방법 논문

HeLa 세포를 이용한 항-MDA5 자가항체 검출 및 광학 현미경을 이용한 면역세포화학(Immunocytochemistry)

DOI:

10.3791/67575

⸱

2025년 10월 31일

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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우리는 항-MDA5를 검출하기 위한 단계별 면역세포화학(ICC) 방법론을 제공합니다. 이 접근법에는 세포 고정, 투과화, 항체 배양 및 이미징 기술이 포함되며, 이를 통해 항-MDA5 자가항체를 정확하게 검출할 수 있어 근염 환자에서 빠르게 진행되는 간질성 폐질환의 진단에 도움이 됩니다.

초록

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항-MDA5 자가항체는 피부근염(DM), 근병성 피부근염(CADM) 및 다발성 근염(PM)에 대한 중요한 바이오마커이며, 특히 빠르게 진행되는 간질성 폐질환(RP-ILD)의 위험이 있는 환자를 식별하는 데 도움이 됩니다. 진단이 지연되면 예후가 좋지 않은 경우가 많기 때문에 이러한 자가항체의 조기 발견은 환자 결과를 개선하는 데 필수적입니다. 현재 방사면역분석법은 항-MDA5를 검출하기 위한 표준이지만 높은 비용, 긴 절차 및 전문 지식의 필요성으로 인해 사용이 제한됩니다. 또한, 널리 사용되는 임상 도구인 블롯 테스트는 MDA5 자가항체에 대해 높은 위양성률을 나타내어 잠재적으로 진단 정확도를 저하시킬 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 우리는 면역세포화학(ICC)을 사용하여 비방사성, 고감도 및 표준화된 확증 테스트 방법을 제안합니다. 이 프로토콜은 MDA5 구조물로 HeLa 세포를 처리하고, 1차 항-MDA5 자가항체의 결합을 촉진하기 위해 Triton X-100으로 세포를 투과화하고, 현미경 이미징을 위해 DAB 발색원과 효소 접합 2차 항체(예: 양 고추냉이 과산화효소)를 사용하여 결합 항체를 검출하는 것을 포함합니다. ICC는 세포 구조 내에서 항-MDA5 자가항체를 시각화하기 위한 실용적이고 비용 효율적이며 고감도의 접근 방식을 제공합니다. 이 연구는 ICC를 보충 확인 절차로 통합함으로써 항-MDA5 검출의 신뢰성을 향상시켜 DM, CADM 및 PM 환자의 RP-ILD에 대한 진단 및 예후 전략을 개선하는 것을 목표로 합니다.

서론

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일반적으로 근염이라고 하는 특발성 염증성 근병증(IIM)은 만성 근육 염증, 다양한 임상 증상 및 다양한 치료 결과를 특징으로 하는 이질적인 자가면역 질환 그룹입니다. 일반적인 증상으로는 근육 약화, 지구력 감소, 근육통등이 있습니다 1. IIM의 주요 하위 유형에는 다발성 근염(PM)과 피부근염(DM)이 포함되며, 임상적으로 근병성 피부근염(CADM)은 DM에서 볼 수 있는 것과 유사하지만 근육 침범이 최소화되거나 전혀 없는 특징적인 피부 발진으로 구별됩니다. PM, DM 및 CADM의 주요 합병증은 간질성 폐질환(ILD)으로, 이는 환자의 약 40%에 영향을 미치며 사망률 증가와 관련이 있습니다2.

IIM에서 ILD의 임상 경과와 예후는 매우 다양합니다. DM 및 CADM(DM-/CADM-ILD)과 관련된 ILD는 PM 관련 ILD에 비해 치료 저항성이 더 높고 예후가 더 나쁜 경향이 있습니다. 이 중3개월 이내에 빠르게 진행되는 급성 또는 아급성 ILD는 특히 심각하며, 5년 생존율은 52%에 불과한 반면, 진행이 느리거나 안정적으로 유지되는 만성 ILD는 87%로 보고되었습니다. 급성/아급성 ILD의 하위 유형인 급속 진행성 ILD(RP-ILD)는 호흡곤란의 빠른 발병과 흉부 영상에서 볼 수 있는 광범위한 폐포 손상을 특징으로 합니다. RP-ILD는 예후가 좋지 않은 생명을 위협하는 질환으로, 환자 결과를 개선하기 위한 조기 진단과 신속한 개입이 시급히 필요함을 강조합니다 4,5,6.

근염 특이 자가항체(MSA)는 근염 관련 ILD에서 중요한 바이오마커로 부상했으며, 항-MDA5 자가항체가 특히 중요한 역할을 합니다. 이러한 자가항체는 PM-/DM-/CADM-ILD 환자에서 자주 검출되며 RP-ILD 7,8,9에 대한 중요한 예후 지표 역할을 합니다. MDA5(흑색종 분화 관련 유전자 5)는 바이러스 및 미토콘드리아 이중 가닥 RNA를 검출하여 인터페론 매개 면역 반응을 시작하는 인터페론 유도 유전자에 의해 암호화되는 세포질 패턴 인식 수용체입니다10. 정확한 병원성 기전은 불분명하지만 항-MDA5 자가항체는 MDA5 기능을 방해하여 자가면역 병인에 기여하는 것으로 여겨집니다.

RP-ILD의 조기 식별 및 관리를 위해서는 항-MDA5 자가항체의 적시 검출이 필수적입니다. 전통적으로 35개의 S-메티오닌 표지 K562 세포 추출물을 사용하는 방사성 표지 면역침전(IP)은 항-MDA5 자가항체를 검출하기 위한 황금 표준으로 간주되어 왔습니다11. 그러나 이 방법은 높은 비용, 전문 장비 및 숙련된 인력에 대한 의존도, 엄격한 방사성 폐기물 처리 규정, 방사성 표지 시약의 제한된 유통기한으로 인해 일상적인 임상 사용에는 실용적이지 않습니다. 임상 실습에서 블롯 분석은 일반적으로 대안으로 사용됩니다. 그러나 항-MDA5 자가항체에 대한 높은 위양성률과 관련이 있으며12,13 진단 정확도에 대한 우려가 제기됩니다. 결과적으로, 긍정적인 결과를 검증하고 진단 신뢰도를 향상시키기 위해 신뢰할 수 있는 비방사성 확증 분석이 시급히 필요합니다.

이러한 격차를 해소하기 위해 우리는 항-MDA5 자가항체에 대한 보충 확증 테스트로 면역세포화학(ICC)을 사용할 것을 제안합니다. 이 접근법은 HeLa 세포를 MDA5 구조물로 형질감염시키고, 세포를 환자 혈장과 배양하고, 광학 현미경 하에서 시각화를 위해 발색 기질과 결합된 효소 결합 2차 항체(예: 양 고추냉이 과산화효소)를 사용하여 결합된 항-MDA5 자가항체를 검출하는 것을 포함합니다. ICC는 세포 구획 내에서 항-MDA5 자가항체를 시각화하기 위한 비방사성, 고감도 및 표준화된 플랫폼을 제공합니다. ICC를 블롯 분석과 통합함으로써 이 방법은 위양성률을 줄이고 진단 정확도를 향상시키며 궁극적으로 환자의 임상 관리 및 결과를 향상시키는 것을 목표로 합니다.

이 연구의 목적은 항-MDA5 자가항체 검출을 위한 강력한 비방사성 프로토콜을 확립하여 현재 검출 방법의 한계를 해결하고 임상의에게 PM, DM 및 CADM 환자의 RP-ILD의 조기 진단을 위한 실용적이고 신뢰할 수 있는 도구를 제공하는 것입니다. 함께 제공되는 비디오 내레이션에서 이 생명을 위협하는 과정은 구어체로 '급속한 죽음'으로 묘사됩니다. 과학적으로는 급속 진행성 ILD(RP-ILD)에 해당합니다. 이 연구는 기존 증거를 기반으로 하며 임상 실습에서 예후 평가 및 치료 의사 결정을 크게 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

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프로토콜

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1. 세포 배양 및 형질감염

  1. 가습된 5% CO2 분위기에서 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 항생제-항진균제를 함유한 Dulbecco의 변형 이글 배지로 HeLa 세포를 37°C에서 유지합니다.
  2. 2-3일마다 또는 세포가 90%-100% 합류에 도달하면 세포를 계대시킵니다.
  3. 형질감염 24시간 전에 24웰 플레이트(1.9cm2/웰)의 각 웰에 7 ×10 4개의 HeLa 세포를 시드하여 세포가 약 90% 합류에 도달하도록 합니다.
  4. 500ng의 플라스미드(pENTER-MDA5)와 1.5μL의 형질감염 시약을 각각 25μL의 환원 혈청 배지에 희석합니다.
  5. 희석된 형질감염 시약에 희석된 DNA를 첨가합니다(1:1 비율). 잘 섞고 5분 동안 배양합니다.
  6. 혼합물을 하루 전에 시드된 세포에 첨가하고 교반하여 DNA-지질 복합체를 즉시 혼합합니다. 세포가 80%-90% 합류하는지 확인합니다.
  7. 가습된 5% CO2 분위기에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양하고 ICC 수행을 진행합니다.
    참고: 우리는 상업적으로 이용 가능한 벡터(pEnter-MDA5)를 사용했습니다. 자세한 내용은 재료 표 에서 확인할 수 있습니다. 형질감염 효능은 ~50%입니다.
    형질감염 및 표적 단백질의 발현의 성공 여부는 형광 단백질 발현 플라스미드로 세포를 형질감염시키고 웨스턴 블롯을 수행하여 표적 단백질의 발현을 시각화함으로써 결정할 수 있습니다.

2. 세포 고정

  1. 배양 후 PBS로 세포를 2회 세척하여 남아 있는 배지를 제거합니다.
    알림: 오비탈 셰이커에서 플레이트를 흔들어 세척할 수 있습니다.
  2. PBS의 4% 파라포름알데히드에 세포를 고정합니다. 세포를 실온에서 15분 동안 그대로 둡니다.
    주의: 파라포름알데히드는 독성이 있습니다. 적절한 취급 지침을 사용하십시오.
  3. 고정 시약을 흡인하고 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척합니다.

3. 세포 투과성

  1. Triton X-100 시약(PBS에서 0.3%)을 넣고 세포를 실온에서 10분 동안 그대로 둡니다.
  2. 10분 후 세제를 버립니다.
  3. PBS를 첨가하여 세포를 한 번 세척합니다.

4. 세포 차단

  1. PBS(1x)에서 10% 소 태아 혈청으로 블로킹을 수행하고 실온에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
  2. 차단 시약을 제거한 다음 PBS를 첨가하여 세포를 한 번 세척합니다.

5. 환자 항체의 혼성화

  1. 희석된 환자 혈장을 세포에 첨가합니다. 사용하기 전에 환자 샘플(PBS에서 1:5,000 희석)을 PBS로 희석하십시오.
    알림: 희석을 조정하여 신호를 향상시키거나 필요에 따라 배경을 줄입니다. 편견 없는 결과를 보장하기 위해 검사를 수행하는 직원은 어떤 샘플이 환자의 것이고 어떤 샘플이 건강한 개인의 것인지 전혀 알지 못했습니다.
  2. 샘플을 4°C에서 12-16시간(하룻밤) 동안 배양합니다.
  3. 배양 기간 후, 환자 샘플을 제거하고 PBS로 세포를 3회 세척합니다.

6. 2차 항체의 혼성화

  1. 희석된 양 고추냉이 과산화효소 접합 염소 항인간 IgG(PBS에서 1:250 희석)로 세포를 처리하고 실온에서 1시간 동안 세포를 방치합니다.
  2. 한 시간 후 2차 항체를 폐기합니다.
  3. PBS 3x로 헹굽니다.

7. 세포 염색

  1. 세포를 세척한 후 300μL의 DAB 작업 용액/웰로 세포를 염색합니다.
    참고: 이 용액은 제조업체의 지침에 따라 DAB 발색제 농축액과 DAB 희석제를 혼합하여 제조되었습니다.
  2. 세포를 5분 동안 염색한 후 염료를 제거하고 탈이온수 증류수로 헹구고 5분 동안 흔듭니다.

8. 세포 대조염색

  1. 희석된 헤마트실린으로 세포핵을 대조염색합니다.
    참고: Hematoxylin Gill II를 10배 희석하여 사용하고 염색 과정을 위해 5분 동안 기다립니다.
  2. 5분 후 헤마톡실린을 폐기한 다음 탈이온화 증류수로 2 x 5분 동안 세척합니다.

9. 관찰

  1. 광학 현미경을 사용하여 염색 결과를 관찰합니다.
    참고: 진양성은 MDA5를 발현하는 HeLa 세포 내부에 강한 갈색 염색을 나타냅니다. 이것은 환자 샘플에서 항-MDA5 자가항체를 확인합니다. 음성 결과는 갈색 염색이 없는 HeLa 세포를 나타내며, 이는 항-MDA5 자가항체가 없음을 나타냅니다. 위양성 결과는 MDA5 발현에 관계없이 모든 세포에서 광범위한 갈색 염색을 보여줍니다. 다른 자가면역 질환에서 볼 수 있는 이 비특이적 염색은 오진을 피하기 위해 진양성과 구별되어야 합니다.

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결과

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테스트를 수행하는 직원은 평가 과정에서 잠재적인 편향을 최소화하기 위해 샘플을 채취한 특정 환자를 포함하여 샘플의 신원에 대해 눈이 멀었습니다. 그러나 건강한 대조군 샘플은 눈가림을 받지 않았지만 일관되게 명확하고 명확한 결과를 생성했습니다.

그림 1A 는 pENTER-MDA5 구조물로 형질감염된 HeLa 세포에서 MDA5의 성공적인 발현을 보여줍니다. 형질감염 효율을 검증하기 위해 상용 항-MDA5 항체를 사용하여 ICC를 수행했습니다. 형질감염된 세포의 약 50%에서 강한 갈색 세포질 염색이 관찰되었으며, 이는 강력한 MDA5 단백질 발현을 나타냅니다. 대조적으로, 동일한 조건에서 처리된 형질감염되지 않은 세포는 세포질 염색을 나타내지 않아 항체의 특이성과 내인성 MDA5 발현의 부재를 확인했습니다.

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토론

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항-MDA5 자가항체를 식별하기 위한 당사의 ICC 기반 기술은 라인 블롯 분석 및 방사면역분석과 같은 기존 방법에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 이전에, Nombel et al. 23명의 항-MDA5 양성 피부근염 환자와 22명의 항-MDA5 음성 대조군 코호트에서 MDA5 형질감염 세포의 간접 면역형광(IIF)을 ELISA와 비교하여 각각 96% 및 100%의 민감도 및 특이도 값을 보고했습니다14. 그러나 이 ELISA는 상업적으로 이용 가능하지 않으며 연구용으로만 사용됩니다. 이러한 결과를 바탕으로 본 연구는 ICC 기반 탐지 프로토콜의 개발 및 시연에 중점을 둡니다. 방사면역분석법과 달리 당사의 ICC 접근법은 비방사성이므로 더 안전하고 환경 친화적입니다. 이러한 장점 외에도 ICC 프로토콜은 방사성 표지 분석에 비해 처리 시간을 단축하여 샘플 처리의 효율성을 향상시키고 보다 신속한 임상 의사 결정을 가능하게 합니다...

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공개 사항

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저자는 선언할 경쟁 이해관계가 없습니다.

이 원고의 일부는 OpenAI의 GPT-4의 도움으로 생성되었습니다. 저자는 정확성과 독창성을 보장하기 위해 내용을 검토하고 편집했습니다.

감사의 글

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이 작업은 Jye-Lin Hsu(NSTC 114-2320-B-039-038 및 NSTC 113-2320-B-039-032)에게 수여된 대만 국가과학기술위원회의 보조금으로 지원되었습니다. 이 연구는 또한 Jye-Lin Hsu(CMU113-MF-89 및 C1110812016-12)에게 수여된 중국 의과대학 및 병원 보조금의 부분적으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
24웰 플레이트 (1.9cm²/well)코 닝354541
항생제-항균제.깁코15240062
비커파이렉스1000-600
원뿔관 (15 mL)코 닝430052
원뿔관 (50 mL)코 닝430290
이온 제거 증류수저희의 탈이온화 증류수는 Milli-Q 시스템을 사용하여 자체 생산됩니다(1열: Quantum TEX, SN: F4EB53476; 2열: 프리팍, SN: F1CB11442)
태아 소 혈청 특성화시티바SH30396.03
눈금식 실린더 (50 mL)비틀랩64804
헤마톡실린 질 II라이카3801522
하이클론 둘베코' 고포도당 변형 이글 미디엄시티바SH30243.02
리포펙타민 2000 형질전환 시험인비트로젠11668019트랜스펙션 시약
MDA-5 (D74E4) 토끼 mAb세포 신호 전달 기술5321
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL 에펜도르프 튜브)액시젠142503
옵티-MEM I 환원 혈청 배지깁코31985070
궤도 셰이커 (선택 사항)퍼스트렉S300R
파라포름알데히드시그마-올드리치1배 PBS에서 4%
PBS프로 테크ME222605
pENTER-MDA5비진 바이오사이언스 주식회사CH863586
페르옥시다제 아피니퓨어 염소 항인간 IgG (H+L)잭슨 면역연구소109-035-003
피펫 컨트롤러써모 사이언티픽130165
피페테스 길슨
피펫과 피펫 팁(10 & micro; L)QSP104-Q
피펫과 피펫 팁(200 & 마이크로; L)QSPT090-Q
피펫과 피펫 팁(1000 & micro; L)QSP111-Q
혈청학적 피펫 (5 mL)SPL91005
혈청학적 피펫 (10 mL)SPL91010
혈청학적 피펫 (25 mL)SPL91025
SignalStain DAB 기판 키트세포 신호 전달8059PBS 0.3%

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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태그

Triton X 100DAB2

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