Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional mutagenesis cell library(삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 기능적으로 관련된 렌티바이러스 통합 부위 식별)

요약

삽입 돌연변이 유발은 기능적 게놈 요소를 식별하기 위한 순 유전학의 필수 도구입니다. 여기에서는 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 검출하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)에 대해 설명합니다.

초록

인간 게놈 내 기능적 염기서열의 범위는 생물학에서 중추적이지만 논쟁의 여지가 있는 주제입니다. 고처리량 역 유전자 스크리닝이 이를 탐구하는 데 큰 진전을 이루었지만 종종 범위를 알려진 게놈 요소로 제한하고 비특이적 효과를 유발할 수 있습니다. 이는 게놈 기능에 대한 보다 심층적이고 편견 없는 이해를 가능하게 하는 새로운 기능적 유전체학 도구의 시급한 필요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리 내에서 렌티바이러스 통합 부위를 식별하는 방법인 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts)를 소개합니다. InSET은 측면 염기서열을 검출하고 정량화하는 데 사용되는 차세대 염기서열분석을 통해 게놈 전반의 렌티바이러스 통합 부위를 쉽게 캡처할 수 있습니다. InSET의 설계는 표현형 스크리닝의 통합 부위 풍부도 변화를 대규모로 분석할 수 있게 하여 순방향 유전학 및 기능적 유전체 요소를 식별하기 위한 강력한 도구로 자리매김할 수 있습니다. InSET의 주요 이점은 이전 주석과 무관하게 단백질 코딩 및 비코딩 RNA의 새로운 기능적 엑손을 포함하여 이전에 확인되지 않은 게놈 요소를 밝힐 수 있다는 것입니다. 전반적으로 InSET은 많은 게놈 요소가 기능적 특성화를 기다리고 있는 인간 게놈 및 전사체의 복잡한 복잡성을 연구하는 데 상당한 가치를 가지고 있습니다.

서론

기능적 유전체학은 포스트 게놈 시대에도 여전히 중요하고 도전적인 분야로 남아 있으며, 게놈 영역의 상당 부분은 여전히 기능적 특성화가 부족합니다. 이러한 문제의 주요 원인은 단백질 코딩 및 비코딩 영역 모두에서 광범위한 전사 및 보편적인 대체 스플라이싱을 특징으로 하는 인간 게놈 및 전사체의 복잡한 특성에 있습니다^1,2,3,4,5. 이러한 복잡성은 RNA 표적 농축 연구를 통해 광범위하게 강조되었습니다^6,7,8,9. 인간 게놈의 잘 주석이 달린 세그먼트 외에도 수많은 새로운 게놈 요소가 매핑되지 않고 기능적으로 주석이 없는 상태로 남아 있다는 사실이 점점 더 인식되고 있습니다^10,11,12

.

최근 몇 년 동안 RNA 간섭(RNAi) 및 CRISPR/Cas 시스템과 같은 역유전학 도구의 발전이 관찰되었습니다^{13,14,15,16,17,18,19,20,21}. 그러나 이러한 방법은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA) 또는 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 복잡한 라이브러리 생성과 관련된 비특이적 효과 및 높은 비용을 포함하여 주목할만한 단점이 있습니다^22,23,24,25. 또한 이러한 방법은 주로 주석이 달린 게놈 요소에 중점을 둡니다. 대조적으로, 순방향 유전학은 주석이 없는 새로운 기능적 게놈 요소를 식별할 수 있는 이점이 있습니다. 인간 게놈 및 전사체의 복잡성과 수많은 새로운 게놈 요소를 감안할 때 이러한 순방향 유전학 능력은 매우 중요합니다.

순방향 유전학 세포 라이브러리는 무작위 레트로바이러스 통합을 통해 생성되는 경우가 많기 때문에 순방향 유전학 분석에 있어 게놈 전체 통합 부위의 효율적인 검출이 중요합니다. 이러한 통합 사이트를 탐지하려면 일반적으로 게놈 보행 도구^{26이 포함됩니다}. 이러한 도구에서 상당한 발전이 있었지만 차세대 염기서열분석(NGS) 응용 분야에 최적화되어 삽입성 돌연변이 유발 연구에 적용된 도구는 거의 없습니다. 세포주에서의 삽입 돌연변이 유발은 종종 Inverse PCR(I-PCR) 또는 선형 증폭 매개 PCR(LAM-PCR)과 같은 방법을 사용하여 통합 부위를 검출합니다^27,28,29. 그러나 이러한 방법은 일반적으로 제한 효소 분해 또는 결찰 단계가 필요하며, 이는 효율성을 감소시키고 결과에 편향을 유발할 수 있습니다.

순 유전학 스크리닝에서 게놈 전체 통합 부위의 효율적인 검출을 향상시키기 위해 InSET(Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts) 방법이라는 방법이 여기에 도입되었습니다. InSET은 게놈 워킹(genome-walking)과 NGS를 통합함으로써 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 라이브러리에서 렌티바이러스 통합 부위를 고처리량으로 식별할 수 있습니다. 기존 방법^{27,28,29에 비해} InSET은 상대적으로 간단하고 간단하여 제한 효소 분해 또는 결찰 단계를 제거하여 더 편리하고 접근하기 쉽습니다. 더욱이, 포유류 세포의 기존 순유전학 스크리닝은 극소수의 반수체 또는 준반수체 세포주에 국한되어 있지만^{27,28,29,30,31}, InSET은 이수성 세포주에서 작동하는 것으로 입증되었습니다³².

이 연구는 InSET 메소드를 구현하기 위한 자세한 단계별 프로토콜을 제공합니다. 또한 삽입 돌연변이 유발 연구에서 InSET의 적용을 보여줍니다. InSET은 인간 세포주에서 단백질 코딩 및 비코딩 RNA를 모두 포함하는 게놈 요소 내에서 새로운 엑손을 식별하기 위한 강력한 도구 역할을 합니다.

프로토콜

그림 1은 InSET 메소드의 개략도를 제공합니다. 최적의 커버리지를 위해 1μg의 게놈 DNA에서 5개의 병렬 라이브러리를 준비한 다음 차세대 염기서열분석을 위해 풀링합니다. 이 절차는 이전 테스트에서 지속적으로 성공적으로 완료되었지만 사용자는 재량에 따라 일시 중지 지점을 도입할 수 있습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 정보는 Table of Materials에서 확인할 수 있습니다.

1. 게놈에서 렌티바이러스 통합 부위 캡처

1. 이전 연구에서 설명한 바와 같이 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리(1μg)^{32에서 설명한 바와 같이 렌티바이러스 기반 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리(1μg)를 PCR} 튜브에서 1x Taq Buffer, 2.5 U Taq DNA 중합효소, 4μL의 dNTP 혼합물(각 2.5mM) 및 0.3μM의 비오틴화된 프라이머 3-LTR_prime(표 1)을 포함하는 50μL 반응에서 선형 PCR의 템플릿으로 사용합니다.
   참고: 3-LTR_prime 프라이머는 렌티바이러스 염기서열의 LTR 영역에 어닐링됩니다. 5' LTR로 어닐링하는 경우, 증폭된 단편에는 측면 게놈 염기서열이 포함됩니다. 3' LTR로 어닐링하면 증폭된 단편에는 내부 렌티바이러스 염기서열이 포함되어 있으며, 이는 숙주 게놈에 정렬할 수 없으므로 다운스트림 염기서열분석 데이터 분석 중에 필터링됩니다. 이 primer는 insertional mutagenesis cell library를 생성하는 데 사용되는 다른 유형의 벡터에 적응하도록 수정할 수도 있습니다.
2. 표준 PCR thermocycler에서 선형 PCR의 50 사이클을 수행하고, 시작 시 2.5 U의 Taq DNA 중합효소를 추가하고 25 사이클 직후에 다시 추가합니다. PCR 조건은 다음과 같습니다 : 94 ° C 5 분; 30초 동안 94°C, 30초 동안 55°C, 30초 동안 72°C의 50 사이클; 72 °C 5 분 동안
   참고: 장시간 반응 동안 Taq DNA 중합효소의 활성을 유지하려면 반응의 시작과 중간 지점 모두에 효소를 추가하는 것이 좋습니다.
3. PCR 산물을 새롭고 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
4. PCR 산물을 10μL의 비오틴-스트렙타비딘 마그네틱 비드와 철저히 혼합합니다.
5. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양하고 금속 수조에서 400rpm으로 흔듭니다.
   알림: 15분마다 튜브를 꺼내 피펫과 잘 섞입니다.
6. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 모은 다음 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
7. 비드를 300μL의 Binding/Wash Buffer(10mM의 Tris-HCl(pH 7.5), 1mM의 EDTA, 1M의 NaCl, 0.1% Tween-20)로 6회 세척하고 상등액을 버립니다.
8. 300 μL (65 °C) DNase/RNase-free 증류수로 2회 세척하고 상층액을 버립니다.
9. 두 번째 가닥 합성의 경우, PCR 튜브에 1x Klenow Fragment Buffer, 2μL의 dNTP 혼합물(각 2.5mM) 및 6.25μM의 P5_N6 프라이머(표 1)를 포함하는 24μL 반응 부피에서 비드를 재현탁
   참고: 프라이머의 100μM 원액P5_N6 준비합니다. P5_N6 프라이머는 5' 말단에 고정된 P5 어댑터 서열과 3' 말단에 무작위 헥사머 서열로 구성됩니다. 무작위 헥사머는 다양한 범위의 표적 염기서열에 결합할 수 있어 선형 PCR을 통해 생성된 다양한 DNA 단편을 증폭하는 데 적합합니다.
10. PCR 열순환기에서 15°C에서 20분 동안 혼합물을 사전 배양합니다.
11. 2 U의 Klenow Fragment (Large Fragment E.coli DNA Polymerase)를 추가합니다.
12. 뒤에 오는 조건에 PCR thermocycler에 있는 혼합물을 배양하십시오: 15 °C에서 25 °C에 0.5 °C/min에 천천히 경사하게 후에 30 분 배양; 그 후에 37 °C에 0.5 °C/min에 천천히 경사로 다음 1개의 h 외피.
13. PCR 산물을 새롭고 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
14. 마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 캡처한 다음 상층액을 버립니다.
15. 300 μL의 4 °C DNase/RNase-free 증류수로 비드를 부드럽게 세척합니다. 비드를 모으고 상층액을 버립니다.

2. 중첩된 PCR을 이용한 NGS 라이브러리 구축

1. PCR 튜브에서 1x Taq Buffer, 1.25 U Taq DNA Polymerase, 0.5 μM의 primer P5(표 1), 2 μL의 dNTP 혼합물(각 2.5 mM) 및 0.5 μM의 primer 3-LTR_Nest(표 1)을 포함하는 25 μL PCR 반응 부피에서 1.15단계의 비드를 재현탁합니다.
2. 뒤에 오는 조건 하에서 PCR thermocycler에 있는 PCR 반응을 실행하십시오: 3 분 동안 94 °C; 30 s 동안 94 °C, 30 s 동안 55 °C 및 30 s 동안 72 °C의 20 주기; 7 분 동안 72 °C.
3. 1x Taq 완충액, 2.5 U Taq DNA 중합효소, 4 μL의 dNTP 혼합물 (각각 2.5 mM), 0.4 μM의 프라이머 Illumina_P5(표 1) 및 0.4 μM의 프라이머 Illumina_P7-3LTR (표 1)을 포함하는 50 μL 볼륨에서 PCR의 다음 라운드를 위한 템플릿으로 2.2 단계의 PCR 생성물 5 μL를 사용합니다(표 1).
4. 뒤에 오는 조건 하에서 PCR thermocycler에 있는 PCR 반응을 실행하십시오: 3 분을 위한 94 °C; 30 s 동안 94 °C, 30 s 동안 55 °C, 및 30 s 동안 72 °C의 15 주기; 7 분 동안 72 °C.
5. PCR 산물을 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
   참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 samples는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.
6. 1.2x 부피의 DNA 클린 비드를 사용하여 PCR 산물을 정제하여 최종 부피를 21 μL.
   로 만듭니다. 참고: 병렬로 준비된 5개의 라이브러리 각각에서 10μL의 PCR 산물을 취하여 함께 풀링하고 최종 부피 21μL로 정제합니다. PCR 산물에 대한 정제 프로토콜은 DNA 클린 비드에 대한 제조업체의 지침에 따라 조정됩니다(재료 표 참조).
   1. 비드를 2-8 °C에서 실온까지 30 분 동안 평형을 이룹니다.
   2. 반전 또는 볼텍싱으로 구슬을 철저히 혼합합니다.
   3. 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브에 비드의 1.2배 부피를 피펫팅합니다.
   4. PCR 산물을 비드에 넣고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저히 혼합합니다.
   5. DNA가 비드에 결합할 수 있도록 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   6. 샘플을 마그네틱 스탠드에 놓고 용액이 투명해지면 상층액을 제거합니다(약 5분).
   7. 200μL의 80% 에탄올을 첨가하여 비드를 세척하고 실온에서 30초 동안 배양한 다음 상층액을 제거합니다.
      참고: 80% 에탄올은 신선하게 준비해야 합니다.
   8. 2.6.7단계를 한 번 반복합니다.
   9. 뚜껑을 열고 약 5분 동안 실온에서 비드를 자연 건조합니다.
   10. 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 DNase/RNase가 없는 증류수 22μL를 넣고 위아래로 10회 피펫팅하여 철저히 혼합한 다음 실온에서 2분 동안 그대로 둡니다.
   11. 용액이 투명해질 때까지(약 2분) 튜브를 마그네틱 스탠드에 놓은 다음 21μL의 상등액을 깨끗한 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
       참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 samples는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.
7. 1 μL의 정제된 PCR 산물을 사용하여 시판되는 dsDNA 형광 검출 키트(재료 표 참조)와 함께 형광계를 사용하여 농도를 측정합니다.
   알림: 농도 측정 프로토콜은 dsDNA 검출 키트에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다.
   1. 시약과 완충액(키트에 제공됨)을 1:200의 비율로 혼합하여 작업 용액 준비를 준비합니다.
   2. 10 μL의 표준 #1과 10 μL의 표준 #2(키트에 제공됨)를 각각 190 μL의 작업 용액과 혼합하여 분석 표준물질을 준비합니다. 혼합물을 2-3초 동안 부드럽게 와류로 가열합니다.
   3. 정제된 PCR 산물 1μL와 작업 용액 190μL를 혼합하여 분석 샘플을 준비합니다. 혼합물을 2-3초 동안 부드럽게 와류로 가열합니다.
   4. 분석 표준물질과 분석 샘플을 실온에서 2분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
   5. 형광측정기를 켭니다.
   6. 메인 메뉴에서 dsDNA 고감도 프로그램을 선택합니다.
   7. 교정을 위해 표준 #1을 기계에 삽입하고 Read standard 버튼을 눌러 첫 번째 표준을 측정한 다음 Standard #2를 삽입하고 Read standard 버튼을 눌러 두 번째 표준을 측정합니다.
   8. 샘플 측정의 경우 Run samples 버튼을 눌러 샘플 측정 페이지로 이동합니다. 분석 샘플이 들어 있는 각 튜브를 삽입하고 Read tube 버튼을 눌러 농도를 얻습니다.
      참고: 이 단계에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있으며 samples는 -20 °C에서 저장할 수 있습니다.
8. 30기가베이스(GB) 규모에서 쌍단 150bp(PE150) 전략을 사용하여 Illumina 플랫폼에서 NGS를 수행합니다.
   참고: 이 단계는 일반적으로 염기서열분석 회사에 아웃소싱됩니다.

3. 데이터 분석

참고: 이 섹션에서는 인간 세포주 분석이 예로 사용되었습니다.

1. 렌티바이러스 통합 부위 매핑
   1. fastp tool^{33을 사용하여 50% 이상의 저품질 염기(Phred score <20), 15개 이상의 'N' 염기 또는 150개 미만의 염기가 있는 염}기서열분석 판독을 필터링합니다(재료 표 참조).
   2. LTR 태그 "GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG
      로 시작하는 읽기 2가 있는 페어링된 엔드 읽기만 선택합니다. ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      참고: 이 염기서열은 insertional mutagenesis cell library를 생성하는 데 사용되는 벡터의 염기서열에 따라 다릅니다.
   3. 3.1.2단계에서 선택한 읽기에서 LTR 태그 시퀀스를 자릅니다.
   4. 기본 설정으로 BWA-MEM ^{34(재료 표 참조)를 사용하여 트리밍된 읽기를 GRCh37/hg34}에 정렬합니다.
   5. read 1과 read 2가 모두 FLAG 147 및 FLAG 163으로 표시된 올바른 구성과 간격으로 게놈에 고유하게 매핑되는 read 쌍만 유지합니다.
   6. 삽입 위치를 trimmed read 2의 첫 번째 정렬된 베이스로 정의합니다.
   7. 각 고유 삽입 부위의 판독 횟수를 각 샘플에서 고유하게 정렬된 총 판독 수로 정규화합니다.
2. 세포 적합성에 영향을 미치는 삽입물 식별(IACF)
   참고: 통계 분석에서는 대조 샘플과 처리된 샘플의 세 가지 생물학적 복제물을 쌍으로 비교하여 크게 농축되거나 고갈된 위치를 식별하는 것이 좋습니다. 위에서 언급한 반복 횟수는 최소입니다. 결과의 신뢰성과 정확성을 보장하기 위해 실질적으로 가능한 한 많은 반복실험을 사용하는 것이 좋습니다.
   1. 각 위치의 정규화된 읽기 횟수를 변환하여₁₀개의 값을 기록합니다.
   2. 읽기가 0인 위치의 로그₁₀개 값을 -5로 설정합니다.
   3. 로그₁₀ 값에 대해 양측 쌍을 이룬 스튜던트 t-검정을 수행합니다.
   4. R 환경 내에서 Benjamini-Hochberg 방법을 사용하여 다중 비교를 위해 p-값을 조정합니다.
   5. FDR(False Discovery Rate) 임계값이 25%인 위치를 IACF로 선택합니다.
3. 세포 적합성에 영향을 미치는 클러스터 식별(CACF)
   참고: 이 분석을 위해 대조군 및 처리된 샘플의 세 가지 생물학적 복제가 권장되었습니다.
   1. FDR 임계값이 1%인 SICER^{35(재료 표 참조)를 사용하여 대조 샘플과 처리된 샘플 사이에 크게 농축되거나 고갈된 삽입 클러스터를 식별합니다}. SICER 분석을 위한 명령은 "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01"입니다.
      참고: 위 명령에서 매개변수의 의미는 다음과 같습니다: ["InputDir"] ["처리된 샘플 삽입 부위 베드 파일"] ["제어 샘플 삽입 부위 베드 파일"] ["OutputDir"] ["종"] ["이중화 임계값"] ["창 크기(bp)"] ["단편 크기"] ["유효 게놈 분획"] ["갭 크기(bp)"] ["E-값"].
   2. BEDTools suite^{36(재료 표 참조)의 "intersect" 기능을 사용하여 두 개 이상의 생물학적 복제가 공유하는 클러스터 영역을 얻고} 이러한 클러스터 영역을 CACF로 표시합니다.

결과

일반적으로 염기서열분석 제공자가 수행하는 NGS 라이브러리의 품질 관리 평가는 염기서열분석 전에 표준 품질 검사로 사용됩니다. 라이브러리 품질의 영향을 입증하기 위해 두 가지 샘플을 비교했습니다. s2-20-15로 표시된 고품질 라이브러리는 두 개의 순차적 증폭 단계(첫 번째는 20 사이클, 두 번째는 15 사이클)로 구성된 표준 중첩 PCR 프로토콜을 사용하여 준비되었습니다. 이와는 대조적으로, s1-30으로 표시된 저품질 라이브러리는 Illumina 어댑터를 통합하기 위해 30 사이클의 단일 단계 PCR을 사용하여 준비되었습니다.

표 2에서 볼 수 있듯이 저품질 샘플은 형광과 qPCR 모두로 측정했을 때 고품질 샘플에 비해 라이브러리 농도가 낮습니다. 특히, qPCR 농도 측정은 형광 측정보다 NGS 라이브러리 품질에 대한 더 신뢰할 수 있는 지표입니다. 라이브러리는 바이오분석기를 사용하여 추가로 분석되었습니다. 저품질 샘플에서 약 83bp의 지...

토론

순방향 유전학 분석에서 게놈 워킹은 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리의 통합 부위를 프로파일링하는 데 필수적입니다. I-PCR 및 LAM-PCR과 같은 고전적인 게놈 워킹 방법은 종종 제한 효소 소화 및 결찰이 필요하며, 이는 라이브러리 복잡성을 줄이고 효소 부위 의존성으로 인한 편향을 유발할 수 있습니다 27,28,29. InSET 방법은 제한 분해 및 결찰 단계를 제거하여 이러한 한계를 극복합니다. 이는 측면 서열 지수 고정 PCR(FLEA-PCR)³⁷과 유사하지만 레트로바이러스 내부 서열의 증폭을 피하기 위해 블로킹 올리고뉴클레오티드의 사용을 생략함으로써 더욱 단순화됩니다. 대신 이러한 서열은 NGS 데이터 분석 중에 제거됩니다. NGS 응용 분야를 위해 설계된 InSET은 삽입 돌연변이 유발 세포 라이브러리에서 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.5 M EDTA	Invitrogen	AM9260G	바인딩 / 세척 버퍼
1 M Tris-HCl (Ph 8.0)	Invitrogen	15568025	바인딩 / 세척 버퍼
10 회를 만들기 위해; Klenow 프래그먼트 버퍼	Takara	2140A
10회; Taq 버퍼	Tiangen	ET101-01-01
5 M NaCl	Invitrogen	AM9659	바인딩 / 세척 버퍼
BeaverBeads Streptavidin	Beaver	22307-1	1 μ m
BEDTools		소프트웨어, v2	https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
BWA-MEM			소프트웨어, v0.7.12
dNTP 혼합물	Takara	4030	2.5 mM 각
Equalbit dsDNA HS 분석 키트	Vazyme	EQ111-02
fastp			소프트웨어
HiSeq X Ten	Illumina	SY-412-1001	Illumina 플랫폼, Novogene Corporation (Beijing)에 아웃소싱
Klenow Fragment	Takara	2140A
NovaSeq 6000	Illumina	20012850	Illumina 플랫폼, Novogene Corporation (Beijing)에 아웃소싱Qubit
3.0 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216
SICER			Software, v1.1
Taq DNA 중합효소	Tiangen	ET101-01-01
Tween-20	HuShi	30189328	바인딩/세척 버퍼
UltraPure 증류수	Invitrogen	10977015
VAHTS DNA 클린 비드	Vazyme	N411-01