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방법 논문

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation

2.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/67598

⸱

2024년 11월 29일

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

이 논문에서

요약

여기에서는 전기천공법에 의한 절쇄된 인간 피질 오가노이드의 급성 유전자 조작을 제시합니다. 이러한 피질 오가노이드 모델은 절단 후 심실과 같은 구조를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 특히 주입이 용이하여 인간의 피질 발달, 신경 발달 장애 및 피질 진화에 대한 기능적 연구를 가능하게 합니다.

초록

인간 피질 오가노이드는 인간의 뇌 발달, 신경 발달 장애 및 인간 뇌 진화를 연구하는 데 중요한 도구가 되었습니다. 과발현 또는 녹아웃에 의한 유전자 기능을 분석하는 연구는 신피질 발달 조절에 대한 기계론적 통찰력을 제공하기 위해 동물 모델에서 중요한 역할을 했습니다. 여기에서는 절편화된 인간 피질 오가노이드의 전기천공법에 의한 CRISPR/Cas9 매개 급성 유전자 녹아웃에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 피질 오가노이드의 절단은 주입 및 후속 전기천공을 위한 심실 유사 구조의 식별을 돕기 때문에 인간 피질 발달 중 급성 유전자 조작에 특히 적합한 모델입니다. 가이드 RNA의 설계와 in vitro 및 in cortical organoids의 표적화 효율성 검증에 대해 설명합니다. 피질 오가노이드의 전기천공은 중간 신경인성 단계에서 수행되어 정점 요골 신경교세포, 기저 전구 세포 및 뉴런을 포함하여 발달 중인 신피질에서 대부분의 주요 세포 클래스를 표적화할 수 있습니다. 종합하면, 절편화된 인간 피질 오가노이드의 전기천공법은 피질 발달 중 유전자 기능, 유전자 조절 및 세포 형태를 조사하는 강력한 기술을 나타냅니다.

서론

신피질(neocortex)은 대뇌 반구의 바깥쪽을 덮는 것을 말하며 포유류 특유의 구조입니다. 신피질(neocortex)은 더 높은 인지 기능의 자리를 나타냅니다 1,2,3,4,5. 발달 과정에서 신경줄기세포와 전구세포는 신경발생(neurogenesis)이라고 하는 과정에서 뉴런을 생성합니다. 인간의 신피질 발달을 조사하는 기능적 연구는 인간의 신경 줄기세포 조절, 신경 병리학 및 인간의 뇌 진화의 기저에 있는 메커니즘을 설명하기 위한 기초를 제공합니다 2,6,7.

역사적으로 인간의 뇌 발달에 대한 연구는 사후 조직을 사용한 기술적 조직학적 접근 방식에 의존했으며, 보다 최근의 자유 부유 조직 배양 시스템은 인간 태아 조직을 이용한 기능적 연구를 가능하게 했습니다 8,9. 또한, 인간 태아의 뇌 조직은 장기적으로 확장되는 오가노이드로 자가 조직화할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로 나타났습니다10. 태아 조직 연구는 인간 발달에 대한 중요한 통찰력을 제공했지만, 11,12 조직의 가용성이 제한되고 윤리적 고려 사항이 인간의 뇌 발달에 대한 기계론적 연구에 대한 광범위한 적용에 제한을 받았습니다. 지난 10년 동안 인간 유도 PSC(hiPSC)를 포함한 인간 만능 줄기세포(hPSC)에서 3차원 신경 오가노이드를 생성할 수 있는 프로토콜이 개발되었습니다13,14.

대뇌 오가노이드는 뇌실과 같은 구조의 형성, apicobasal polarity, 피질 세포 구조, 요골 신경교세포 분열 중 interkinetic nuclear migration 및 neuronal migration과 같은 발달 중인 뇌의 중요한 특징을 나타냅니다. 중요한 것은, 이러한 새로운 인간 오가노이드 모델은 진화적으로 관련된 주요 신경 전구 유형, 특히 기저 요골 신경교세포(또는 외요골 신경교세포)를 포함하여 마우스에서 잘 모델링되지 않은 인간 발달 뇌의 특성을 요약한다는 것입니다7,14,15. 오가노이드 이질성 문제, 내핵에 대한 제한된 영양 공급, 다양한 지역 정체성과 같은 초기 대뇌 오가노이드 프로토콜의 몇 가지 한계가 최근 프로토콜 발전에서 해결되었으며 향후 몇 년 동안 추가 개선이 예상될 수 있습니다 15,16,17,18,19. 인간의 대뇌 및 피질 오가노이드는 인간의 피질 발달 20, 신경 장애21,22,23,24 및 뇌 진화 25,26,27,28,29를 연구하고 대규모 스크리닝 접근법30,31,32을 수행하는 핵심 모델로 빠르게 자리 잡았습니다.

급성 유전자 조작의 경우, 두 가지 방법이 주로 신피질 발달의 동물 모델에 사용되어 왔습니다 : 표적 세포33 및 자궁 내 또는 체외 electroporation34 , 35의 감염에 의한 바이러스 전달. DNA를 주입한 후, 최근에는 CRISPR/Cas9 리보핵단백질(RNP) 복합체36을 외측심실에 주입한 후 전기천공법을 시행하면 전기천공법의 방향에 따라 뇌의 특정 영역을 표적으로 삼을 수 있는 이점이 있습니다. 전기천공법은 일시적으로 세포막 투과성을 증가시키는 짧은 전기 펄스를 포함하여 DNA 및 기타 전하를 띤 분자를 세포에 도입할 수 있습니다. 자궁 내 전기천공법은 생쥐에서 처음 시행되었으며,37 이 실험에서 발생 신경생물학에 널리 적용되는 방법론이 되었습니다. 이 방법은 이후 쥐38,39 및 페럿40,41,42, 신피질 확장 및 피질 접 힘 3,43,44,45를 연구하는 데 사용되는 회뇌 종과 같은 다른 종에도 적용되었습니다.

전기천공법은 또한 인간의 뇌 오가노이드 연구에서 중요한 방법이 되었다46. 대뇌 오가노이드(cerebral organoids)에서, 전기천공법(electroporation)은 세포 형태 및 뉴런 축삭돌기(neuronal axons)를 시각화하고(14,47), 유전자 녹다운(gene knockdown) 시약22,48,49을 전달하며, 과발현(overexpression 50)에 의한 유전자 기능을 조사하기 위해 적용되었습니다. 이 방법은 인간 모델에 국한되지 않고 영장류 대뇌 오가노이드의 유전자 변형에도 적용되었습니다50,51. 더욱이, Spin Ω spinning bioreactor에서 생성된 피질 오가노이드의 전기천공이 설명되었다52.

이 프로토콜에서는 피질 발달의 유전자 기능 연구를 위해 절편화된 인간 피질 오가노이드15의 전기천공을 간략하게 설명합니다. 뇌 부위 특이적 오가노이드는 재현성과 일관성을 높이며, 이는 예를 들어 질병 모델링과 같은 정량 분석의 성공에 매우 중요합니다. sliced human cortical organoid protocol15에서, iPSC 분화 중에 강력한 패터닝 큐가 적용되어 dorsal forebrain 전구세포의 균일한 집단을 얻은 다음, 더 적은 지시 신호로 조직 성장을 촉진하는 배양 배지를 적용한다53,54. 피질 오가노이드(cortical organoid)의 절단은 오가노이드 코어(organoid core)에서 영양분과 산소의 가용성 감소로 인한 세포 사멸을 감소시키는 것으로 나타났습니다15. 더욱이, 슬라이싱은 풍부한 기저 요골 신경교세포(basal radial glia)를 포함하는 심실과 같은 구조의 발달을 지원하며, 지속적인 신경 발생은 확장된 피질 플레이트(plate-like region)의 형성으로 이어진다15. 이 프로토콜에서 반복적으로 슬라이싱하면 심실 내강이 쉽게 식별되고 주사로 표적화될 수 있기 때문에 이러한 피질 오가노이드를 전기천공에 특히 적합하게 만듭니다. 얇게 썬 피질 오가노이드의 전기천공법은 유전자 조절 영역과 피질 진화를 연구하기 위해 적용되었습니다26,55.

전기천공법(electroporation) 절차 동안, 주입 혼합물은 심실과 같은 구조의 내강(lum)으로 전달됩니다. 펄스 전기장이 가해지면 심실을 둘러싸고 있는 정점 방사형 신경교세포(apical radial glia)가 혼합물을 흡수합니다. 정점 요골 신경교세포(apical radial glia)가 분열하여 더 헌신적인 세포 유형4을 생성함에 따라, 전기천공된 물질은 기저 전구 세포와 뉴런으로 전달됩니다. 전기천공된 자손은 3일 후에 심실 영역(VZ)과 심실하 영역(SVZ)에 분포하며 중간 신경성 단계에서 전기천공 후 7일에 피질 플레이트(CP)와 같은 영역을 포함한 대부분의 피질 벽에 걸쳐 있습니다26,55.

여기에서는 절편화된 인간 피질 오가노이드(human cortical organoids)에서 전기천공법(electroporation)에 의한 CRISPR/Cas9 매개 유전자 파괴56 26에 대해 설명합니다. 또한 전기천공법은 유전자 과발현, 형광 단백질 발현에 의한 세포 형태 및 세포 과정의 시각화, MPRA(Massive Parallel Reporter Assay)를 위한 플라스미드 라이브러리 전달, 후성유전체 편집 도구 제공 및 라이브 이미징을 위한 세포 라벨링에도 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)와 관련된 모든 실험은 1964년 헬싱키 선언에 명시된 윤리적 기준에 따라 수행되었으며 드레스덴 대학 병원 윤리 검토 위원회(IRB00001473; IORG0001076; 윤리 승인 번호 SR-EK-456092021).

1. 급성 CRISPR/Cas9 매개 유전자 knockout을 위한 guide RNA 설계

  1. 소프트웨어 또는 온라인 도구를 사용하여 단백질 파괴 가능성을 높이기 위해 protospacer 인접 모티프(PAM) 사이의 이상적으로 7-11 bp(3 bp의 배수 방지)의 거리로 동일한 엑손을 표적으로 하는 한 쌍의 가이드 RNA(gRNA)를 설계합니다.
    참고: 이상적으로는 기능적 영역을 인코딩하는 엑손을 대상으로 해야 합니다. 또는 전사체의 첫 번째 엑손을 선택할 수 있습니다(그림 1A). activity score(1에 가까움)57 및 specificity score(100%에 가까움)58에 따라 guide RNA를 선택합니다.

2. 인간 유도 만능 줄기 세포의 배양

  1. 인간 피질 오가노이드를 생성하고 gRNA 기능을 검증하기 위해 건강한 기증자에서 유래한 hiPSC 라인 CRTDi004-A59 를 사용하십시오.
  2. 앞서 설명한 바와 같이 표준 조건(37°C, 5% CO2)에서 줄기세포 배지에 코팅된 6웰 플레이트에60을 코팅한 기저막 매트릭스에서 iPSC를 배양합니다. 유도된 PSC는 처음 24시간 동안 ROCK 경로 억제제(1:1,000)를 보충하여 단세포 해리를 위한 효소를 사용하여 80% 포화도에서 계대배후를 측정해야 합니다.
    참고: 다른 iPSC 라인은 오가노이드 생성 및 gRNA 검증에 사용될 수 있습니다.

3. 인간에 의하여 유도된 만능 줄기 세포에서 게놈 DNA의 적출

  1. 게놈 DNA 추출을 위해 6웰 플레이트의 80%-90% 융합 hiPSC의 2웰을 사용합니다. 효소로 플레이트에서 세포를 해리하여 단일 세포 현탁액을 만듭니다. 줄기 세포 배지 1mL(총 부피)에 세포를 넣은 다음 600 x g 에서 10분 동안 회전하고 상층액을 제거합니다.
  2. 250μL의 용해 완충액(50mM TrisHCl(pH 7.5), 100mM NaCl, 0.5% SDS, H2O에서 5mM EDTA) 및 12.5μL의 Proteinase K(10mg/mL stock)에 세포 펠렛을 재현탁합니다. 55 °C 및 250 rpm에서 2 시간 동안 배양합니다.
  3. 100μL의 5mM NaCl을 혼합합니다. 4°C에서 18,000 x g 로 10분 동안 회전하고 상등액을 새로운 1.5mL 반응 튜브로 옮깁니다.
  4. 250μL의 이소프로판올을 첨가하고 튜브를 여러 번 뒤집은 다음 4°C에서 18,000 x g 로 15분 동안 회전합니다.
  5. 상층액을 제거하고 500μL의 70% EtOH(분자생물학 등급)로 세척한 후 튜브를 뒤집고 4°C에서 18,000 x g 로 10분 동안 회전합니다.
  6. 마지막으로, 상층액을 조심스럽게 피펫으로 분리하고 열린 반응 튜브를 종이 타월에 눌러 상층액을 완전히 제거합니다.
  7. 펠릿을 RT에서 10분 동안 자연 건조시킨 다음 37°C에서 30분 동안 100μL의 뉴클레아제가 없는 물에 펠릿을 용해시킵니다.
  8. 분광계로 DNA의 농도를 측정합니다. 분리된 게놈 DNA는 -20°C에서 수개월 동안 안정적입니다.

4. gRNA에 의한 template recognition 검증 (in vitro)

참고: gRNA에 의한 성공적인 템플릿 인식을 검증하는 첫 번째 방법으로, 이중 가닥 DNA가 아가로스 겔 전기영동 40,61,62로 구별될 수 있는 두 개의 단편으로 절단되는 시험관 내 Cas9 반응을 수행합니다.

  1. 템플릿을 생성하기 위해 다음 사이클링 조건을 사용하여 hiPSC(섹션 3)에서 분리된 게놈 DNA에 대해 고충실도 PCR 마스터 믹스와 10μM 프라이머로 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행합니다: 98°C에서 30초, 40사이클 동안 초기 변성[98°C, 10초; 60°C, 30초; 72°C, 1분] 및 72°C에서 5분 동안 최종 연신율.
    1. PCR 프라이머에 따라 어닐링 온도를 조정합니다. 앰플리콘의 크기가 800 bp - 1.5 kb이고 gRNA 결합 부위의 비대칭 국소화가 가능한지 확인합니다.
    2. 1.5% 아가로스 겔에 겔 전기영동으로 PCR 산물을 분해하고 겔에서 해당 밴드를 절단하고 DNA26을 추출합니다.
    3. 분광계로 추출된 PCR 산물의 DNA 농도를 측정합니다.
  2. nuclease-free duplex buffer(총 부피 5μL)에서 10μM의 CRISPR RNA(crRNA, 맞춤형 염기서열, 100μM stock)와 10μM tracrRNA(100μM stock)를 결합하여 기능적 gRNA를 조립합니다. 혼합물을 95°C에서 5분 동안 배양한 다음 실온(RT)으로 식힙니다.
  3. 4.2단계의 gRNA 10μM와 1μM Cas9 효소( 연쇄상구균 화농성체에서 추출, 62μM 스톡)를 PBS에서 RT(총 부피 25μL)에서 15분 동안 결합하여 리보핵단백질(RNP) 복합체를 생성합니다.
  4. 시험관 내 분해 반응을 수행하려면 1μM의 RNP 복합체(단계 4.3)를 0.1μM DNA 템플릿(단계 4.1의 PCR 산물) 및 1x Cas9 뉴클레아제 반응 완충액(200mM HEPES, 1M NaCl, 50mM MgCl2, 1mM EDTA 함유, pH 6.5, -20°C에서 분취량에 보관 가능)과 혼합합니다.
    1. 최종 부피 10μL까지 뉴클레아제가 없는 물로 채웁니다.
    2. 37°C에서 1시간 동안 반응을 배양합니다.
    3. 2 mg/mL Proteinase K를 첨가하고 56 °C에서 10분 더 배양하여 Cas9 효소에서 DNA 기질을 분리합니다. 분해된 반응 혼합물을 최종 분석까지 4 °C 또는 -20 °C에서 보관하십시오.
      참고: 최상의 분할 효율을 얻으려면 Cas9-RNP:DNA 기질의 10:1 몰비를 사용하는 것이 좋습니다. 필요한 경우 PCR 산물을 뉴클레아제가 없는 물에 필요한 농도로 희석합니다. 음성 대조군으로, gRNA 또는 Cas9 효소가 결핍된 반응 혼합물을 함께 사용할 수 있습니다.
  5. 2% 아가로스 겔에서 아가로스 겔 전기영동으로 절단된 산물을 시각화합니다.
    참고: 이상적으로는 서로 다른 크기의 두 개의 band가 보여야 하며 효율적인 gRNA를 위해 template band가 사라지거나 크게 줄어야 합니다(그림 1B).

5. 인간 유도 만능 줄기 세포에서 gRNA 기능 검증

참고: 피질 오가노이드(cortical organoids)가 생성되는 동일한 세포주를 타겟으로 하는 gRNA의 효율성을 테스트하는 것이 좋습니다26. 이를 위해 관련 gRNA를 포함하는 RNP 복합체를 GFP 발현 플라스미드와 함께 hiPSC로 동시 transfection하고, 세포를 3일 동안 배양한 다음, 염기서열분석 분석을 위해 게놈 DNA를 분리합니다. 각 gRNA 검사에는 약 200,000개의 세포가 필요합니다. 세포는 70%-80% 이상의 융합도를 가지지 않아야 하며 해동 후 최소 2회 계대에 도달해야 합니다. 음성 대조군(gLACZ)36,63 및 모의 조건(RNP가 없는 핵 펙션 용액)을 함께 사용하는 것이 중요합니다.

  1. 세포 배양 후드에서 세포의 생존율을 증가시키기 위해 실험 2시간 전에 ROCK 억제제(1:1,000)를 포함하도록 hiPSC의 배지를 변경합니다.
  2. 6-well plate의 적절한 수의 well을 basal membrane matrix로 코팅합니다.
  3. nucleofector unit(16-well strips의 경우 "X unit")을 시작하고 사전 프로그래밍된 대로 "ES cells, H9" 프로그램(pulse CB150)을 선택합니다. 스트립의 적절한 웰 수를 선택합니다.
  4. Duplex Buffer에서 24 μM crRNA와 24 μM tracrRNA를 결합하여 RNP 복합체를 준비합니다.
    1. 95 ° C에서 5 분 동안 배양 한 다음 4.2 단계에서 설명한대로 RT로 식히십시오.
    2. 그 동안 Cas9 효소를 PBS에서 8μM로 희석합니다.
    3. 3 μL의 gRNA와 3 μL의 Cas9를 결합하고 RT에서 15분 동안 배양하여 RNP를 조립합니다.
      참고: 3:1 gRNA:Cas9의 몰비는 최적의 절단 효율을 제공합니다. gRNA를 한 쌍으로 테스트하려면 각 RNP를 별도로 준비하고 마지막에 각 RNP의 1.5 μL를 결합합니다.
  5. 15분 RNP 배양 동안 세포 배양 후드 아래에서 핵 절제를 위해 hiPSC를 준비합니다.
    1. 기저막 코팅을 ROCK 억제제(1:1,000)가 보충된 줄기세포 배지 1.5mL와 웰당 1x 페니실린/스트렙토마이신으로 교체합니다.
    2. 제조업체의 지침에 따라 얼음 위에 마스터 믹스로 nucleofection solution을 준비합니다.
    3. 플레이트에서 hiPSC를 분리하여 단일 세포 현탁액을 만들고(섹션 2 참조) Neubauer 계수 챔버에서 Trypan Blue 염색이 가능한 세포를 계수합니다.
    4. gRNA 쌍당 200,000개의 살아있는 세포를 600 x g 에서 5분 동안 펠릿화합니다.
  6. 세포 배양 후드의 얼음 위에 20μL의 핵 펙션 용액에 3μL의 RNP와 0.2μg/μL pCAG-GFP 플라스미드를 추가합니다.
  7. 펠릿화된 세포를 최종 핵 펙션 혼합물의 23 μL에 재현탁시키고 얼음 위의 16-웰 핵 펙션 스트립의 1 웰로 옮깁니다.
  8. 모든 조건이 스트립에 있으면 후드 외부의 핵 ector 기계 X 장치에 놓고 시작 버튼을 눌러 핵 절단을 시작합니다.
  9. 그 후, nucleofection strip을 세포 배양 후드 아래로 다시 운반하고 plate의 일부 배지로 strip-well을 헹궈서 nucleofection된 세포를 준비된 6-well plate로 이동시킵니다.
  10. 3일 동안 hiPSC를 배양하고 매일 1x 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 배지를 변경합니다. 24시간이 지나면 ROCK 억제제가 더 이상 필요하지 않습니다.
  11. 기존 형광 현미경에서 GFP 신호를 확인합니다(그림 1C).
    1. 3일차에는 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 통해 GFP 양성 세포를 분류하고 수집합니다.
    2. PBS에 2% FBS로 분류 버퍼를 준비하고 4°C를 유지합니다.
    3. 탁상용 원심분리기를 4°C로 식힙니다. 얼음 위에서 FACS 후 세포를 채취하기 위해 ROCK 억제제(1:1,000)를 함유한 50μL 분류 버퍼가 있는 1.5mL 반응 튜브와 얼음 위에서 세포 여과기 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브를 준비합니다.
    4. 핵이 형성된 세포의 단세포 현탁액을 만듭니다.
    5. 샘플당 ROCK inhibitor(1:1,000)가 포함된 줄기세포 배지 1mL에 세포를 재현탁하고 600 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
    6. 상층액을 제거하고 ROCK inhibitor (1:1,000)로 200 μL의 sorting buffer에 세포를 재현탁시킨 후 0.4 μL의 DAPI(2 ng/μL)를 첨가하여 FACS로 살아있는 세포를 동정합니다.
    7. 냉각된 둥근 바닥 튜브의 세포 스트레이너 캡을 통해 세포 용액을 피펫으로 주입하여 잔류 세포 덩어리를 제거합니다.
      참고: DAPI는 시간이 지남에 따라 세포 생존력을 손상시킬 수 있으므로 분류하기 전에 각 샘플에 새로운 것을 첨가하는 것이 가장 좋습니다.
    8. 10,000개의 살아있는 GFP 양성(DAPI 음성) 세포를 ROCK 억제제(얼음 위)가 포함된 50μL의 분류 버퍼가 있는 이전에 준비된 1.5mL 반응 튜브에 분류합니다.
  12. FACS 후 분류된 세포에서 게놈 DNA를 직접 추출합니다.
    1. 분류 버퍼에서 수집 및 정렬된 셀을 600 x g 에서 10분 동안 스핀다운합니다.
    2. 상층액을 제거하고 샘플당 250μL의 용해 완충액과 12.5μL의 Proteinase K에서 세포 펠렛을 흡수합니다.
    3. 섹션 3에 설명된 대로 계속합니다.
    4. 마지막으로 DNA 펠릿을 뉴클레아제가 없는 물 50μL에 용해시킵니다.
  13. PCR을 수행하여 4.1단계에서 설명한 대로 Sanger 염기서열분석을 위한 템플릿을 생성합니다. 대조군으로, gLACZ 조건의 DNA와 관심 유전자를 표적으로 하는 프라이머(섹션 4에서 사용된 것과 동일한 프라이머)를 사용합니다. 아가로스 겔 전기영동에서 적절한 밴드를 추출하고, 컬럼 위에서 정제한 다음, Sanger 염기서열분석을 위해 보냅니다.
  14. Align: Sanger 염기서열분석 결과는 쌍별, 글로벌 정렬을 사용하여 수행됩니다.
    참고: 성공적인 표적화는 gRNA 결합 부위 주변의 무작위 삽입/삭제로 인한 중첩된 신호 또는 불완전한 염기서열로 식별할 수 있습니다(그림 1D).

6. 얇게 썬 인간 피질 오가노이드의 생성

참고: 인간 피질 오가노이드(hCO)는 앞서 자세히 설명한 바와 같이 절편화된 신피질 오가노이드(SNO) 방법에 따라 생성됩니다15,60.

  1. 인큐베이터에서 37°C에서 30-40분 동안 배양하여 1mg/mL 콜라겐분해효소가 포함된 6웰 플레이트의 1웰에서 작은 hiPSC 콜로니를 분리합니다. 그 동안, 새로운 6-well 플레이트를 기저막 매트릭스로 코팅합니다.
    1. 1mL의 줄기세포 배지로 효소를 중지하고 15mL 원뿔형 튜브에서 5mL의 줄기세포 배지에 넓은 구멍의 팁으로 콜로니를 수집합니다.
      알림: "넓은 구경의 피펫 팁"을 언급하는 모든 단계는 직경이 최소 2mm인 개구부로 절단된 팁으로도 수행할 수 있습니다.
    2. 군체가 바닥에 정착하면 오래된 배지를 제거하고 새로운 줄기 세포 배지로 교체합니다.
    3. 광역 팁을 사용하여 웰당 1.5mL의 줄기세포 배지가 있는 코팅된 6웰 플레이트에 콜로니를 고르게 분배합니다.
    4. 표준 조건에서 2-3일 동안 hiPSC를 배양합니다.
  2. hiPSC 콜로니의 직경이 약 1.5mm에 도달하면 37°C에서 최대 1시간 동안 배양하여 1mg/mL 콜라겐분해효소로 모든 콜로니를 다시 분리합니다.
    1. 6mL의 전뇌 배지 115 로 효소를 중지하고 광경 팁을 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 분리된 콜로니를 수집합니다.
    2. 집락이 정착되면 기존 배지를 제거하고 전뇌 배지 5 mL로 세척합니다.
    3. 마지막으로, 콜로니를 광폭 팁이 있는 웰당 3mL의 전뇌 배지 1이 들어 있는 초저 부착 6웰 플레이트로 옮기고 배아체(EB)를 형성하도록 합니다. 이 단계는 인간 피질 오가노이드 프로토콜의 0일을 나타냅니다. 여기서부터15에 게시된 프로토콜을 따르십시오.
  3. 7일째에 EB를 기저막 매트릭스에 삽입하고 "쿠키"당 약 20개의 EB를 넣고 전뇌 배지에서 1주일 동안 배양 2 15. 14일차에 매트릭스에서 오가노이드를 기계적으로 방출하고 120rpm의 오비탈 쉐이커에서 전뇌 배지 315 의 6-well ultra-low attachment plates에서 배양을 계속합니다.
  4. 35일째부터 1% v/v 기저막 매트릭스가 배지에 보충됩니다.
  5. 6주차에 오가노이드를 3% 저융점 아가로스에 삽입하고 비브라톰을 사용하여 오가노이드 전체에 산소와 영양분 공급을 지원하는 500μm 두께의 조각(그림 2A, B)으로 자릅니다. 필요한 경우 4주마다 오가노이드 슬라이싱을 반복합니다.
  6. 70일째부터 전뇌 배지의 오가노이드 배양 415.

7. 얇게 썬 인간적인 외피 organoids의 Electroporation

참고: 인간 피질 오가노이드는 뇌실과 같은 구조가 보이는 즉시 주입 및 전기천공할 수 있으며, 대략 2주부터입니다. 후기 단계 오가노이드(5주차 이상)의 경우, 전기천공법이 가장 효율적이며 오가노이드 26,55를 절단한 후 2일 후에 시술을 수행할 때 세포의 생존력이 가장 우수합니다. 절단 후에는 심실과 같은 구조를 쉽게 식별할 수 있어 주입 절차에 도움이 됩니다(그림 2C, D). 더욱이, 심실과 같은 구조는 절단 후 얼마 동안 부분적으로 열린 상태로 유지되어 과도한 주입 용액이 빠져나갈 수 있으며, 이는 심실을 둘러싸고 있는 접착 접합 벨트의 무결성을 보호합니다. 슬라이싱 일정은 실험 일정에 맞게 변경할 수 있습니다. 장기 배양을 위해 3-4주마다 슬라이스를 반복해야 합니다.

  1. 미세 모세관 풀러에서 주입을 위해 붕규산 유리 모세관을 P 500, 열 600, 당기기 30, 속도 40, 시간 1로 당깁니다. 고정을 위해 테이프를 사용하여 큰 페트리 접시에 모세혈관을 보관하십시오.
  2. 전기천공법 당일, 5.4단계에서 설명한 대로 CRISPRR/Cas9 RNP 복합체를 최종 농도 24μM RNP로 신선하게 준비합니다. 0.1 μg/μL pCAG-GFP 플라스미드(또는 다른 형광 리포터)의 동시 전기천공법은 전기천공된 세포의 식별을 지원합니다. 또한 최종 주입 혼합물에 물 중 0.1% Fast Green 용액을 첨가하여 혼합물의 성공적인 전달을 확인할 수 있습니다.
    참고: 관심 유전자와 gLACZ 대조군에 대해 별도의 혼합물을 만듭니다.
  3. Tyrode의 용액 (Tyrode의 소금 1 팩, NaHCO3 1g, 1M HEPES pH 7.25 13 mL in 1 L of dH2O)을 37 °C로 예열합니다. 나머지 Tyrode 용액은 4°C에서 몇 달 동안 보관하십시오.
  4. 심실과 같은 구조가 잘 발달된 hCO를 선택하고(그림 2E) 심실과 같은 구조를 보이지 않는 오가노이드는 폐기합니다(그림 2F). 최대 10개의 오가노이드를 Tyrode 용액이 들어 있는 6cm 페트리 접시에 옮기고 나머지 hCO는 인큐베이터에 보관합니다.
  5. 마이크로로더 피펫 팁을 사용하여 유리 마이크로모세관에 10μL의 주입 용액을 채우고 핀셋으로 얇은 끝을 집어 모세관을 엽니다. Tyrode의 용액에 주입 혼합물을 방출하여 모세관이 열려 있는지 확인합니다. 풋 스위치를 통해 제어된 게이팅으로 연속 설정에서 마이크로 인젝터로 주사를 수행합니다.
  6. 모세혈관을 심실과 같은 구조의 중심에 삽입하고(그림 2C) 풋 스위치를 눌러 혼합물 0.2-0.5 μL를 주입합니다.
    참고: hCO당 최대 5개의 심실을 주입할 수 있으며 복제당 총 7-8개의 hCO를 처리할 수 있습니다. 이상적으로는 hCO의 바깥쪽을 향하고 있는 심실이 일반적으로 가장 잘 발달되어 있기 때문에 표적화해야 합니다(그림 2G, H).
  7. 미세한 집게를 사용하여 오가노이드를 밀어 움직임을 제한합니다. 실제로 오가노이드를 잡지 마십시오(그림 2C).
  8. 주입 후 넓은 구멍의 피펫 팁을 사용하여 1-2개의 오가노이드를 Tyrode 용액이 포함된 전기천공실 안으로 전달합니다(그림 2C, D).
  9. 주입된 오가노이드를 전극 쪽으로 향하게 하여 오가노이드 외부를 향하는 심실 유사 영역의 정점 방사상 신경교세포가 표적이 되도록 합니다.
  10. 오가노이드의 주입된 면이 양극(양극; 그림 2D).
  11. electroporator 기계의 Pulse 버튼을 눌러 38초 간격으로 각각 50ms 동안 5V의 5개의 펄스로 전기천공합니다.
    참고: electroporation 설정은 사용 가능한 electroporator에 따라 달라질 수 있으며 최적화가 필요할 수 있습니다.
  12. 원하는 수의 오가노이드가 처리될 때까지 주입 및 전기천공법 단계를 반복합니다.
  13. 동일한 조건의 모든 샘플이 처리될 때까지 RT에서 배지에 전기천공된 오가노이드를 수집합니다. 총 30분 이상 인큐베이터 밖에 있지 않은지 확인하십시오.
  14. 그런 다음 전기천공된 hCO를 적절한 배양 배지에 되돌려 놓고 처음 24시간 동안 흔들지 않고 배양합니다.
    참고: 2-3일 후에 GFP 신호는 형광 입체경 아래에서 전기천공된 hCO에서 볼 수 있어야 합니다(그림 2H). electroporation 후에 분석의 시점은 대답될 생물학적인 질문에 따라서 선택되어야 합니다. 3-7일 후, GFP 양성 세포는 VZ, SVZ 및 CP15,60 전체에 위치합니다.

8. 전기천공된 인간 피질 오가노이드의 정착 그리고 cryosectioning

  1. 2mL 반응 튜브의 RT에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드(PFA)에 전기천공된 오가노이드를 고정합니다.
    주의: PFA는 독성이 있으며 발암성이 있습니다. 흄 후드 아래에서 PFA와 관련된 모든 단계를 수행합니다. 니트릴 장갑과 보안경의 사용을 강력히 권장합니다.
  2. PBS에서 5분 동안 한 번 세척하고 조직이 자당으로 완전히 포화될 때까지 4°C의 PBS에서 멸균 여과된 30% 자당에 보관하십시오.
  3. 동결 조직 표본을 위한 포매 배지에 고정 오가노이드를 삽입하고 드라이아이스 블록의 PBS에 15% 자당을 삽입합니다.
  4. 저온 유지 장치에서 20-30 μm 절편을 준비하고 접착 슬라이드26,64에 조직을 수집합니다.
    참고: 프로토콜은 고정된 오가노이드가 자당(4°C에서 몇 달 동안 안정)에 있거나 임베딩 배지에 내장되면 일시 중지할 수 있습니다(동결된 블록은 -20°C의 밀폐 백에 몇 달에서 몇 년 동안 보관할 수 있음).

9. 전기천공된 인간 피질 오가노이드의 면역조직화학적 분석

  1. 면역조직화학 분석26,64의 경우, 수조에서 70°C에서 1시간 동안 시트레이트 버퍼(10mM 시트르산나트륨, 0.05% 폴리소르베이트 20 in dH2O, pH 6.0)에서 항원 회수를 수행합니다.
  2. PBS에서 5분 동안 한 번 세탁한 다음 슬라이드를 짧게 말리고 왁스 펜으로 섹션을 동그라미로 그립니다.
  3. PBS(pH 7.4)에 0.1M 글리신을 사용하여 RT에서 30분 동안 담금질한 다음 PBS로 각각 5분 동안 두 번 세척합니다.
  4. 차단 완충액(PBS의 10% 말 혈청, 0.1% 옥톡시놀 9)으로 섹션을 덮고 RT에서 30분 동안 배양합니다.
  5. 차단 완충액에서 1차 항체를 준비하고 4°C에서 하룻밤 동안 절편에서 배양합니다.
  6. 다음날, PBS로 각각 5분씩 3회 세척하고, RT에서 1시간 동안 2차 항체와 DAPI를 차단 버퍼에 넣어 배양하고, PBS로 5분씩 다시 3회 세척합니다.
  7. 장착 매체에 슬라이드를 장착하고 형광 현미경에서 이미지를 촬영합니다(그림 3).
    참고: 네이티브 신호는 고정 후 소멸되는 경우가 많기 때문에 표적 세포를 식별하기 위해 주입 혼합물에 사용되는 형광단에 대한 항체를 포함하는 것이 좋습니다. 그림 3에 나타난 바와 같이 면역형광 염색에 사용되는 항체 및 염료는 표 1에 나열되어 있습니다.

10. 단백질 수준에서 CRISPR/Cas9 매개 knockout 검증

  1. 단백질 수준에서 knockout을 확인하려면 전기천공된 오가노이드의 표적 단백질에 대한 면역조직화학을 수행합니다(그림 3I).
  2. 형광 강도를 비교할 수 있도록 동일한 설정을 사용하여 gLACZ 대조군과 표적 오가노이드를 모두 이미지화합니다(그림 3I, J). 발달 중인 신피질의 다양한 세포 유형에 미치는 영향을 비교하기 위해 영역별 방식으로 이 작업을 수행합니다. ImageJ/Fiji(플러그인 셀 카운터)에서 셀을 계산하거나 StarDist 플러그인65를 사용하여 분할합니다.

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결과

CRISPR/Cas9 매개 유전자 절제는 gRNA의 설계를 필요로 합니다. 일반적으로 7-11 bp 간격으로 배치된 한 쌍의 gRNA를 가진 관심 유전자의 첫 번째 엑손 중 하나를 표적으로 하는 것이 효과적입니다(3 bp의 배수는 피함). 첫 번째 테스트로서, gRNA에 의한 템플릿 인식의 효율성은 PCR 템플릿 26,40,62를 사용하여 시험관 내에서 조사할 수 있습니다. 효율적인 표적화 및 Cas9 매개 절단은 템플릿 DNA의 감소와 아가로스 겔에서 절단된 DNA 산물의 출현에서 볼 수 있습니다(그림 1B). 추가적인 gRNA 검사는 피질 오가노이드 생성에 사용되는 iPSC 라인에서 수행될 수 있습니다. 이를 위해서는 iPSC의 핵 절제가...

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토론

인간의 대뇌 및 피질 오가노이드는 인간의 신피질 발달을 조사하는 핵심 모델이 되었습니다 7,16,17. 인간 질환 모델링을 위해 동인성 hiPSC 라인과 오가노이드는 황금 표준68이 되었습니다. 그러나 새로운 iPSC 계통을 생성하는 것은 시간과 비용이 많이 들기 때문에 유전자 기능 연구를 위한 피질 오가노이드 모델의 급성 조작이 널리 적용되었습니다.

대뇌 및 피질 오가노이드 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55...

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공개 사항

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

우리는 CRTD와 Dresden Concept 파트너의 탁월한 지원에 감사드리며, 특히 줄기세포 엔지니어링 시설의 K. Neumann과 그녀의 팀, 광학 현미경 시설의 H. Hartmann과 그녀의 팀, 유세포 분석 시설의 A. Gompf와 그녀의 팀, 전기천공실 건설을 위한 MPI-CBG 작업장의 Hartmut Wolf에게 감사드립니다. 원고에 대한 피드백을 주신 Joshua Schmidt에게 감사드립니다. MA는 TU 드레스덴 재생 치료 센터(Center for Regenerative Therapies), DFG(Emmy Noether, AL 2231/1-1) 및 슈람 재단(Schram Foundation)의 자금 지원을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15mL PP 원심분리기 튜브, 원뿔형Corning430791
4D-Nucleofector 코어 유닛Lonza
4D-Nucleofector X 유닛Lonza
5mL 폴리스티렌 라운드 바텀 튜브(셀 스트레이너 캡 포함CorningFalcon 352235
6웰 플레이트, nunclon 처리Thermo Fisher140675hiPSC용 배양
6웰 플레이트, 초저 부착Corning3471오가노이드 배양용
A83-01STEMCELL Technologies72022Forebrain medium 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Air 압축기Aerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-1552차 항체, RRID: AB_2340375; 희석 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-315722차 항체, RRID: AB_162543; 희석 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmol통합 DNA 기술맞춤형 설계(2 nmol로 주문)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA통합 DNA 기술10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3통합 DNA 기술1081060100 µ g, Streptococcus pyogenes
Amphotericin B (Fungizone)Gibco15290018Forebrain 배지 2, 3 및 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anti-GFP 1차 항체 (닭, 다클론성)Abcamab13970RRID: AB_300798; 희석 1:2000
Anti-PCGF4 1차 항체 (마우스, 단클론)Millipore05-637 RRID: AB_309865; 희석 1:300
ApoTome 형광 현미경Zeiss
Ascorbic AcidSigma Aldrich1043003Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-보충제 (+ 비타민 A)Gibco17504044Forebrain medium 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Banana to Micrograbber Cable KitHarvard Apparatus BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (PCR machine)AnalytikJena 846-2-070-723
Capillaries, filament with borosilicate glass, OD 1.2 mm; ID 0.69 mm; 10cm 길이Science ProductsBF120-69-10특정 두께로 당겨야 함
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Forebrain 매체 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Collagenase Type IVGibco17104019
CRTDi004-AStem Cell Engineering Facility at CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A의 단일 세포 적응 hiPSC 라인
에 1:1000 희석 사용
STEMCELL Technologies73884포브레인 매체 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Forebrain medium 1, 2, and 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102포브레인 매체 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 집게, 해협, 11cm정밀 과학 도구11295-51
ECM 830 구형파 전기천공법 시스템Harvard Apparatus BTX45-2052
에탄올Sigma Aldrich32205-1L-M
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마 AldrichEDS-500G
패스트 그린 FCF시그마 알드리치F7252
태아 소 세럼 (FBS)GE 헬스케어 SH30070.03 
화염/갈색 마이크로피펫 풀러Sutter Instrument Co.P-97미세모세관 당기기용
Geneious PrimeGraphPad Software LLC dba GeneiousSoftware 버전 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; 밑줄이 그어진 뉴클레오티드 = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Forebrain medium 1, 2, 3, and 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1이 논문5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (그림 3I+J의 KO 이미지에 해당)
gPCGF4 KO2이 논문5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (KO에 해당) 그림 3I+J)
HEPESmade in house1 M stock
Horse Serum, heat-inactivatedGibco26050088
Human GDNF RecombinantProtein Thermo Fisher450-10Forebrain medium 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Human/Mouse/Rat BDNF 재조합 단백질Thermo Fisher450-02Forebrain 매체 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
염산(HCl)Sigma Aldrich258148TrisHCl
ImmEdge(왁스) PenVector LaboraoriesH-4000
인슐린 용액 인간Sigma Aldrich  I9278포브레인 미디엄 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Knockout Serum ReplacementGibco 10828-010전뇌 매체 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Laser 스캐닝 컨포칼 980 현미경Zeiss
Low Melting Point Agarose, 초순수Thermo Fisher16520100진동 절편 중 hCO 포매ing용
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) 기저 멤브레인 매트릭스, LDEV-freeCorning354230오가노이드 배양용
Matrigel hESC 인증 매트릭스, LDEV-free코닝354277HiPSC 배양
MgCl2, 1 MThermo FisherAM9530G
Microinjector PicoPump + Foot SwitchWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader 피펫 팁 0.5 to 20 µ LEppendorf5242956003유리 모세관 로딩용
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850줄기세포 매체
N-2 보충제Gibco17502048Forebrain 매체 2, 그리고 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaCl시그마 AldrichS5886
NaHCO3시그마 AldrichS5761
NEB 다음 고화질 2x PCR 마스터믹스 New England BiolabsM0541S
Neubauer 계수실브랜드718605
Neurobasal 매체Gibco21103049Forebrain 매체 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
비필수 아미노산Gibco 11140050Forebrain medium 1, 2, 3 및 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Nuclease-Free Duplex Buffer통합 DNA 기술1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583동결 조직 표본
P3 기본 세포 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
파라포름알데히드피셔 케미컬P/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
필-어-웨이 임베딩 몰드 TruncatedT12Polysciences Inc.18986-1진동 및 동결 절편을 위한 hCO 임베딩용
페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL) Gibco15140122Forebrain 매체 1, 2, 3, 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 및 핵 제거 후 줄기 세포 배지용
페트리 접시 60mm x 15mm, 통풍구 없음, 멸균CorningBP50-02
페트리 접시 백금 전극 챔버, 5mm 간격Harvard Apparatus BTX45-0504
인산염 완충 식염수(PBS)사내
단백질 분해 효소 KSigma AldrichP2308Titrachium 앨범에서; 10 mg/mL 주식
QIAquick 젤 추출 키트Qiagen28706
RHO/ROCK 경로 억제제 (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Forebrain 매체 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
>Sodium Citrate DihydrateSigma AldrichW302600-1KG-K
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)Sigma AldrichL3771
Sucrose Sigma AldrichS7903
SuperFrost Plus 접착 슬라이드KL
SZX10림푸스SZX10또는 대체 스테레오스코프
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284일명 Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503TrisHCl
Trypan Blue Solution을 만들기 위해 0.4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021Dissociation enzmye 단일 세포 현탁액
Tween 20Sigma AldrichP1379일명 폴리소르베이트 20
Tyrode's saltSigma AldrichT2145-10x1l
진동 마이크로톰(비브라톰)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 µ L 유니버설 핏 필터 팁CorningTF-1005-WB-R-S
β-MercaptoethanolGibco 21985-023전뇌 매체 1, 3 및 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
) 건강한 기증자 DAPI Roche 10236276001 1 mg/mL stock, IF Dibutyryl-cAMP를 만들기 위해, 300 LED가 있는 Fisher Scientific 10149870 올

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