방법 논문

Paired Cisterna Magna Nanoinjection 및 Laser Speckle Contrast Imaging Assay를 통해 In Vivo에서 대뇌 혈류 조절 연구

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DOI:

10.3791/67544

⸱

2025년 7월 8일

 , 
1Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG), University of Virginia School of Medicine

이 논문에서

요약

생체 내에서 뇌의 혈류 조절을 연구하기 위해 전통적인 약리학적 방법은 침습적이며 종종 두개골, 경막 및 연수막을 손상시킵니다. 이 연구에서 우리는 나노인젝터 유도 시스터내 마그나(ICM) 주입과 레이저 스페클 대비 이미징을 결합하여 두개골과 연극의 무결성을 보존하는 최소 침습 기술을 개발했습니다.

초록

대뇌 혈류(CBF) 조절은 인지 기능을 유지하는 데 중요하지만 그 기저에 깔린 메커니즘은 아직 잘 알려져 있지 않습니다. 이 조절과 관련된 세포 및 분자 과정을 조사하려면 뇌척수액(CSF)에 약물을 정확하게 전달하는 동시에 뇌 혈류 역학을 실시간으로 모니터링할 수 있는 약리학적 접근 방식이 필요합니다. 본 논문에서는 나노인젝터 기반 시스터내 마그나(ICM) 주입과 레이저 스페클 콘트라스트 이미징을 결합하여 생체 내에서 뇌 혈류 조절을 연구하는 방법을 제시합니다.

나노리터 주입기 기반 ICM 주입 기술을 통해 nL/min에서 μL/min의 동적 범위에서 정밀한 약물 전달이 가능합니다. 실험에서 이 접근법은 주입량을 기존의 5-10μL에서 1.5μL로 크게 줄여 정상적인 두개내 압력을 유지했습니다. 레이저 스페클 콘트라스트 이미징과 결합했을 때, ICM 주사 전, 주사 중, 후에 실시간으로 뇌혈류(CBF) 역학을 모니터링할 수 있었습니다.

이 방법을 사용하여 (S)-3,5-디하이드록시페닐글리신(DHPG), 아세틸콜린, 아데노신의 세 가지 혈관 확장제의 ICM 주입에 대한 반응으로 CBF 변화를 평가했습니다. 세 가지 혈관 확장제 모두 기초 CBF를 증가시켰지만, CBF 역학에 뚜렷한 영향을 미쳤다. 예를 들어, 아데노신의 영향은 일시적이었던 반면, DHPG와 아세틸콜린은 오래 지속되는 효과를 나타냈습니다. 고유한 장점으로 인해 이 방법은 생체 내에서 설치류 CBF 조절을 연구하는 도구 상자에 귀중한 추가 기능을 제공합니다.

서론

대뇌혈류(CBF)는 정상적인 인지 기능을 유지하는 데 필수적인 대사 노폐물을 제거하면서 뇌에 산소와 영양소를 지속적으로 공급합니다 1,2. 항상성 조건 하에서, CBF는 관류 압력의 변동에도 불구하고 상대적으로 안정적으로 유지되며, 이는 자동 조절 3,4,5로 알려진 과정입니다. 자기조절(autoregulation) 외에도 국소 CBF는 신경혈관 결합(neurovascular coupling)이라고 하는 현상인 인근 신경세포 활동에 반응하여 동적으로 조정될 수 있습니다 6,7. 자기조절과 신경혈관 결합은 모두 내피 세포, 벽화 세포, 성상 세포, 섬유아세포 및 신경 세포(neurovascular unit cells)로 통칭되는 세포 그룹에 의해 조절됩니다 4,7. 그러나 이러한 서로 다른 세포 유형이 CBF를 조절하기 위해 조정하는 세포 및 분자 메커니즘은 여전히 크게 알려져 있지 않습니다.

CBF 조절을 조사하는 방법은 일반적으로 in vitro 및 in vivo 모델로 나뉩니다. 종종 급성 뇌 절편을 사용하는 체외 연구는 일반적으로 전기 생리학 또는 약리학 기술과 결합되어 뉴런과 신경교세포가 개별 혈관의 확장 또는 수축을 조절하는 방법을 조사합니다 8,9,10. 시험관 내 모델의 주요 한계는 생체 내 조건, 특히 생리학적 혈압이 없는 조건을 복제하지 않는다는 것입니다. CBF 조절을 연구하기 위한 생체 내 모델은 거시적 접근에서 미시적 접근 방식에 이르기까지 다양합니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET) 및 기능적 자기 공명 영상(fMRI)과 같은 거시적 기술은 비침습적이지만 공간 및 시간 해상도가 낮습니다 11,12,13,14.

생체 내에서 CBF를 연구하기 위한 주요 마이크로 스케일 방법은 높은 공간-시간 해상도 9,15,16,17,18을 제공하는 이광자 이미징입니다. 그러나 이 기술은 두개골과 경막을 제거해야 하며, 약리학적 조작과 결합하면 훨씬 더 침습적이 되어 잠재적으로 출혈을 일으키고 뇌 조직을 손상시키며 두개내압을 변화시킬 수 있습니다19. 그러므로, 특정 기준을 충족하는 생체 내 CBF를 조작하고 모니터링하는 방법을 갖는 것이 중요합니다: 비침습적이어야 하고(두개골, 연토전성 및 혈관의 무결성 보존), 높은 공간-시간 해상도를 제공해야 하며, CBF의 정확한 약리학적 조작이 가능해야 합니다. 본 논문에서는 나노리터 주입기 기반 시스터내 마그나(ICM) 주입과 레이저 스페클 대비 이미징을 결합하여 이러한 모든 요구 사항을 충족하는 새로운 방법을 소개합니다.

CBF 조절을 연구하기 위한 전통적인 약리학적 접근법은 종종 두개골과 수막을 제거하여 국소 약물 전달을 위해 뇌 조직을 노출시키는 것을 포함합니다. 이와는 대조적으로, ICM 주사는 뇌척수액(CSF)에 약물을 직접 투여하여 이러한 손상을 방지하여 뇌척수액의 자연스러운 흐름을 따를 수 있도록 함으로써 생리학적 상태를 더 잘 모방할 수 있습니다. ICM 주입의 한 가지 문제는 일반적으로 많은 양의 유체가 필요하다는 것인데, 마우스20에서 종종 5μL 이상의 유체가 필요합니다. 성체 마우스의 총 CSF 부피가 약 36μL인 점을 감안할 때 5μL를 주입하면 두개내 압력이 증가하고 CBF 역학이 변경될 수 있습니다. 유리 피펫을 사용하는 당사의 나노인젝터 시스템은 주입 부위에서 CSF 누출을 일으키지 않고 부피와 속도를 정밀하게 제어하여 유체를 공급합니다.

우레탄과 알파-클로랄로스는 이소플루란 또는 케타민/자일라진(KX)과 같이 일반적으로 사용되는 대안보다 뇌 혈류의 생리학적 기준선을 더 안정적으로 제공하고 신경혈관 결합(NVC)을 더 잘 보존하기 때문에 본 연구에 사용됩니다. 이 시스템을 사용하여 (S)-3,5-디하이드록시페닐글리신(DHPG), 아세틸콜린, 아데노신의 세 가지 혈관 확장제를 테스트한 결과, in vivo에서 CBF 역학의 정밀한 조작 및 모니터링이 가능함을 확인했습니다.

프로토콜

이 프로토콜은 버지니아 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드를 준수했습니다. 10-14주 된 6마리의 수컷 C57BL/6 쥐를 실험에 사용했습니다. 수술 절차는 그림 1A에 요약되어 있습니다.

1. 수술 준비

  1. 입체성 프레임에 가열 패드를 놓고 수술 37°C~20분 전에 예열합니다. 마취를 위해 인산염 완충 식염수(PBS)에 신선한 우레탄(750mg/kg)과 클로랄로스(50mg/kg)를 준비합니다.
    참고 : PBS에서 알파 클로랄로스 용액을 준비하기 위해 용액을 40 ° C 수조에서 가열하고 완전히 용해 될 때까지 10-15 분마다 와류를 쳤습니다. 우레탄 용액과 알파 클로랄로스 용액은 모두 사용하기 전에 0.22μm 주사기 필터를 사용하여 여과했습니다.
  2. 수술 전에 가위, 집게, 마이크로 바늘 홀더, 지혈기, 면봉, 와이퍼 및 봉합사 등 필요한 모든 수술 도구를 준비하십시오. 고압증기멸균(121°C, 15psi에서 60분 동안)으로 기구를 멸균합니다.
  3. 유리 모세관 (외경 1.14mm, 내경 0.53mm, 길이 88.9mm)을 준비합니다. 유리 풀러를 사용하여 주입용 유리 피펫을 만듭니다21. 선호되는 파이펫 저항 은 약 80 - 100 MΩ입니다. 유리 피펫을 소독하고 깨끗한 용기에 보관하십시오.
  4. 적절한 주입량(25 nL - 4.5 μL)과 속도(6 nL/s - 644 nL/s)로 나노주입기를 준비합니다.
  5. 인공 뇌척수액(aCSF)에서 (S)-3,5-디하이드록시페닐글리신(DHPG)을 5mM, 아세틸콜린을 0.5mM, 아데노신을 10mM에서 준비합니다.
  6. 수술 중 통증 완화를 위해 멜록시캠(4.0mg/kg)을 준비합니다. 적절한 진통제를 보장하기 위해 수술 약 30분 전에 마우스에게 멜록시캄을 피하로 투여합니다.

2. 수술 절차

  1. 6마리의 C57BL/6 수컷 마우스(생후 10-14주)의 무게를 측정하고 우레탄(750mg/kg)과 클로랄로스(50mg/kg)의 복강 내 주사를 통해 마취합니다. 마취를 유지하기 위해 1% 이소플루란이 함유된 마취실에 마우스를 놓습니다. 이 프로세스는 약 40분에서 1시간 정도 걸립니다.
    참고: Isoflurane은 마취 유도를 가속화할 수 있습니다.
  2. 마취실에서 마우스를 조심스럽게 제거하고 발가락 꼬집음 반사가 없는지 확인하여 마취 깊이를 평가합니다. 면봉을 사용하여 제모 크림을 두개골 위쪽과 목 뒤쪽에 바르고 털을 제거합니다.
  3. 건조함을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르고 시술 내내 필요에 따라 덧바르십시오. 실험 중 정기적으로 모니터링하고 필요한 경우 추가 연고를 투여합니다.
  4. 입체식 프레임 내에서 마우스를 엎드린 방향으로 배치하여 1-2L/min의 유속으로 의료용 공기로 적절한 환기를 보장합니다. 적절한 고정을 위해 이어바를 마우스로 고정한 다음 머리를 부드럽게 아래쪽으로 기울여 몸체와 120° 각도를 형성하여 수조 마그나를 노출시킵니다.
    참고: 이소플루란은 마취 유도에만 사용되며 유지 단계에서는 사용되지 않습니다.
  5. 적절한 피부 살균을 보장하기 위해 70% 알코올과 수술용 스크럽(예: 클로르헥시딘 또는 포비돈 요오드)을 최소 3회 교대로 사용하여 수술 부위를 소독합니다.
  6. 수술용 현미경으로 후두부를 찾습니다. 핀셋으로 위에 있는 피부를 들어 올려 1cm의 정중선을 절개합니다. 면봉으로 출혈을 조절하십시오.
  7. 목 근육을 노출시키고 집게를 사용하여 정중선을 따라 조심스럽게 절개하고 분리합니다. 양손에 하나씩 두 개의 구부러진 집게를 사용하여 근육을 부드럽게 수축시키고 수조 마그나의 외부 경계를 형성하는 경막을 노출시킵니다.
  8. 수조 마그나의 최적 노출을 위해 몸체와 150° 각도를 형성하도록 머리를 아래쪽으로 기울여 머리 위치를 조정합니다.
  9. 시상 봉합선을 따라 람다 지점과 브레그마 지점을 모두 덮고 5mm를 절개합니다. 두 개의 구부러진 집게를 사용하여 피부를 부드럽게 옆으로 당기고 식염수로 두개골 표면을 청소합니다. 노출된 두개골에 머리카락이 남아 있지 않은지 확인하십시오.
  10. 세척 후 면봉을 사용하여 노출된 두개골에 ~1mm 두께의 초음파 젤 층을 도포하여 해당 부위의 수분을 유지합니다. 초음파 젤에는 기포가 포함될 수 있으므로 이미징 전에 모든 기포가 제거되었는지 확인하십시오.
  11. 레이저 스페클 대비 이미징 시스템의 렌즈 아래에 마우스를 놓습니다. 시스템 및 함께 제공되는 소프트웨어를 켭니다. 마우스 뇌가 이미징 필드 내의 중앙에 있는지 확인한 다음 자동 초점 기능을 사용하여 이미징을 위한 올바른 초점을 얻습니다. 필요한 경우 핀셋을 사용하여 이미징 필드에 남아 있는 머리카락이나 기포를 부드럽게 제거합니다.

3. 나노 주입 설정

  1. 펌프를 입체식 매니퓰레이터 암에 고정하고 케이블을 컨트롤러에 연결합니다. 컨트롤러를 켜고 대상 펌프를 선택합니다. 제어판에서 DIRECTION 을 INFUSE로 설정합니다. 속도를 분당 2μl로, 부피를 4.5μl로 설정합니다.
    참고: 나노 사출 시스템은 사출 펌프와 컨트롤러의 두 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 각 컨트롤러는 두 개의 펌프를 동시에 작동할 수 있습니다. ICM 주입의 경우 하나의 펌프만 사용합니다.
  2. INFUSE가 완료되면 용기에서 유리 피펫 1개를 꺼내 34G MicroFil 플렉시블 니들 또는 유사한 유형의 니들을 사용하여 무색, 무취의 미네랄 오일을 채웁니다. 전체 유리 피펫에 오일이 채워져 있는지 확인하십시오.
  3. 펌프의 콜릿 나사를 풀고 유리 피펫을 삽입한 다음 콜릿을 조입니다. 유리 피펫 내부에 기포가 없는지 확인하십시오.
  4. WITHDRAW의 제어판에서 DIRECTION을 변경합니다. 속도를 2 μ L/min으로 설정하고 볼륨을 4.5 μ L로 설정합니다.
  5. 입체 암을 움직여 준비된 용액에 피펫을 부드럽게 도입하고 원하는 부피를 빼냅니다.

4. 수조 마그나에 혈관 확장제 주입 및 CBF 모니터링

  1. 펌프가 입체식 매니퓰레이터 암에 단단히 고정되었는지 확인하십시오. 입체식 매니퓰레이터 암의 각도를 전방-후방 평면에서 45°로 조정합니다.
  2. 해부 현미경 아래의 곡선 핀셋을 사용하여 수조 마그나를 조심스럽게 노출시킵니다. 피를 제거하기 위해 식염수로 해당 부위를 청소하십시오. 입체식 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 수조 마그나의 경막 근처에 유리 피펫을 배치합니다.
  3. 유리 피펫이 경막에 닿으면 소뇌나 수질로의 침투를 피하면서 수조 마그나의 중앙으로 통과하도록 부드럽게 움직입니다. 핀셋을 풀기 전에 유리 피펫의 끝이 1-2mm 깊이로 삽입되었는지 확인하십시오.
    참고: 디지털 입체 프레임은 유리 피펫이 수조 마그나로 침투하는 깊이를 모니터링하는 데 필수적입니다.
  4. 제어판에서 DIRECTION 을 INFUSE로 변경합니다. 사출 속도를 300nL/min으로 설정하고 부피를 1.5μL로 설정합니다.
  5. 레이저 스페클 대비 이미징(LSCI)용 소프트웨어를 실행하고 혈관의 가장 선명한 이미지를 얻을 수 있도록 초점을 조정하십시오. 필드에 머리카락이나 기포가 없는지 확인하십시오.
  6. LSCI 제어판에서 이미징 간격을 5초로 설정합니다. 약 10분 동안 기준선 CBF를 기록하여 기준선이 안정적으로 유지되도록 합니다. 베이스라인에 변동이 있는 경우 안정성이 달성될 때까지 더 오랜 시간 동안 기록을 계속합니다.
  7. 10분 동안 안정적인 베이스라인 기록 후 나노 주입을 시작하고 LSCI 기록 시스템에서 주입 시작 시간을 기록합니다. 주입이 완료되면 완료 시간을 표시하고 추가로 20분 이상 녹음을 계속합니다. 실험을 완료한 후 경심은 PBS로 마우스를 관류하고 조직학적 분석을 위해 뇌 조직을 수집합니다.

결과

수술을 마친 후, 우리는 디지털 판독이 가능한 입체성 프레임에 마우스를 고정했습니다(그림 1A, B). 뇌혈류(CBF) 측정을 위해 절개 후 두개골 위의 피부를 조심스럽게 분리하고 투명한 초음파 젤을 도포하여 두개골 표면의 수분을 유지했습니다(그림 1C). 수조내 마그나(ICM) 주사를 용이하게 하기 위해 후두부 주변의 목 근육을 절개하여 수조 마그나를 노출시켰습니다. 그 후, 유리 피펫으로 대상 용액을 회수하고 마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 유리 피펫이 수조 마그나의 막을 1-2mm 깊이까지 관통하도록 안내했습니다(그림 1D, E). 입위 암은 삽입을 돕기 위해45o 각도로 기울어졌습니다.

다음으로, 우리는 (S)-3,5-디하이드록시페닐글리신(DHPG), 아세틸콜린, 아데노신 22,23,24,25의 세 가지 혈관 확장제에 대한 반응으로 CBF 역학 변화를 조사했습니다. 처음에는 5분 동안 300nL/분의 속도로 각 혈관 확장제 1.5μL를 주입하기 전에 10분 기준선을 기록했습니다. 주사 후 추가로 20분 분량의 데이터를 기록했습니다. 본 연구의 결과는 3가지 혈관 확장제 모두 뚜렷한 역학 관계를 보였지만 CBF를 증가시켰다. DHPG는 CBF의 급격한 증가를 유도한 후 주입 후 점진적인 감소를 보였습니다(그림 2A, B). 대조적으로, 아세틸 콜린은 기록 기간 동안 CBF의 점진적인 증가를 유도했다 (그림 2C, D). 아데노신은 또한 CBF의 일시적인 증가를 일으켰으며, 이는 주입 후 약 15-20분 후에 기준선 수준으로 돌아왔습니다(그림 2E, F).

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그림 1: 수술 절차 요약. (A) 나노주입 + LSCI 모델에 대한 단계별 주요 수술 절차. (B) 결합된 나노주입 + LSCI 시스템을 보여주는 개략도. 나노 인젝터는 입체선 암에 안정적으로 고정되고 암은 수조 마그나에서 대서양-후두막의 침투를 용이하게 하기 위해45o 기울어집니다. (C) LSCI 시스템 아래에 있는 마우스 두개골의 하향식 모습. 두개골은 초음파 젤로 덮여 있습니다. (D) 수조 마그나를 관통하는 유리 피펫을 보여주는 뒷모습. 유리 피펫은 시각화를 용이하게 하기 위해 Evans blue로 채워졌습니다. 이 실험에 디지털 입체 프레임을 사용하여 침투 거리를 정확하게 정량화할 수 있습니다. (E) 수조 마그나에서 유리 피펫 팁 위치를 보여주는 회로도. 마우스의 머리는 수조 마그나 주입을 용이하게 하기 위해30o 기울어졌습니다. 약어: LCSI = laser speckle contrast imaging. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 혈관 확장제의 나노 주입 후 뇌 혈류 증가. (A) DHPG 주입 전후의 뇌 혈류 변화를 보여주는 대표적인 이미지. 혈액 속도는 색상으로 구분되어 있습니다. 파란색은 저속을 나타내고 빨간색은 고속을 나타냅니다. (B) DHPG 주사 시간을 나타내는 빨간색 선으로 표시된 영역의 실시간 혈류. (C) ACh 주사 전후의 뇌혈류 변화를 보여주는 대표적인 이미지. 혈액 속도는 색상으로 구분되어 있습니다. 파란색과 빨간색은 각각 저속과 고속을 나타냅니다. (D) ACh 주사 시간을 나타내는 빨간색 선으로 표시된 영역의 실시간 혈류. (E) 아데노신 주사 전후의 뇌혈류 변화를 보여주는 대표적인 이미지. 혈액 속도는 색상으로 구분되어 있습니다. 파란색과 빨간색은 각각 저속과 고속을 나타냅니다. (F) 아데노신 주입 기간을 나타내는 빨간색 선으로 표시된 영역의 실시간 혈류. 약어 : DHPG = (S) -3,5- 디 히드 록시 페닐 글리신; ACh = 아세틸콜린. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

우리는 정밀한 수조 마그나 나노 주입과 레이저 스페클 대비 이미징(LSCI)을 결합하여 생체 내에서 뇌혈류(CBF) 조절을 조사하는 새로운 방법을 제시합니다. 이 접근 방식을 사용하면 뇌척수액(CSF)으로 약물을 정확하게 전달하는 동시에 CBF를 실시간으로 모니터링할 수 있어 뇌혈관 반응성 평가를 용이하게 할 수 있습니다.

약리학적 조작 및 약물 전달 기술은 생체 내에서 CBF 및 대뇌 혈관 반응성을 연구하는 데 중요합니다. 혈관 확장제 또는 수축제의 사용과 같은 전통적인 약물 적용 방법은 종종 두개골을 제거해야 하며, 이는 연수막과 뇌 실질(brain parenchyma)을 손상시킬 수 있습니다 9,10,18. 이러한 침습적 기술은 특히 혈관 손상과 출혈을 일으켜 실제 생리적 상태를 복제하지 못함으로써 뇌 미세환경을 교란할 수 있습니다. 대조적으로, 우리의 방법은 네 가지 중요한 이점을 제공합니다.

첫째, 약물 적용에 대한 우리의 접근 방식은 비침습적이며 생리적 상태를 보존합니다. 둘째, 고전적인 ICM 주입 방법은 일반적으로 주사기 또는 캐뉼라에 의존하며, 이는 팁의 크기가 크기 때문에 약물 또는 미량 및 CSF의 누출로 이어질 수 있습니다. 이러한 전통적인 방법은 종종 많은 양의 약물 또는 미량(일반적으로 5μL 이상)을 필요로 하며, 이는 두개내 압력에 변화를 줄 수 있습니다. 대조적으로, 당사의 나노인젝터 유도 ICM 주입은 1.5μL 이하의 소량만 필요합니다. 또한 사출 속도는 1nL/s에서 100nL/s에 이르는 넓은 범위에서 정밀하게 제어할 수 있습니다. 일반적으로 5nL/s(300nL/min)의 속도를 사용하는데, 이 속도는 두개내 압력에 영향을 미치지 않기 때문입니다. 셋째, 뇌 실질에 피펫 유도 약물 주입 또는 피질 표면에 약물 관류와 달리, 당사의 수조 마그나 주입 기반 약물 전달은 CSF의 자연스러운 흐름을 따르며 생리학적 조건을 밀접하게 모방합니다. 마지막으로, 우리의 방법은 두개골과 수막의 무결성을 보존하기 때문에 다른 시점에서 동일한 그룹의 마우스에 대한 측정을 수행할 수 있으므로 다른 약물 적용 방법으로는 실현 불가능한 종단 비교가 가능합니다. 생존 연구 및 종단 비교를 위해서는 적절한 피부 준비, 멸균 기구 및 재료 사용, 기관 동물 관리 지침 준수를 포함한 엄격한 무균 기술을 따라야 합니다. 상처 치유를 위해 2주간의 회복 기간을 허용해야 합니다.

마취 방법은 CBF에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 케타민-자일라진 마취는 CBF를 기준선 수준보다 50% 이상 높일 수 있는 반면, 이소플루란은 기초 CBF 수준을 두 배로 높일 수 있습니다. 우리의 실험에서, 우리는 우레탄과 클로랄로스를 선택했는데, 이는 심혈관 시스템에 대한 최소한의 영향으로 인해 CBF의 생리적 수준을 유지하는 데 도움이되며, 현장에서 일반적으로 사용되는 바와 같이26,27. 또한, 비침습적 혈액가스 측정을 반복하기 위해 동맥내 삽관을 생략하였으나, 이러한 절차는 본 방법의방법 26과 결합할 수 있다.

우리의 접근 방식은 나노 주입 기반 ICM 주입 시스템(28 )과 레이저 스페클 대비 이미징(LSCI) 시스템(29)의 두 가지 시스템을 통합합니다. 실험자는 절차를 성공적으로 수행하기 위해 두 시스템 모두에서 교육을 받아야 합니다. LSCI 시스템은 마우스 머리 위의 모든 공간을 차지하기 때문에 암을 45도 기울이면 ICM 주입이 용이할 뿐만 아니라 두 시스템 간의 호환성이 보장됩니다. 이 설정은 실험의 성공에 매우 중요합니다.

나노인젝터 유도 ICM 주입을 사용하는 초보자의 경우, 한 손에는 핀셋으로 근육을 분리하고 다른 한 손으로는 마이크로 매니퓰레이터를 조작하여 유리 피펫을 안내하는 협응 기술을 숙달하기 위해 광범위한 연습이 필요합니다. 우수한 레이저 광과 관절 암 실체 현미경은 시술 중 최적의 시각화를 위해 필수적입니다.

이 방법을 사용하여 DHPG, 아세틸콜린 및 아데노신과 같은 고전적인 혈관 확장제가 CBF에 어떤 영향을 미치는지 평가했습니다. 예상한 대로, 3개의 혈관 확장제 모두 CBF를 증가시켰다. 그러나 그들은 다른 역학을 유도했습니다. DHPG는 CBF의 급격한 증가를 일으킨 후 서서히 감소하는 반면 아세틸콜린은 점진적인 증가를 이끌어냈습니다. 대조적으로, 아데노신은 CBF에서 일시적인 상승만을 일으켰습니다.

이 방법은 쥐 모델에도 적용할 수 있어야 합니다. 그러나 쥐의 두개골 두께가 약 0.5-1mm라는 점을 감안할 때 레이저 스페클 대비 이미징을 위해 얇게 만들어야 합니다. 또한 현재 방법은 머리를 고정하고 깨어 있는 쥐에 적용할 수 있지만 실험 중 동물의 움직임을 최소화하기 위해 광범위한 훈련이 필요합니다. 우리는 우리의 방법을 시연하기 위해 제한된 수의 마우스를 사용했습니다. 따라서, 본 연구는 통계적으로 제한되어 있으며, 본 연구 결과로부터 광범위한 결론을 도출할 때 주의를 기울여야 한다.

일관되고 신뢰할 수 있는 CBF 측정을 위해 실험자는 체온, 혈압 및 CO2 수준과 같은 다른 생리학적 매개변수가 포괄적인 생리학적 평가에서 중요한 역할을 하며 향후 연구에서 신중하게 고려해야 한다는 점을 인식하는 것이 중요합니다. 요약하면, 우리는 마우스에서 CBF 조절을 연구하기 위한 새로운 생체 내 방법을 제시합니다. 이 접근법은 정확하고 최소 침습적이므로 약물 유발 CBF 역학을 조사하는 데 매우 적합합니다.

공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NIH 보조금(NS108763, NS127392, NS125788, NS125677)의 지원을 받았습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
(RS)-3,5-디하이드록시페닐글리신토크리스고양이. No. 0342
아세틸콜린 클로라이드시그마A6625-25G
아데노신시그마A9251-25G
알코올 면봉 70% 이소프로필 알코올Vitrex 의료용 A/S520213
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아쿠아소닉 투명 초음파 투과 젤AquasonicGelPLI 03-50
디지털 마우스 정위 기기Stoelting51730D
에틸 알코올그마459836-2L
Fiber-Lite DC950 일루미네이터Dolan-Jenner 산업DC950H
유리 교체 1.14MM세계 정밀 기기504949
Kimtech 과학 정밀 물티슈 티슈 와이퍼Kimberly Clark Professional5511
레이저 스펙클 콘트라스트 이미저황무지 기기MOORFLPI-2
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참고문헌

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