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방법 논문

성체 제브라피쉬에 최적화된 정맥 주사

2.8K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67463

⸱

2024년 12월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, School of Clinical Medicine, LKS Faculty of Medicine, The University of Hong Kong, 2ZeBlast Technology Limited, Hong Kong Science Park, 3Centre for Oncology and Immunology, Hong Kong Science Park

이 논문에서

요약

여기에서는 성체 제브라피쉬에 세포 또는 약리학적 제제를 정맥 주사하여 세포 생착을 강화하고 치료된 제브라피시의 생존율을 높이기 위한 최적화되고 효과적인 프로토콜을 제시합니다.

초록

정맥 주사(IV) 주사는 포유류 연구 모델에서 물질의 전신 전달을 달성하기 위해 가장 효과적이고 일반적으로 사용되는 방법으로 널리 인식되고 있습니다. 그러나 약물 전달, 줄기 세포 이식, 재생 및 암 연구를 위한 성체 제브라피쉬에 대한 적용은 작은 신체 크기와 복잡한 혈관으로 인한 문제로 인해 제한되어 왔습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 과거에 성체 제브라피시의 줄기세포 이식을 위해 심장 내 및 역안와(RO) 주입과 같은 대체 주입 기술이 연구되었습니다. 그러나 이러한 기술에는 세심한 주사 기술이 필요하거나 사망 위험이 증가하는 등의 단점이 있습니다.

이 연구에서는 성체 제브라피쉬에 특별히 맞춘 정교하고 최적화된 IV 주입 절차를 개발하여 제브라피시의 고유한 해부학적 구조와 관련된 문제를 해결했습니다. 이 기술의 효과를 입증하기 위해 Tg(mpo: EGFP) 어류의 전체 신장 골수 세포와 FITC-덱스트란 염료를 성체 캐스퍼 어류에 성공적으로 IV 주입했습니다. 형광 현미경을 사용하여 주입된 세포와 염료를 후속 시각화한 결과, 제브라피시 내에서 성공적인 전달과 생착이 확인되었습니다. 또한, 심장내 및 RO 주사와 비교하여 IV 주사가 처리된 제브라피쉬의 생존율과 생착 효율을 향상시켰다는 것을 입증했습니다. 이 접근 방식은 물질의 정확한 전달 및 국소화를 가능하게 하며 성체 제브라피시를 사용한 대규모 약물 및 화학 스크리닝에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 또한 주입된 세포와 염료를 시각적으로 추적할 수 있는 기능은 생착, 이동 및 숙주 조직과의 상호 작용에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 제브라피시 모델의 치료 효과 및 생물학적 과정을 보다 포괄적으로 평가할 수 있습니다.

서론

제브라피시(Danio rerio)는 주로 인간과의 유전적 유사성으로 인해 생물의학 연구에서 가치 있는 모델 유기체로 부상했으며, 인간 유전자의 70% 이상이 제브라피시 1,2를 가지고 있습니다. 이러한 유전적 유사성은 제브라피시의 작은 크기, 빠른 발달 주기, 광범위한 유전자 조작 능력과 결합되어 과학적 탐구를 위한 강력한 도구가 됩니다. 이러한 특성은 세포 이식, 약물 전달 및 세포 추적과 관련된 실험에 특히 유리합니다. 또한 투명한 유충과 캐스퍼 제브라피시와 같은 특정 색소 돌연변이의 광학적 선명도는 이식된 세포 또는 물질을 정밀하게 시각화할 수 있어 기존 동물 모델에 대한 보다 효율적이고 비용 효율적인 대안을 제공합니다.

제브라피쉬는 암 이식 모델을 개발하고 신경교종, 흑색종, 췌장 종양 및 백혈병과 같은 심각한 질병에 대한 약물 검사를 수행하는 데 널리 사용됩니다 3,4,5,6,7,8,9,10. 일반적으로 이러한 모델은 유충의 미성숙한 면역 체계와 고유한 투명성을 활용하기 위해 유충 단계에서 시작되며, 이는 주입 과정을 단순화하고 단기 연구의 타당성을 향상시킵니다. 그러나 유충을 사용하면 생착 및 치료적 개입을 평가하는 기간이 제한된다 7,11. 이러한 실험 프로토콜을 성체 제브라피시로 전환하면 더 복잡한 주입 절차, 생착 효율 감소, 폐사율 증가, 개별 반응의 가변성 증가와 같은 문제가 발생합니다. 이러한 과제는 특히 관찰 기간이 연장되어야 하는 성체 제브라피시와 관련된 연구에서 주입 및 물질 전달 기술 개선의 필요성이 매우 중요하다는 점을 강조합니다.

역사적으로 심장내12 및 역안와(RO) 주사13는 성체 제브라피시의 약물 전달 및 세포 이식의 주요 방법이었습니다. 심장에 물질을 직접 주입하는 심장 내 주사는 약물의 즉각적인 전신 순환을 보장하지만 잠재적인 심장 손상 및 높은 사망률을 포함한 심각한 위험과 관련이 있습니다. 반면에, 눈 뒤의 정맥동으로 물질을 전달하는 RO 주입 역시 빠른 전신 분포를 촉진하지만 물고기에게 스트레스를 줄 수 있고 높은 정밀도의 실행을 요구할 수 있다14. 생쥐와 쥐의 전신 물질 전달을 위해 잘 확립된 IV 주사는 이러한 모델에서 약동학 연구, 약물 효능 평가 및 치료 개입에 매우 중요합니다 15,16,17,18. 최근에는 제브라피시 연구에서 정맥 주사가 두각을 나타내고 있으며, 특히 제브라피시 유충의 선천면역 반응 19,20 및 급성 신장 손상21 에 대한 연구에서 두각을 나타내고 있습니다. 그러나 성인 제브라피시에 대한 적용은 여전히 제한적입니다.

이 연구에서는 성체 제브라피쉬를 위해 특별히 맞춤화된 IV 주사 절차를 개발하고 최적화하여 생존율, 정밀도 및 전달 효율성을 크게 개선했습니다. 이 방법을 시각적으로 시연하고 이 정교한 기술을 사용하여 자세한 프로토콜을 제공합니다. Tg(mpo: EGFP) 어류의 전체 신장 골수(WKM) 세포와 FITC-덱스트란 염료를 성체 캐스퍼 어류에 IV 주사를 성공적으로 투여했으며, 형광 현미경으로 전달 및 생착을 확인했습니다. 우리의 연구 결과는 개선된 IV 주입 기술이 기존의 심장 내 및 RO 방법에 비해 더 효율적이고 일관성이 있음을 보여줍니다. 과학 연구에서 제브라피시의 사용이 계속 확대됨에 따라 이 개선된 IV 주사 기술의 채택은 질병 발병에 대한 이해를 높이고 새로운 치료 접근법의 개발을 가속화할 것입니다.

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프로토콜

모든 동물 절차는 홍콩 대학교(HKU)의 실험실 및 연구 동물 사용 위원회(CULATR)의 승인을 받았습니다.

1. 사출 재료의 준비

  1. 세포 현탁액 배지 준비: 0.9x PBS + 5% 소 태아 혈청(FBS) + 1% 페니실린/스트렙토마이신(Pen/Strep).
  2. 해밀턴 주사기와 부속 바늘(34G, 길이 10mm, 용량 10μL, 재료 표 참조)을 270-280nm 파장의 자외선 아래에서 살균하고 2시간 동안 노출시킵니다.
  3. 멸균된 면봉, 폼 패드 및 티슈를 준비합니다.
  4. 트리카인을 멸균된 생선 물과 함께 최종 농도 0.2mg/mL로 희석하여 마취 혼합물을 준비합니다.
  5. 캐스퍼 피쉬의 WKM 세포 이식을 위해 이식 2일 전에 25Gy의 치사량 이하방사선 조사 용량을 각각 12.5Gy의 두 세션으로 나누어 같은 날 7-8시간 간격으로 투여합니다. 조사 과정을 위해 물고기 물이 들어있는 100mm 페트리 접시에 5-10 마리의 성인 물고기를 넣고 감마 조사기에 노출시킵니다.
    참고: 이 선량은 캐스퍼 피쉬를 30일 동안 모니터링하여 최대 35Gy의 다양한 방사선 조사 수준에 노출시킨 후 생존 분석을 기반으로 치명적이지 않은 것으로 확인되었습니다(그림 1A). 정확한 노출 시간은 조사기의 설정에 따라 보정해야 합니다. 약물 전달만 포함하는 절차에는 방사선 조사가 필요하지 않습니다.
  6. 실험실 오토클레이브 증기 멸균기를 사용하여 처리된 물고기를 수용하기 위한 물고기 물을 살균하여( 재료 표 참조) 감염을 예방하고 주입 후 물고기의 안전한 회복 환경을 보장합니다.
    참고: 멸균 공정은 사용되는 특정 오토클레이브 장치에 맞게 조정되며, 당사는 어수를 준비하기 위해 액체 용액을 고압증기멸종하는 방법에 대한 제조업체의 지침을 준수합니다.
  7. 바늘 세척 완충액 준비: 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 75% 에탄올과 초순수가 담긴 여러 튜브.
  8. 이전에 준비된 세포 현탁액(5% FBS 및 1% Pen/Strep이 있는 0.9x PBS)에 FITC-Dextran(분자량: 10,000)을 용해하여 이식 완충액을 준비합니다. 농도를 100μg/mL로 조정합니다.
    참고: 이 버퍼는 물고기당 2μL의 계획된 부피로 주입에 사용됩니다.

2. 이식을 위한 전체 신장 골수의 준비

  1. 필요한 수의 Tg(mpo: EGFP) 물고기를 0.4mg/mL 트리카인 용액에 담가 안락사시키고 수술 운동이 멈춘 후 최소 10분 동안 용액에 남아 있도록 합니다.
  2. Tg(mpo: EGFP) 물고기를 해부하여 앞서 설명한 바와 같이 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브 내의 세포 현탁액(KM)을 분리하고 전달합니다22.
  3. 40μm 나일론 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 피펫팅하고 필터링하여 KM 셀을 분해합니다.
  4. 현탁액을 500 × g 에서 8분 동안 원심분리합니다.
  5. 상층액을 버리고 펠릿을 500μL의 세포 현탁액에 재현탁합니다.
  6. 세포 현탁액의 10 μL 분취액이 있는 자동 카운터를 사용하여 세포를 계수합니다.
  7. 500 × g 에서 8분 동안 다시 원심분리기를 사용합니다.
  8. 이식 완충액을 사용하여 세포 농도를 150,000 cells/μL로 조정합니다.

3. 주입 절차

  1. 주사 전에 Hamilton 주사기를 3-4x 에탄올로 75배 철저히 세척하십시오. 주사기를 초순수로 3-4x 헹구어 에탄올 잔여물을 제거합니다.
  2. 제브라피시가 완전히 마취될 때까지 마취 혼합물에 담그어 마취를 시행하며, 이는 움직임 감소와 반사 반응 상실로 입증됩니다. 물고기가 진정되면 등쪽이 위를 향하고 머리가 왼쪽을 향하도록 놓습니다(그림 1B). 깨끗하고 축축한 티슈 페이퍼에 물고기를 조심스럽게 올려 놓으면 주사를 위해 물고기를 안정시키는 데 도움이 됩니다. 물고기가 마르지 않도록 조직이 충분히 촉촉한지 확인하되 미끄러질 정도로 젖지 않도록 하십시오.
  3. 해밀턴 주사기를 단단히 잡고 바늘을 일차 혈관(꼬리 정맥)에 대해 ~45°로 각도를 조정하여 주변 조직의 손상을 최소화하면서 효과적으로 조준합니다. Capser 제브라피쉬의 경우 정확한 바늘 배치를 위해 반투명 몸체를 통해 볼 수 있는 선박 부분을 목표로 합니다(그림 1B). 피부가 착색된 야생형 제브라피시(Tubingen, TU)의 경우, 일차 혈관 영역에서 신체 축을 따라 항문 뒤쪽에 있는 1차 혈관을 목표로 합니다(그림 1B). 지정된 용기에 바늘을 부드럽고 부드럽게 삽입하고, 스트레스를 최소화하기 위해 천천히 주사(2μL)를 투여하고, 물질의 최적 흡수를 보장하고, 주사 후 출혈을 제어하기 위해 면봉으로 10초 동안 해당 부위에 부드러운 압력을 가합니다.
  4. 현미경으로 관찰하여 GFP 신호의 존재를 확인하고 주입의 효과를 확인하십시오. 세포 또는 염료가 혈관 내에서 녹색 신호로 나타나는지 확인합니다(그림 2A).
  5. 물고기가 정적 탱크로 옮겨질 때까지 10분 동안 주입 후 갓 살균된 생선 물에서 회복되도록 합니다.
  6. 다른 시약을 주입하는 사이에 앞에서 설명한 대로 바늘을 청소합니다.
  7. 세포 응집을 방지하려면 10분마다 세포 현탁액을 튕겨 세포를 다시 현탁시킵니다.
  8. 처리 기간 동안 정적 수질 조건에서 15L 수조에 최대 4마리의 이식된 물고기를 유지합니다. 또는 이식된 물고기를 1L 정적 탱크에 개별적으로 수용합니다. 탱크에 산소 펌프를 장착하고 감염 위험을 최소화하기 위해 매일 물을 갈아줍니다.
  9. 생착 속도를 평가하기 위해 이식 후 약 14일 후에 물고기의 유세포 분석을 통해 GFP 발현을 모니터링하고 평가합니다. 생존율을 정확하게 계산하기 위해 물고기의 일일 사망률을 기록하십시오. 생착 분석을 위해 일원 ANOVA를 수행하고 생존 분석을 위해 Log-rank 검정을 수행합니다.

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결과

성체 캐스퍼 피쉬에서 다양한 주입 방법의 효과와 정밀도를 평가하기 위해 심장 내, RO 및 IV 기술을 사용하여 비교 분석을 수행했습니다(그림 2A). Tg(mpo: EGFP) 어류의 다양한 WKM 세포를 주입하고, 각각을 1 × 105 및 3 × 105 세포의 농도로 FITC-덱스트란 염료와 혼합했습니다. 각 방법의 성공은 주입 후 GFP 신호 존재의 즉각적인 현미경 평가를 통해 결정되었습니다. 그 결과 여러 가지 방법으로 전달 성공률에 상당한 차이가 있는 것으로 나타났습니다. IV 주입 방법은 43마리의 물고기 중 41마리에서 GFP 신호가 감지되어 가장 높은 효과를 보여주었습니다. 대조적으로, RO 방법은 37마리의 물고기 중 3마리에서만 성공적인 주입이 관찰되는 등 제한적인 성공을 보였습니다. 심장 내 방법은 40마리의 물고기 중 11마리에서 성공적인 분만을 달성했습니다(

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토론

이 연구에서는 세포 또는 약물 전달의 정밀도와 일관성을 향상시키기 위해 성체 제브라피쉬에 맞는 IV 주사 프로토콜을 개발했습니다. 이 방법의 중요한 요소는 물질의 정확한 투여에 중요한 1차 정맥을 지역화하고 시각화하는 능력입니다. 최적의 선박 가시성을 위해 반투명 캐스퍼 제브라피시 균주가 권장되지만, 가시성과 정확성을 위해 적절하게 조정된 경우 당사의 프로토콜은 다양한 성체 제브라피시 균주와 함께 사용할 수 있도록 조정할 수 있습니다. 혈관 손상을 최소화하고 효과적인 물질 운반을 보장하기 위해서는 적절한 바늘 게이지를 선택하는 것이 필수적이었습니다. 또한 깨끗하고 산소가 잘 공급되는 물을 유지하는 것을 포함하여 포괄적인 주사 후 관리에 우선순위를 두었습니다. 이러한 관행은 주입 과정을 간소화했을 뿐만 아니라 제브라피시의 건강과 생존을 크게 개선하여 보다 신뢰할 수 있고 재현 가능한 실험 결과를 도출했습니다.

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

홍콩대학교(University of Hong Kong)의 비교의학연구센터(Centre for Comparative Medicine Research, CCMR)의 제브라피시 시설(Zebrafish Facility)에 감사드립니다. 동물을 도와준 Ms Jo Yiu Ling Wong에게 감사드립니다. 이 연구는 주제 기반 연구 계획(T12-702/20-N), 건강 및 의료 연구 기금 프로젝트 번호 08192066 및 08193106호, 중국 국립 자연과학 재단(NSFC)/연구 보조금 위원회(RGC) 공동 연구 계획 2021/22 N_HKU745/21, 중국 국가 핵심 R&D 프로그램(2023YFA1800100) 및 혁신 기술 위원회(Innovation and Technology Commission)가 자금을 지원하는 Health@InnoHK 이니셔티브 산하 종양학 및 면역학 센터(Centre for Oncology and Immunology)의 지원을 받았습니다. 중국 홍콩 특별행정구 정부(A.Y.H.L.).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
오토클레이브 스팀 살균기HIRAYAMA HRG-140
원심분리기 5424Eppendorf
Countess 3 자동 세포 계수기Thermofisher
Countess II FLInvitrogen
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)Sigma-aldrichMKCL9483
Falcon 40 µ m 세포 스트레이너CORNINGBlue, 멸균, 개별 포장, 50/Case
FBS, 인증Gibco26140079
FITC-Dextran (MW 10000) MedChemExpress60842-46-8
주사 바늘해밀턴 HAMI20743434G, 길이 10mm
마이크로 시린지해밀턴 7635-01 10 & 마이크로; L 용량, 모델 701 RN
Nikon SMZ18
PBS pH 7.4 (1x)Gibco10010023
페니실린-스트렙토마이신(5,000 U/mL)Gibco™15070063100x
피펫 팁Eppendorf epTIPS
싱글채널 피펫Eppendorf 05-403-151
초순수 증류수Invitrogen10977015

참고문헌

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  22. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J Vis Exp. (54), e2839(2011).

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