방법 논문

엔지니어링 키메라 항원 수용체-비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 곰팡이 감염을 표적으로 하는 자연 살해 세포

DOI:

10.3791/67424

⸱

2024년 10월 4일

 ,  ,  ,  , 
1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 시스템을 사용하여 진균 병원체를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체-자연 살해자(CAR-NK) 세포를 생산하기 위한 transfection 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 항원 특이적 활성화를 평가하기 위해 공학적 세포를 Aspergillus fumigatus 생식관과 공동 배양하고 IFN-γ 분비를 측정했습니다.

초록

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키메라 항원 수용체(CAR) 기반 세포 요법은 혈액 악성 종양 치료에서 인상적인 효능을 보여주었습니다. 최근에는 감염성 질환에 대한 치료법이 개발되고 있지만, 진균 감염을 대상으로 하는 연구는 여전히 부족합니다. 최적의 표적을 식별하고 세포 제품을 최적화하기 위해 키메라 항원 수용체-자연 살해자(CAR-NK) 세포를 엔지니어링하는 방법을 개발하고 곰팡이에 의한 자극에 대한 반응을 평가했습니다. 이 논문은 비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 전이 시스템을 사용하여 곰팡이 표적에 맞춘 CAR-NK 세포를 생성하는 간단하고 강력한 방법을 설명합니다. NK-92 세포는 플라스미드로 인코딩된 CAR 트랜스포존과 함께 minicircle DNA(MC)로 벡터화된 hyperactive transposase SB100X로 transfection됩니다. Transfection 효율은 1주일 후에 유세포 분석을 사용하여 평가됩니다. 기능 검사 전에, 전이유전자를 발현하는 세포는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축되고 1주일 더 배양됩니다. 항원 특이적 활성화를 평가하기 위해 엔지니어링된 세포를 Aspergillus fumigatus 생식관과 최소 6시간 동안 공동 배양합니다. 그 후, 분비된 인터페론 감마(IFN-γ)의 농도는 효소 결합 면역흡착 분석을 사용하여 측정됩니다.

서론

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아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus)는 어디에나 있는 곰팡이로, 평균적인 사람은 매일 100에서 1,000 사이의 분생포자를 흡입합니다1. 화학요법을 받고 있거나 백혈병을 앓고 있는 환자와 같이 후천성 또는 선천성 면역결핍 환자에서 A. fumigatus는 심각한 침습성 앱세르길루스증을 유발할 수 있습니다. 매년 전 세계적으로 200,000명 이상의 사람들이 아스페르길루스증에 걸립니다. 아졸 유도체를 이용한 예방 및 치료를 위해 항진균제를 사용했음에도 불구하고 사망률은 30%에서 95% 사이를 유지하고 있습니다2,3. 또한, 이 치료법은 심각한 부작용이 있으며, A. fumigatus 배양액의 7%는 이미 아졸 내성을 가지고 있습니다4.

키메라 항원 수용체(CAR)로 조작된 T 세포를 사용한 치료는 악성 질환 치료에 임상적 성공을 보였으며 침습성 아스페르길루스증과 같은 감염성 질환 퇴치에서 유망한 전임상 결과를 달성했습니다 5,6,7,8. 앞서 설명한 A. fumigatus 균사의 세포벽에 있는 단백질을 표적으로 하는 Af-CAR-T 세포는 전임상 모델에서 유망한 결과를 보여주었습니다6.

이식편과 숙주병, 사이토카인 방출 증후군 및 신경독성의 위험이 감소하기 때문에 CAR-NK 세포는 급성 감염에 대한 "기성품" 치료제로서 CAR-T 세포의 귀중한 대안이 될 수 있다9. 또한 NK 세포는 항진균 면역 반응에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. A. fumigatus로 자극되면 NK 세포는 IFN-ɣ와 같은 사이토카인과 CCL-3 및 CCL-4와 같은 케모카인을 분비하고 세포독성 과립을 방출합니다10,11.

NK-92 세포주는 유전 공학을 위한 NK 세포의 인기 있는 공급원으로, 비교적 간단한 배양 조건에서 빠른 증식 및 증식의 이점을 제공합니다12. 여러 전임상 연구에서 혈액 종양 및 고형 종양 모두에서 CAR 형질 주입 NK-92 세포의 치료 잠재력을 입증했습니다. 안전성, 효능 및 "기성품" 세포 치료제로서의 잠재적 사용을 조사하기 위해 수많은 임상 시험이 진행 중입니다13.

NK 세포에서 높은 transfection 효율과 안정적인 transgene 발현을 달성하는 것은 어려운 일입니다. 바이러스 방법은 높은 효율성을 약속하지만 후속 발암과 함께 삽입 돌연변이의 위험이 있습니다 9,14. 최신 세대의 잠자는 숲속의 미녀(SB) 트랜스포손 벡터는 안정적인 유전자 전달을 위한 안전하고 강력하며 경제적으로 실행 가능한 시스템을 제공하여 바이러스 및 일시적인 비바이러스 유전자 전달 방법의 한계를 극복합니다15.

따라서 이 프로토콜은 생명을 위협하는 침습성 아스페르길루스증 환자를 위한 "기성품" 치료 옵션으로 잠재적으로 작용할 수 있는 Af-CAR-NK-92 세포 생성을 위한 새로운 방법론을 설명합니다. 이 접근법의 효능은 A. fumigatus 균사로 자극할 때 IFN-ɣ의 생산이 증가한 것으로 예시됩니다.

프로토콜

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여기에 설명된 모든 실험은 멸균 조건에서 수행해야 합니다. 이 프로토콜에서는 두 가지 조건, 즉 (I) 대조군 역할을 할 DNA가 없는 모의 형질주입 및 (II) 앞서 설명한 Af-CAR6을 사용한 CAR 형질주입을 보여줍니다. Af-CAR 플라스미드는 CAR의 다운스트림에 절단된 표피 성장 인자 수용체(EGFRt) 서열을 포함하고 있으며, 이는 transfection marker로 사용될 것입니다(보충 그림 S1). 각 조건에 대해 4 × 106 NK-92 셀이 필요합니다.

1. NK-92 세포 배양

  1. 형질주입 1일 또는 이틀 전, 다음 조성으로 신선한 세포 배양 배지를 준비합니다: 75%(v/v) 알파-MEM 배지(뉴클레오시드 포함) + 12.5%(v/v) 열 비활성화 소 태아 혈청(FBS) + 12.5%(v/v) 열 비활성화 말 혈청 + 2mM L-글루타민.
  2. 최소 107 NK-92 세포를 5 × 105 cells/mL의 세포 밀도로 재현탁합니다.
  3. IL-2를 150 UI/mL의 농도로 세포 현탁액에 추가합니다.
  4. 37°C의 가습된 인큐베이터에서 5%CO2로 세포를 배양합니다.
    참고: IL-2는 5ng/mL의 최종 농도에서 사용할 수 있습니다.

2. 비바이러스 트랜스펙션(Non-viral transfection)

  1. 현미경으로 세포의 품질을 확인하십시오. 세포 클러스터의 현탁액과 명확한 배경은 건강한 세포 배양을 나타냅니다.
  2. 6-well plate에 각 조건에 대해 well당 2mL의 세포 배양 배지를 추가합니다. 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에 5% CO2로 놓습니다.
    참고: 항생제는 형질주입 후 세포 생존력을 감소시킬 수 있습니다. 매체를 항생제가 없는 상태로 유지하십시오.
  3. 세포를 계수하고 (예: Trypan Blue 염색)을 사용하여 세포 생존율을 확인합니다.
  4. 8 × 106 NK-92 세포를 15mL 원추형 바닥 튜브로 옮깁니다. 200 × g 에서 5분 동안 가속 및 감속 3으로 원심분리기. 다음의 모든 원심분리 단계에 이 프로그램을 사용하십시오.
  5. 원심분리 중에 1.5mL 반응 튜브 2개를 준비합니다. Af-CAR용 DNA(8μg의 Plasmid-DNA 및 4μg의 SB100X Mini Circle, 표 1)를 튜브 중 하나에 피펫으로 넣습니다. 두 번째는 DNA가 없는 상태로 Mock 컨트롤이 되도록 유지합니다.
  6. 원심분리기가 준비되면 상층액을 조심스럽게 버리고 세포가 들어 있는 튜브에 최대 15mL의 예열된 인산염 완충 식염수(PBS)를 채웁니다.
  7. 원심분리기(2.4단계).
  8. 원심분리 중에 각 튜브에 3mL의 전해 완충액을 추가하여 각 조건에 대해 하나의 transfection system 튜브를 준비합니다. 첫 번째 튜브를 피펫 스테이션에 넣습니다.
  9. 원심분리기가 준비되면 상층액을 부드럽게 버리고 세포 펠릿을 200μL의 재현탁액(100μL/4 × 106 개 세포)에 재현탁합니다.
    참고: 세포를 15-30분 이상 재현탁액에 방치하면 세포 생존율과 transfection 효율이 저하되므로 피하십시오.
  10. 두 개의 반응 튜브 각각에 100μL의 세포 현탁액을 추가합니다. 부드럽게 섞는다.
    알림: 기포는 아크를 일으켜 세포를 사멸시키므로 피펫팅 중 기포를 피하십시오.
  11. 첫 번째 반응 튜브의 DNA-세포 혼합물을 transfection system 피펫으로 피펫하고 피펫 스테이션에 배치된 튜브에 피펫을 수직으로 삽입합니다.
    알림: 팁이 제대로 맞는지 확인하십시오.
  12. 첫 번째 펄스를 1,650V 로 설정하고 펄스 시간을 20ms 로 설정하고 Start를 누릅니다.
  13. 완료 후 두 번째 펄스를 500V 로 설정하고 펄스 시간을 100ms로 설정합니다. 시작을 누릅니다.
  14. 완료 후, 피펫 스테이션에서 피펫을 천천히 제거하고 즉시 세포를 예열된 세포 배양 배지 2mL를 포함하는 준비된 배양 플레이트의 한 웰로 옮깁니다(단계 2.2 참조). 플레이트를 원 방향으로 부드럽게 움직여 세포가 고르게 분포되도록 합니다.
  15. Mock 샘플의 경우, DNA가 없는 반응 튜브에서 세포 현탁액 100μL를 채취하고(2.9단계 참조) 새 튜브와 새 피펫 팁을 사용하여 2.11단계부터 2.14단계까지 동일한 절차를 반복합니다.
  16. 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2로 플레이트를 배양합니다.
  17. 30분 배양 후 최종 농도 150 UI/mL에서 IL-2를 첨가합니다.

3. 유세포 분석을 사용한 transfection 효율 확인

  1. 1주일 동안 이틀에 한 번씩 세포를 배양하고 분할한 후 각 조건의 1-5개 × 105 개의 세포를 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브에 넣습니다.
  2. 1mL의 완충액(PBS + 0.5%(v/v) FBS + 2mM EDTA)를 첨가하여 세포를 세척합니다. 분리기를 분리하고 상층액을 버립니다.
  3. 세포 펠릿을 50μL의 완충액에 재현탁합니다. 1μL의 7-AAD를 추가하여 죽은 세포를 검출합니다.
  4. transfection된 세포를 염색하기 위해 5μL의 anti-tEGFR-Alexa fluor 647 항체를 추가합니다.
  5. 4 °C에서 20분 동안 배양합니다.
  6. 셀을 세척합니다(3.2단계 참조).
  7. 세포 펠릿을 200μL의 완충액에 재현탁합니다.
  8. 유세포 분석기에서 샘플을 측정합니다.
    참고: transfection 효율이 만족스럽지 않은 경우, transgene-expressing cells의 enrichment를 진행한다.

4. MACS(Magnetic-activated Cell Sorting)에 의한 전이유전자 발현 세포의 농축(Enrichment of transgene-expressing cells)

참고: 최적의 결과를 얻으려면 8-10 × 106 셀로 프로토콜을 시작하십시오. 모든 원심분리 단계는 4°C에서 수행됩니다.

  1. 3.2단계에서 설명한 대로 버퍼를 준비합니다. 15mL 원추형 바닥 튜브에 완충액을 사용하여 1-2 × 106/100 μL의 농도로 세포를 희석합니다.
  2. 1-2 × 106 세포당 1 μL의 항-EGFRt-비오틴을 첨가하고 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 용액이 고르게 분포되도록 합니다.
  3. 4°C에서 25분 동안 배양한 다음 튜브에 최대 10mL의 완충액을 채웁니다.
  4. 원심 분리기. 상등액을 버리십시오.
  5. 8 μL/1 × 106 셀의 콜드 버퍼를 추가합니다.
  6. 1 × 106 세포당 2 μL의 항비오틴 마그네틱 비드를 추가합니다.
  7. 4 °C에서 15분 동안 배양합니다.
  8. 최대 10mL까지 완충액을 채워 세척합니다.
  9. 원심 분리기. 상층액을 버리고 세포를 500μL의 완충액에 재현탁합니다.
  10. LS 컬럼을 MACS 마그넷에 놓고 3mL의 버퍼로 세척합니다.
  11. 버퍼가 컬럼을 통해 완전히 마이그레이션되는 즉시 cell suspension을 추가합니다.
  12. 각각 3mL의 완충액으로 컬럼을 3회 세척합니다.
  13. 자석에서 컬럼을 제거하고 깨끗한 15mL 원뿔형 바닥 튜브에 넣습니다.
  14. 컬럼에 5mL의 버퍼를 추가합니다. 플런저를 사용하여 가능한 한 빨리 EGFR 양성 세포를 씻어냅니다.
  15. 며칠 동안 세포를 배양하십시오. 그런 다음 유세포 분석으로 효율성을 확인합니다.

5. 기능 테스트

참고: 향후 실험을 위해 RPMI + 20% FBS 매체를 준비하고 사용하십시오.

  1. 1일차 - Aspergillus fumigatus conidia 파종
    1. 배지에서 2.5 ×10 5 conidium/mL의 농도로 A. fumigatus conidia 현탁액을 준비합니다.
    2. 96웰 배양 플레이트에서 웰당 분생포자 현탁액 100μL를 피펫팅하고 25°C에서 16시간 동안 배양합니다.
      참고: 잠복기가 지나면 분생포자가 발아합니다(그림 1).
  2. 2일차 - CAR NK-92 세포와의 공동 배양
    1. 매체로 Mock 및 Af-CAR NK-92 셀을 2x 세척합니다.
    2. 웰당 100μL의 배지에 5 × 104 개의 세포를 추가하여 2:1의 효과기 대 타겟 비율로 곰팡이와 공동 배양합니다(그림 2).
    3. 양성 대조군의 경우 100μL의 배지에 웰당 1ng의 PMA와 100ng의 이오노마이신을 추가합니다. medium의 셀은 음의 대조군으로만 사용하십시오.
    4. 37°C의 가습된 CO2 인큐베이터에서 최소 6시간 동안 플레이트를 배양합니다.
    5. 플레이트를 300×g에서 5 분 동안 원 심분리합니다.
    6. 각 웰 100μL를 수확합니다. 바닥을 만지지 마십시오. 상등액을 반응 튜브로 옮깁니다.
      참고: 상등액만 피펫으로 주입하고 성장한 곰팡이는 피펫으로 처리하지 않도록 하십시오. 의심스러우면 다른 원심분리 단계를 추가하십시오.
    7. 제조업체의 지침에 따라 IFN-ɣ ELISA를 수행하거나 s를 보관하십시오.amp사용할 때까지 -80 °C에서 les를 보관하십시오.

결과

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transfection, recovery, enrichment 및 expansion을 포함한 Af-CAR NK-92 세포를 생성하는 전체 과정은 약 14일이 소요됩니다. transfection 후, 세포는 2일에 한 번씩 배양되고 분할됩니다. transfection 후 2일 후 첫 번째 분열 동안 세포 생존율이 감소할 수 있습니다. 일반적으로 세포는 형질주입 후 4일 후에 회복되고 증식을 시작하며 48시간의 배가 시간이 걸립니다.

회수 후 transfection 효율이 측정되며 10-20%에 이를 것으로 예상됩니다( 그림 3에 표시된 대표적인 결과). MACS를 통한 EGFR 양성 세포의 농축은 Af-CAR NK-92 세포의 비율을 95% 이상으로 증가시킵니다( 그림 4에 표시된 대표적인 결과).

95% 이상의 Af-CAR 세포를 배양한 배양액이 기능 분석에 사용되었습니다. 여기에서 A. fumigatus 생식관과 세포를 6시간 동안 공동 배양하고 활성화 마커로 IFN-ɣ 분비를 측정했습니다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 Af-CAR 세포는 Mock NK-92 세포(평균 = 75.6 ±± 19.5 pg/mL)에 비해 유의한 사이토카인 분비(평균 = 340.6 86.5 pg/mL)를 보였으며, 이는 Af-CAR 세포의 활성이 상당히 높았음을 나타냅니다(p-값 = 0.03).

figure-results-1
그림 1: Aspergillus fumigatus의 생식관.배양 16시간 후 A. fumigatus의 현미경 이미지. 생식관/작은 균사가 관찰되고 우물 주변에 균일하게 분포합니다. 스케일 바 = 400μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: Aspergillus fumigatus 생식관과 NK-92 세포의 공동 배양. 공동 배양의 현미경 이미지. NK-92 세포는 클러스터를 형성하고 A. fumigatus 생식관과 접촉합니다. 스케일 바 = 400μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-3
그림 3: 형질 주입 마커 EGFR에 대한 염색을 통해 평가한 형질 주입 효율. 5일째, 전기천공 후 NK-92 세포를 7-AAD 및 항-EGFR로 염색했습니다. 결과는 (A) Mock 및 (B) Af-CAR NK-92 세포에 대한 하나의 대표 실험에 대해 표시됩니다. 왼쪽 열은 셀 크기 대 셀 세분성의 점도를 보여줍니다. 게이트는 NK-92 셀에 설정됩니다. 죽은 세포는 7-AAD 라벨링(두 번째 열)을 사용하여 outgate됩니다. 살아있는 EGFR+ 세포의 비율은 세 번째 열에 표시되어 있습니다. 약어: EGFR = 표피 성장 인자 수용체; 7-AAD = 7-아미노악티노마이신 D; CAR = 키메라 항원 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 전이유전자를 발현하는 NK-92 세포를 농축한 후 세포 표면 염색 결과. 왼쪽에는 모의 셀이 표시됩니다. 오른쪽에는 Af-CAR-NK 셀이 표시됩니다. 빨간색 히스토그램은 염색되지 않은 세포를 나타냅니다. 파란색 히스토그램은 해당 염색된 세포를 나타냅니다. 게이트는 EGFR+ 셀에 설정됩니다. 숫자는 양성 세포의 백분율을 보여줍니다. 약어: EGFR = 표피 성장 인자 수용체; CAR = 키메라 항원 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: Aspergillus fumigatus 생식관에 의해 활성화된 NK 세포의 사이토카인 분비. 다이어그램은 공동 배양 6시간 후 ELISA로 측정한 진균과의 공동 배양에서 Af-CAR 및 Mock 세포의 IFN-ɣ 분비 결과를 나타냅니다. 표시된 데이터는 독립적으로 수행된 3개의 실험(n = 3)의 평균 ± SD입니다. GraphPad Prism 10을 사용한 Welch의 t-검정으로 계산한 p-값, * p < 0.05. 약어: NK = 자연살해자; IFN-ɣ = 인터페론 감마; CAR = 키메라 항원 수용체; ELISA = 효소 결합 면역흡착 분석법. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

이름회사재고 집중도참조
트랜스포사제SB100X 미니 서클플라스미드팩토리1 μg/μL19
트랜스포손Af-CAR 플라스미드자체 제작1 μg/μL6

표 1: 이 프로토콜에 사용된 DNA.

보충 그림 S1: Af-CAR 트랜스포손의 플라스미드 맵: 플라스미드 벡터의 개략도 및 CAR 트랜스포손의 설계. 약어: EF1 = 연신율-1 알파 프로모터; ORI = 복제의 박테리아 기원; LIR = 왼쪽 반전 반복; RIR: 오른쪽 반전 반복; Cyto = 세포질; Tm = 막횡단. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제공된 프로토콜은 비바이러스성 잠자는 숲속의 미녀 전이(transposon) 시스템을 사용하여 곰팡이 병원체를 표적으로 하는 CAR-NK 세포를 생성하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 방법은 큰 전이유전자의 안정적이고 영구적인 삽입을 가능하게 하며, 이는 세포의 확장을 가능하게 하여 추가 분석에 필요한 양을 얻을 수 있습니다14,16.

transfection의 성공에 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 주요 요인은 세포 수와 생존력, 펄스 강도 및 지속 시간, DNA의 품질 및 수량17을 포함합니다. 시작하기 전에 세포의 건강 상태를 평가하여 최소 90%의 생존력을 보장하는 것이 중요합니다. 상승된 펄스 강도가 세포 집단의 transfection 효율을 향상시킬 수 있음이 입증되었습니다. 그러나 이 접근 방식은 세포 생존율을 크게 감소시킬 수도 있습니다. 세포가 과잉이고 DNA의 수량 또는 질이 제한된 경우, 플라스미드를 성공적으로 흡수하는 세포의 수가 부족할 수 있습니다17. 그럼에도 불구하고, 고농도의 DNA는 독성이 있고 세포 생존력을 감소시키는 것으로 입증되었습니다18.

이전 연구에서는 transfection 효율이 더 높았지만 일시적인 단백질 발현에만 초점을 맞췄습니다17. 대조적으로, 당사의 프로토콜은 안정적인 전이유전자 삽입을 보장합니다. 낮은 transfection 효율을 해결하기 위해 positive transfection된 세포의 농축을 구현하고 약 95%의 CAR 발현 세포를 달성했습니다. 그러나 이로 인해 제작 시간이 ~1주일로 늘어났습니다. 더 짧은 생산 시간이 필요한 경우, 트랜스포손 DNA는 미니서클로서 전달될 수 있으며, 이는 형질주입 효율을 향상시킬 수 있고 농축 단계19에 대한 필요성을 제거할 수 있다. 그럼에도 불구하고 세포 회수 및 증식을 위해 생산 시간을 <1주로 단축할 수는 없습니다.

침습성 아스페르길루스증의 급성 특성을 감안할 때, "기성품" 세포 요법이 도움이 될 것입니다. 환자로부터 세포를 분리하고 일차 세포를 확장하는 것과 관련된 과제와 비용으로 인해 NK-92는 CAR-NK 세포 생산을 위한 편리한 세포주로서 인기를 얻었습니다20. NK-92 세포는 일반적으로 견고하고 IL-2가 있는 상태에서 빠르게 증식하여 비교적 짧은 기간에 많은 세포량을 얻을 수 있습니다. 이러한 장점을 고려하여 NK-92 세포를 유전자 엔지니어링하는 프로토콜을 개발하여 고순도의 CAR-NK 세포 제품을 안전하게 transfection하고 준비할 수 있음을 입증했습니다. 이 프로토콜은 1차 CAR-NK 세포를 준비하기 위해 조정될 수 있지만 몇 가지 수정을 고려해야 합니다. 여기에는 펄스의 수와 강도, 사용되는 DNA의 양을 최적화하고 적절한 확장 프로토콜을 수립하는 것이 포함됩니다. 프로토콜에 대한 모든 수정은 효능을 보장하기 위해 철저한 조사가 필요합니다. 그럼에도 불구하고, 당사의 프로토콜은 향후 실험에서 primary NK cell에 적용할 수 있는 기본 템플릿을 제공합니다.

요약하면, 안정적인 Af-CAR-NK 세포를 생산하기 위한 이 혁신적인 transfection 프로토콜은 다른 질병을 표적으로 하는 데 사용할 수 있는 효율적이고 재현 가능한 방법입니다. 또한 다양한 항원을 표적으로 하는 새로운 CAR을 스크리닝하는 비용 효율적인 방법으로 사용할 수 있습니다.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.H.: 특허 출원에 대한 발명가 및 CAR 기술과 관련된 특허를 부여받았으며 업계에 부분적으로 라이센스가 부여되었습니다. 공동 창립자 겸 지분 소유자인 T-CURX GmbH, 뷔르츠부르크. 연사 명예: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. 연구 지원: BMS. M. B.는 제약회사 "Eli Lilly and company"의 여행 지원을 보고했는데, 이는 본 연구와 관련이 없습니다. 다른 저자는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트에 대한 자금 및 지원은 Wilhelm Sander Stiftung, 프로젝트 2020.017.1 to M.H. 및 J.L.에서 제공했습니다. Deutsche Forschungsgemeinschaft (Collaborative Research Center/Transregio 124 Pathogenic fungi and their human host: Networks of interaction-FungiNet; 프로젝트 A8 to M.H. and H.E.).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 ML 원뿔형 바닥 튜브Greiner Bio-One188271PP, 17/120 MM, CELLSTAR, STERILE
50 ML 원뿔형 바닥 튜브Greiner Bio-One227270PP, 30/115 MM, CELLSTAR, STERILE
6 및 96-Well- 세포 배양 플레이트Corning Inc. LifeSciences83-3736/ 83-3474TC 처리된 다중 웰 플레이트, 평평한 바닥, 최적의 세포 부착을 위해 처리, 감마선 조사로 멸균, 비발열성
7-AAD (7-Aminoactinomycin D)BD Biosciences559925유세포 분석 분석에서 생존 불가능한 세포를 배제하기 위한 사용하기 쉬운 핵산 염료
Alexa Fluor 647 anti-human EGFRAntibody Biolegend352918Clone AY13
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637UltraPure MicroBeads conjugated to monoclonal mouse anti-biotin 항체
Aspergillus fumigatusATCC46645
생물권 필터 팁 (20 및 100 μ 엘) 사르슈테트70.3030.365 / 70.3030.275
둘베코&프라임; s 인산염 완충 식염수(PBS)시그마-알드리치D8537  수정됨, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합, 내독소, 테스트
ELISA MAX 디럭스 세트 인간 IFN-&감마;Biolegend430104
에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 용액 (EDTA)Sigma-AldrichE7889분자생물학용, 0.5  H2O, DNase, RNase, NICKase 및 프로테아제의 M, 검출되지 않음, 0.2 μ M이 필터링되었습니다.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003
FACS Rinse SolutionBD Bioscience340346
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524멸균 필터, 세포 배양에 적합, 사용 전 열 비활성화
Gibco, MEM α, 뉴클레오시드써모피셔 Scientific22571020페놀 레드, 리보뉴클레오시드, 디옥시리보뉴클레오시드, 소듐바이카보네이
호스 세럼Thermo Fisher Scientific16050122멸균 여과, 사용 전 열 비활성화
Human IL-2 IS, 연구 등급Miltenyi Biotec130-097-742연구 등급. ED50은 &le입니다. 0.3 ng/mL, &ge의 활성에 해당; 3 &번; 106 IU/mg입니다.
IonomycinSigma-AldrichI0634-1MG, 사이토카인 분비에 대한 양성 대조군으로 사용됨 
L-글루타민시그마-알드리치W368401세포 배양 MACS
LS 컬럼Miltenyi Biotec130-042-401  컬럼 및 플런저, 멸균 포장
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  &뮤; L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096 Resuspension Buffer R, 전해 버퍼 E2, 100 μ L 네온 팁, 네온 전기천공법 튜브
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MG는 사이토카인 분비에 대한 양성 대조군으로 사용됩니다 
폴리스티렌 둥근 바닥 튜브,유세포 분석에 사용되는BD BioscienceS-452400
반응 튜브, 1.5MLGreiner Bio-One7,26,90,001PP, 투명, 캡 부착, 주입 눈금 포함. 사용 전에 멸균 처리됩니다. 
RPMI 1640 매체, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  페놀 레드, HEPES, 멸균 여과
TipOne 1000 μ L XL 졸업 필터 팁StarLabS1122-1730
Equipment
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2 인큐베이터 C60 Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX 마이크로플레이트 워셔 Tecan
NanoQuant Infinite M200 ProTecan
Neon Transfection SystemInvitrogen
Pipettes Eppendorf
Quadro MACS 분리기 밀테니 바이오텍
트 Streptomyces conglobatus에서 나온 5mL

참고문헌

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CAR NKNK 92Aspergillus Fumigatus

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