우, 펩타이드를 먼저 10%(v/v) TFA에 재용해시킨 다음 ACN에서 빠르게 희석하여 HILIC 로딩 용매의 농도에 도달할 수 있습니다. 가수분해를 유도하지 않도록 TFA 농도가 높은 상태에서 샘플을 가열하지 마십시오.
    4. 컨디셔닝된 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 마이크로 원심분리 어댑터와 함께 새로운 1.5mL 튜브에 넣습니다. 재현탁된 펩타이드 혼합물을 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼에 적용하고 2,000 x g 에서 60초 동안 회전합니다. 50 μL보다 큰 시료 부피의 경우 여러 차례의 로딩이 필요할 수 있습니다.
    5. 플로우스루 분획을 수집하고 동일한 ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼에 분획을 다시 적용합니다. 재적용을 2회 반복하고 유류 튜브를 유지합니다.
    6. ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼 2x를 80%(v/v 모두) ACN에서 50μL의 1% TFA로 세척하고 스핀한 후 이 플로우스루를 3.3.4단계의 플로우스루와 결합합니다.
      참고: 결합된 플로우스루 분획은 일반적으로 총 펩타이드 물질의 ~90%를 함유하여 비변형 펩타이드 분획을 효과적으로 형성하므로 별도의 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다(별도의 단백질체학 유형 실험을 수행하는 대신).
    7. ZIC-HILIC-C8-SPE 마이크로 컬럼을 새로운 1.5mL 저결합 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 잔류 N-글리코펩타이드를 50μL의 0.1%(v/v) TFA로 순차적으로 용리한 다음 50μL의 25mM 중탄산암모늄, 50μL의 50%(v/v) ACN으로 순차적으로 용리합니다. 각 단계 후에 2,000 x g 에서 60초 동안 회전합니다.
      참고: 용리액은 일반적으로 총 펩타이드 물질의 ~10%를 함유하고 있으며, 높은 농축 효율이 달성되면 대부분이 N-글리코펩타이드여야 합니다. 용액이 완전히 스핀되었는지 확인하기 위해 각 스핀 후에 마이크로 컬럼을 모니터링하는 것이 중요하며, 이는 효율적인 용리를 촉진하기 때문입니다.
    8. 진공 농축기 시스템에서 농축된 N-글리코펩타이드와 (필요한 경우) 비변형 펩타이드가 분획을 통해 흐르도록 수집, 결합 및 건조합니다.
  4. 온전한 N-글리코펩티드의 역상 LC-MS/MS
    1. 아래 설명된 대로 LC 용매를 준비합니다.
      1. 용매 A: 초순수에 0.1%(v/v) 포름산 1L를 준비합니다. 용매를 제거하기 위해 15분 동안 초음파 처리합니다. 용매 A는 20-25 °C에서 한 달 동안 보관할 수 있습니다.
      2. 용매 B : 99.9 % (모두 v / v) ACN에 0.1 % 포름산 1L를 준비합니다. 가스를 제거하기 위해 15분 동안 초음파 처리합니다. 용매 B는 20-25 °C에서 한 달 동안 보관할 수 있습니다.
    2. 0.1%(v/v) 포름산의 건조된 펩타이드 분획을 약 0.2-0.5 μg 펩타이드/μL의 농도로 재현탁시키고 완전히 혼합합니다. 14,000 x g 에서 5분 동안 샘플을 회전시킨 다음 원치 않는 미립자 및 파편이 이동하지 않도록 약 0.5μL를 남겨두고 상등액을 MS 샘플 바이알로 조심스럽게 옮깁니다.
    3. 각 샘플에 대해 C18-LC 트랩 컬럼에 ~0.5-1μg 총 펩타이드를 주입하고 100분 동안 2%-30% 용매 B, 18분 동안 30%-50% B의 그래디언트로 질량 분석기에 연결된 UPHLC 시스템을 사용하여 250nL/분의 일정한 유속으로 C18-LC 분석 컬럼에서 펩타이드를 분리합니다. 1분 동안 50%-95% B, 용매 A의 95%(모든 v/v) B에서 9분(또는 기타 적절한 설정).
    4. 나노 전기분무 이온 소스가 장착되고 양이온 극성 모드에서 작동하는 nanoLC 시스템에 결합된 고분해능 질량 분석기로 펩타이드를 검출합니다.
    5. MS1의 경우 획득 스캔 범위 m/z 350-1,800, 고해상도 60,000-120,000FWHM에서 m /z 200, 소스 전압 ~2.5kV를 사용합니다. AGC를 최대 축적 시간이 3ms인 10x 6 50 이온으로 설정합니다(또는 기타 적절한 설정).
    6. MS/MS의 경우, 고정 NCE가 35%인 HCD-MS/MS 또는 NCE가 25%, 35% 및 45%인 sceHCD를 사용하는 DDA 모드를 사용하여 단편화를 위해 각 MS1 전체 스캔에서 가장 풍부한 전구체 이온 20개를 선택합니다. 중요한 것은 더 낮은 m/z 값을 110(예: 스캔 범위 m/z 110 - 1,800)으로 고정하여 각 단편 스펙트럼에서 모든 저질량 옥소늄 이온을 관찰하는 것입니다.
    7. 단편화를 위해 2개 이상의 전하(Z ≥ 2)를 전달하는 전구체를 선택합니다. 1 x 105 이온의 AGC와 90 ms 축적 시간으로 m/z 200에서 30,000-45,000 FWHM 해상도에서 ± 1.0 Th의 전구체 분리 창을 사용하여 (sce)HCD-MS/MS 스펙트럼을 획득합니다. 주어진 전구체 이온의 단일 분리 및 단편화 후 30초의 동적 배제를 가능하게 합니다.
      참고: ETD를 사용할 수 있는 경우 제품 의존 이온 트리거링을 사용하여 온전한 N-글리코펩타이드 샘플의 EThcD-MS/MS를 획득하는 것도 고려하십시오. 진단용 글라이칸 옥소늄 이온(예: m/z 138.0545, 204.0867 및 366.1396)이 각 HCD-MS/MS 스펙트럼39 내에서 상위 20개 단편 이온에 속할 때 이 단계를 수행합니다. 4 x 105 이온의 AGC, 250ms의 주입 시간, 15%의 HCD NCE, 1.6Th의 전구체 분리 폭으로 m/z 200에서 30,000-45,000 FWHM 해상도로 EThcD-MS/MS 단편을 검출합니다.
  5. LC-MS/MS 당단백질체학 데이터의 데이터 분석
    1. 대부분의 HCD-MS/MS 스펙트럼에 글라이칸 옥소늄 이온(예: m/z 138.0545, 204.0867 및 366.1396)이 포함되어 있는지 확인하고 (라벨링 전략용) 저질량 TMT 리포터 이온의 기준선 분리, MS/MS 스펙트럼에서 높은 단편화 효율 및 좁은 LC 피크 폭, 높은 MS 정확도, 해상도 및 신호 대 잡음비.
    2. 검색 엔진(여러 개 사용 가능, 아래 참조)을 사용하여 조사 중인 샘플(예: de-N-glycoproteomics 실험에서 얻은 적절한 단백질/펩타이드 데이터베이스) 또는 검토된 모든 UniProtKB 인간 단백질에 대해 온전한 N-글리코펩타이드에 대한 MS/MS 데이터를 검색합니다. 염기서열(sequon-localized) Asn을 가진 펩타이드를 검색하여 펩타이드 N-글리코실화(peptide N-glycosylation)에 대한 검색을 맞춤화합니다. 중요한 것은 글리코믹스 정보에 입각한 N-글라이칸 데이터베이스, 즉 2단계의 글리코믹스 데이터에서 식별된 글라이칸을 선택하여 샘플에 존재하는 것으로 알려진 글라이칸으로 검색 공간을 제한하는 것입니다.
      참고: 광범위한 사전 정의된 N-글라이칸 데이터베이스를 사용한 병렬 검색은 데이터에 추가 N-글라이칸 조성의 존재를 배제하는 것으로 간주될 수 있습니다.
    3. 연구 중인 샘플, 수행된 특정 샘플 처리 절차, 사용된 MS 설정 및 사용된 기기에 따라 나머지 검색 변수를 조정합니다. N-당단백질체학 데이터 검색을 위한 일반적인 검색 설정은 다음과 같습니다.
      전구체 및 제품 질량 허용 오차: 10ppm 및 20ppm
      프로테아제 특이성: 완전 특이적 및/또는 반특이적(N-ragged)
      놓친 분열 허용: 2
      고정 수정: Cys carbamidomethylation (+57.021 Da)
      가변 변형 : 충족 산화 (+15.994 Da) (공통 1)
      펩타이드당 허용되는 가변 변형: 1 또는 2
      글라이칸 변형: 글리코믹스 정보에 입각한 글라이칸 데이터베이스(희귀 1)
      단백질 미끼 및 오염 물질 데이터베이스: 사용
    4. 단백질 수준 및 펩타이드 수준에서 <1% FDR(False Discovery Rate)로 모든 검색을 필터링합니다. 높은 신뢰도로 식별된 N-글리코펩타이드(예: PEP 2D 점수 < 0.001)만 고려하고 필터링된 출력의 수동 주석/큐레이션을 수행하여 논의된 바와 같이 잘못된 N-글리코펩타이드 식별률을 더 줄입니다 36,40,41.
      참고: 시알릴화 및 멀티-푸코실화 N-글라이칸 및 글리칸 이외에 다른 다양한 변형을 수반하는 글리코펩티드(즉, Met 산화 및 Asn/Gln 탈아미드화)는 특히 검색 엔진에 의해 잘못 해석되기 쉽다(41). 보고하기 전에 이러한 후보자를 검증하기 위해 특별한 주의를 기울여야 합니다.

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결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 섹션에서는 II단계에서 CRC를 앓고 있는 환자의 FFPE 조직 슬라이드에 적용된 글리코믹스 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법의 대표적인 결과를 제공합니다.

프로토콜에 대한 충분한 단백질 출발 물질을 달성하기 위해 발표된 프로토콜에 따라 동일한 FFPE 조직 블록에서 두 슬라이드(z 스택)의 단백질 추출물을 결합하고 TMT 라벨링 접근법을 적용하여 당단백질체학 실험의 감도를 높였습니다(아래 옵션 단계 참조)42.

첫째, FFPE CRC 조직의 PGC-LC-MS/MS 기반 N-글리코믹스 데이터를 분석한 결과, 59개의 글라이칸 조성에 걸쳐 총 76개의 N-글라이칸 이성질체가 식별되었습니다(그림 2). CRC 조직43에 대한 이전의 N-글리콤 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜의 중요한 단계
이 프로토콜 논문에서는 복합 TME에서 당단백질체의 이질성과 역학에 대한 포괄적인 관점을 제공하는 당체학 유도 당단백질체학(glycomics-guided glycoproteomics) 방법을 단계별로 설명했습니다.

프로토콜의 중요한 단계는 단백질 혼합물을 과도하게 소화하지 않고 완전한 단백질 분해를 보장하는 것입니다. 단백질의 비특이적 절단은 본질적으로 펩타이드 검색 공간을 증가시켜 검색 시간이 길어지고 글리코펩타이드의 오식별률이 높아집니다50.

의도하지 않은 유도체화는 데이터 분석을 복잡하게 만들고 속도를 늦추어 다시 높은 오식별률을 초래하기 때문에 샘플 준비 단계(예: 알킬화 부반응) 중에 다른 변형의 도입을 피하는 것도 필수적입니다1...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

THC는 호주 정부가 자금을 지원하는 국제 연구 교육 프로그램 장학금의 지원을 받습니다. NB는 Macquarie University에서 자금을 지원하는 International Macquarie University Research Excellence Scholarships의 지원을 받습니다. AC는 호주 정부가 자금을 지원하는 연구 교육 프로그램 장학금의 지원을 받습니다. RK는 뉴사우스웨일스 암 연구소(Cancer Institute of New South Wales, ECF181259)의 지원을 받았습니다. MTA는 호주 연구 위원회 미래 펠로우십(Australian Research Council Future Fellowship, FT210100455)을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강한>화학물질
암모늄 아세테이트 Sigma AldrichA1542대안 사용 가능
중탄산 암모늄, 순도 ≥ 99.0%Sigma AldrichA6141대안 사용 가능
무수 아세토니트릴(ACN), LC-MS 등급Sigma Aldrich34851대안 사용 가능
소 페투인Sigma AldrichF3004대안 사용 가능
디티오트레이톨(DTT)Sigma AldrichD0632대안 사용 가능
에탄올Sigma AldrichE7023대안 사용
포름산, LC-MS 등급Sigma Aldrich00940대안 사용
빙초산Sigma AldrichA6283대안 사용
가능 요오드아세트아미드(IAA)Sigma AldrichI1149대안 사용 가능
메탄올Sigma AldrichM1775대안 사용 가능
펩타이드-N-글리코시다아제 F (PNGase F)PromegaV4831Elizabethkingia miricola PNGase F (10 U/μ L) 대장균에서 재조합으로 발현됨;
폴리비닐피롤리돈 40 (PVP)Sigma AldrichPVP40대안 사용 가능
수산화칼륨(KOH)Sigma Aldrich484016대안 사용 가능
시퀀싱 등급 돼지 트립신 PromegaV5113대안 사용
소화붕소나트륨(NaBH4)Sigma Aldrich213462대안 사용 가능
트리에틸암모늄 바이카보네이트(TEAB), LC-MS 등급Sigma AldrichT7408대안 사용
트리플루오로아세트산(TFA), LC-MS 등급Sigma AldrichT6508대안 사용 가능
Tools/Materials
C18 디스크Empore66883-U
C8 디스크Empore66882-U
Flat-bottom polypropylene 96-well plate Corning3364
Immobilon-PSQ 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 막MilliporeIPVH20200기공 크기: 0.45 & 엠 
MicrocentrifugeEppendorf5452000069대안 사용 가능
Microcentrifuge 어댑터 The Nest Group, Inc., MASS18VMiniSpin Column Collar는 Microspin
Columns Oligo R3 수지Thermo1133903Particle size 30 μ m
ParafilmParafilm MPM996
Protein LoBind 튜브 1.5 mLEppendorf0030108450
Protein LoBind 튜브 2.0 mLEppendorf0030108442
Safe-lock 튜브 1.5 mLEppendorf0030120086
Safe-lock 튜브 2.0 mLEppendorf0030120094
ShakerEppendorf5382000066대안 사용 가능:
단일 구멍 펀처, Swingline74005
SpeedVac 집중 장치Martin ChristRVC 2-25, CDplus대안 사용 가능
: Supelclean ENVI-Carb, SPE 수지Supelco57088입자 크기: 120-400 mesh. 수지는 카트리지에서 수동으로 추출할 수 있으며 MilliQ 물 주사기에 50%(v/v) 메탄올에 장기간 보관할 수 있습니다
5mLSigma AldrichZ116866대안 사용 가능
온도 제어 인큐베이터ThermolineE7.30대체 사용 가능
초음파 수조UnisonicsFXP대체 사용 가능
ZIC-HILIC 수지Merck150455입자/기공 크기, 5 μ m/200 Å. 레진은 LC 컬럼에서 수동으로 추출할 수 있으며, MilliQ 물
ZipTip C18 고체상 추출(SPE) 마이크로 컬럼MilliporeZTC18S096대안적으로, 집에서 만든 C18-SPE 마이크로 컬럼이 상업용 제품
LC-MS/MS Analysis
1260 Infinity Capillary HPLC 시스템을애질런트대안 사용
가능 ReproSil-Pur C18 AQ 수지로 사전 포장된 분석 LC 컬럼Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr13.aq.s2570입자/공극 크기: 3 μ m/120 &, 길이/내경: 25cm/75&m. 상업용 C18 나노-LC 컬럼도 사용 가능/ 
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano LC 시스템 사용 가능한 열대체품
HyperCarb, KAPPA, PGC, 모세관 LC 컬럼 Thermo단종입자/기공 크기, 3 μ m/250 &아링;; 열 길이, 30mm; 내경, 0.180mm. 유사한 품질의 데이터를 생성하는 HyperCarb PGC-LC 컬럼의 더 큰 형상이 상업적으로 이용 가능합니다(예: Thermo #35003-031030). 입자/공극 크기를 가진 Merck의 SupelTMCarb LC 컬럼, 2.7 μ m/200 및 컬럼 길이와 내경이 다른 제품도 사용할 수 있습니다(예: Merck #59994-U). 
LCMS 등급 아세토니트릴LiChrosolv100029대안 사용 가능
선형 트랩 사중극자(LTQ) Velos Pro 이온 트랩 질량 분석기(글리코믹스) Thermo대체품 사용 가능
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid 질량분석기(당단백질체학)ThermoETD가 있거나 없는 다른 고분해능 MS 시스템(O-당단백질체학에만 필요)도 사용할 수 있습니다(예: Q-Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap, Thermo, TIMS-ToF-MS, Bruker 또는 다른 공급업체의 유사한 고성능 질량분석기)
Total Recovery Clear Glass 스크류 바이알 0.9 mLThermoTHC11093563대안 사용 가능
총 회수 투명 유리 스크류 바이알과 일치하는 캡ThermoTHC09150869대안 사용 가능
ReproSil-Pur C18 AQ 수지로 자체 포장된 트랩 LC 컬럼 Dr Maisch, Ammerbuch-Entringen, Germanyr15.aq.s0202입자/기공 크기: 5 μ m/120 &, 길이/내경: 2cm/100 >m. 상업용 C18 트랩 LC 컬럼도 사용할 수 있습니다. 
Software
ByonicProtein Metrics Incv2.6.46 이상상용 글리코펩타이드 및 PTM 검색 엔진, 대부분의 MS 공급업체로부터 LC-MS/MS 원시 데이터 수용
ByosProtein Metrics Incv3.9-7 이상글리코펩타이드 후보의 수동 검사 및 글리칸 MS/MS 스펙트럼 GlycoMod의 자동 주석을 위한 상용 소프트웨어
Expasy오픈 액세스 소프트웨어, 글리코믹스 데이터(https://web.expasy.org/glycomod/) 주석 지원
GlycoWorkBenchEUROCarbDBv2.1오픈 액세스 소프트웨어, 글리코믹스 데이터 주석 및 글라이칸 만화 그리기 지원
RawMeatVAST Scientificv2.1오픈 액세스 소프트웨어, 원시 스펙트럼 데이터에서 글라이칸 전구체 이온의 m/z 추출
SkylineBrendan X. MacLeanv21.2 이상글라이칸의 상대 정량을 위한 오픈 액세스 소프트웨어
XcaliburThermov2.2 이상원시 LC-MS/MS 데이터 탐색용
가능 가능 가능 수 가능 , , , , , . 에서 50% (v/v) 메탄올에 장기간 저장할 수 있습니다. 대체할 수 있습니다.:

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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