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방법 논문

마우스 망막의 동결 절편 및 면역 염색

3K 조회수

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DOI:

10.3791/67622

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2025년 2월 28일

 ,  ,  ,  , 
1The Key Laboratory for Human Disease Gene Study of Sichuan Province and Department of Laboratory Medicine, Sichuan Provincial People's Hospital, School of Medicine, University of Electronic Science and Technology of China, 2Research Unit for Blindness Prevention of Chinese Academy of Medical Sciences (2019RU026), Sichuan Academy of Medical Sciences & Sichuan Provincial People's Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

마우스 망막 동결절편을 준비하고 광수용체에서 면역염색을 수행하기 위한 프로토콜이 설명됩니다. 이 논문을 통해 연구자들은 잘 보존된 형태와 고품질 면역염색 결과를 가진 마우스 망막 동결 절편을 일관되게 생성할 수 있습니다.

초록

조직 절편 및 면역조직화학은 동물 모델을 사용하여 망막 질환의 조직학 및 병리학적 연구에 필수적인 기술입니다. 이러한 방법을 통해 조직 형태와 조직 내 특정 단백질의 국소화에 대한 자세한 검사를 수행할 수 있으며, 이를 통해 질병 진행 및 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 마우스는 이러한 목적으로 가장 널리 사용되는 모델입니다. 그러나 쥐의 안구는 작고 쥐의 망막은 매우 섬세한 조직이기 때문에 쥐의 안구에서 고품질 망막 절편과 면역 염색 이미지를 얻는 것은 일반적으로 어렵습니다. 이 연구는 마우스 망막의 동결 절제 및 면역조직화학을 수행하기 위한 개선된 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜의 핵심은 각막 제거, 수정체 추출 및 삽입 과정에서 안구의 변형을 방지하는 슈퍼 접착제 층으로 안구를 코팅하는 것입니다. 이 단계는 망막 형태학의 무결성이 잘 보존되도록 합니다. 이 프로토콜은 고품질 망막 절편을 일관되게 생산하고 우수한 면역염색 결과를 달성하기 위한 중요한 기술적 고려 사항과 최적화 전략을 강조합니다.

서론

냉동 절제 및 면역조직화학(IHC)은 생물의학 연구, 특히 망막1과 같은 복잡한 생물학적 구조를 연구하는 데 없어서는 안 될 기술입니다. 이러한 고급 방법론은 망막의 복잡한 세포 구성과 분자 조직을 이해하는 데 필수적입니다. 이를 통해 연구자들은 망막 기능과 병리학을 세부적으로 조사할 수 있는 능력을 갖추게 되며, 이 분야의 지식을 발전시키는 데 중요한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

냉동 절제술은 망막 조직의 형태학적 무결성을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 이를 통해 망막의 섬세한 구조가 그대로 유지되도록 하여 높은 정확도와 신뢰성으로 후속 면역형광 연구에서 절편을 사용할 수 있습니다. 파라핀 임베딩과 같은 다른 방법과 비교했을 때, 동결절편은 조직 형태와 항원성을 모두 더 잘 보존하기 때문에 상당한 장점이 있어 면역조직화학적 염색에 특히 적합합니다2. 동결 절편 기법은 다양한 복잡한 조직과 미세한 세포 구조3를 연구하는 데 널리 채택되어 구조를 정확하게 분석할 수 있습니다.

IHC는 조직 내 특정 단백질의 국소화를 시각화할 수 있는 강력하고 다재다능한 실험실 기술입니다. 이 기술은 임상 및 연구 환경 모두에서 초석이 되었으며 진단, 질병 모니터링 및 생물학적 조사에 광범위하게 활용됩니다. IHC 실험의 성공 여부는 세심한 검체 준비, 조직의 신중한 취급 및 면역염색 조건의 정밀한 제어에 크게 좌우됩니다. 프로토콜의 작은 변화는 결과의 품질에 큰 영향을 미칠 수 있으며, 이는 표준화 및 최적화의 중요성을 강조합니다1.

동결절편과 IHC를 결합하면 망막 내 다양한 단백질의 공간 분포, 발현 수준 및 세포 상호 작용을 탐구하려는 연구자에게 비교할 수 없는 이점을 제공합니다. 이러한 방법론을 통해 망막 발달, 기능 및 질병의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 자세한 조사를 수행할 수 있습니다. 이러한 통찰력은 노화 관련 황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 색소성 망막염을 포함한 망막 질환을 연구하는 데 특히 유용합니다. 이러한 상태의 병태생리학을 규명함으로써 냉동 절편 및 IHC는 잠재적인 바이오마커를 식별하고 새로운 치료 전략을 개발하는 데 기여합니다.

유용성에도 불구하고 마우스 망막으로 작업하는 데는 고유한 문제가 있습니다. 생쥐는 인간과의 유전적 유사성과 잘 특성화된 망막 구조로 인해 안과 연구에서 동물 모델로 널리 사용됩니다. 그러나 고품질 냉동 절편을 얻는 것은 마우스 망막 조직의 작은 크기와 섬세한 특성 때문에 본질적으로 어렵습니다. 이 연구는 마우스 망막에서 IHC를 동결 절제 및 수행하기 위한 자세한 방법론을 제공하고, 중요한 기술적 고려 사항을 강조하고, 이러한 문제를 해결하기 위한 최적화 전략을 제공합니다. 이러한 기술을 개선함으로써 연구자들은 일관되고 고품질의 결과를 얻을 수 있으며 망막 생물학 및 병리학 연구를 발전시킬 수 있습니다.

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프로토콜

이 절차는 시력 및 안과 연구 협회(Association for Research in Vision and Ophthalmology)에서 제정한 가이드라인을 준수하여 연구에 동물을 사용하는 방법에 따라 진행되었습니다. 쓰촨성 인민병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 생후 2-3개월, 체중 25-30g의 수컷 C57Bl/6J 마우스를 이 프로토콜에 사용했습니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 포괄적인 목록은 Table of Materials에 나와 있습니다.

1. 시약 준비

  1. PBS 버퍼 1개
    1. 저울을 사용하여 NaCl 8g, Na2HPO4 1.42g, KH2PO4 0.42g 및 KCl 0.2g의 무게를 잰다. 이것을 비이커에 옮기고 적당량의 이중 증류수(ddH2O)를 첨가하여 구성 요소를 용해합니다. 용액을 1L 부피 플라스크에 붓고 ddH2O를 사용하여 부피를 1L로 조정합니다.
  2. 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액
    1. 8mL의 1x PBS 완충액이 들어 있는 15mL 코니컬 튜브에 PFA 분말 0.4g과 1M NaOH 15μL를 추가합니다. 튜브를 60°C로 설정된 수조에 넣어 PFA 분말을 완전히 녹입니다. 1x PBS를 사용하여 최종 부피를 10mL로 조정합니다.
  3. IHC 차단 솔루션
    1. 일반 당나귀 혈청 1mL, 20% NaN3 20μL, 20% Triton X-100 200μL, 1x PBS 완충액 18.78mL를 결합합니다. 철저히 섞는다.
  4. 30% 자당 용액
    1. 1x PBS 완충액 40mL에 자당 15g을 용해시킵니다. 1x PBS 완충액을 사용하여 부피를 50mL로 조정하고 완전히 용해될 때까지 혼합합니다.
  5. IHC 2차 항체 솔루션
    1. 준비된 차단 버퍼를 사용하여 Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit 항체를 1:300 비율로, DAPI를 1:2,000 비율로 희석합니다.

2. 마우스 안구 동결 절제

  1. 안구 해부
    1. 생후 3개월 된 C57Bl/6 마우스(약 25g)를 체중 15μL/g의 용량으로 2% 트리브로모에탄올을 복강내 주사 하여 마취합니다. 경추 탈구를 사용하여 마우스를 희생합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름).
    2. 공막에 파란색 마커로 안구의 위쪽을 표시합니다(그림 1A). 가위를 사용하여 안구를 제거합니다.
    3. 안구 표면에 피가 묻어 있으면 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 부드럽게 닦아내십시오. 해부 현미경으로 안구에 부착된 안구 외 근육을 조심스럽게 제거합니다.
  2. 고정
    1. 절개된 안구를 1mL의 4% PFA가 함유된 2mL 둥근 바닥 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 10분 동안 안구를 고정합니다. 그런 다음 안구를 거꾸로 된 3cm 또는 6cm 페트리 접시로 옮깁니다.
    2. 해부 현미경으로 가는 집게와 안과 가위를 사용하여 각막을 작게 절개합니다(약 1-2mm). 안구를 4% PFA 용액에 다시 넣어 얼음에 2시간 더 고정합니다(그림 1B).
  3. 크라이오 프로텍션
    1. 고정제를 제거하고 1x PBS 완충 용액으로 안구를 3회 세척합니다. 4°C에서 동결 보호를 위해 1mL의 30% 자당 용액이 들어 있는 2mL 둥근 바닥 미세 원심분리 튜브로 안구를 옮깁니다. 안구가 튜브 바닥에 가라앉도록 하거나 밤새 그대로 두십시오.
  4. 안구 코팅
    1. 각막 쪽이 위를 향하도록 하여 거꾸로 된 페트리 접시에 안구를 옮깁니다. 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 각막에서 여분의 용액을 닦아냅니다. 0.2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 들어 있는 접착제(시아노아크릴레이트로 구성)에 2-3cm 길이의 테니스 스트링 조각을 담근 다음 빠르게 제거합니다.
    2. 해부 현미경으로 잔여 슈퍼 접착제가 있는 테니스 줄의 한쪽 끝을 축축한 각막 중앙에 부착합니다. 접착제가 10-20초 동안 굳어지도록 합니다. 테니스 줄의 다른 쪽 끝을 잡고 초강력 접착제로 채워진 200μL 미세 원심분리기 튜브에 안구를 담그고 공막이 약 1초 동안 완전히 잠기도록 합니다.
    3. 안구를 빠르게 제거하고 PBS에 담그십시오(그림 1C). 공막 표면의 접착제는 즉시 응고됩니다.
  5. 각막 제거
    1. 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 응고된 접착제 표면의 여분의 PBS를 닦아냅니다. 해부 현미경으로 부속된 테니스 끈을 잡고 안과 가위로 각막을 제거합니다.
  6. 포함
    1. 집게를 사용하여 아이컵에서 렌즈를 조심스럽게 빼냅니다. 보푸라기가 없는 물티슈 스트립으로 아이컵 안에 갇힌 과도한 자당 용액을 흡수합니다. 최적 절단 온도(OCT) 화합물로 채워진 임베딩 몰드로 아이컵을 옮깁니다.
    2. 아이컵에 OCT를 완전히 채웁니다. 아이컵이 임베딩 몰드의 측벽을 향하도록 배치하여 시상면이 몰드 바닥과 평행이 되도록 합니다. 공막의 파란색 표시를 참조로 사용하십시오. 아이컵이 들어 있는 임베딩 몰드를 -80°C 냉동고로 옮깁니다(그림 1D). 아이컵은 5분 이내에 얼어붙습니다.
  7. 냉동 절편
    1. 얼어붙은 아이컵을 -20°C로 설정된 저온 유지 장치로 옮기고 30분 동안 챔버 내에서 평형을 이룰 수 있도록 합니다. 아이컵을 12μm 두께로 절단합니다. 나중에 사용할 수 있도록 양전하를 띤 유리 슬라이드에 섹션을 장착합니다.

3. 면역조직화학 염색

  1. 베이킹
    1. 얼어붙은 부분을 슬라이드에 놓고 37°C 오븐에서 30-60분 동안 굽어 조직이 슬라이드에 적절하게 접착되도록 합니다.
  2. 세탁
    1. PAP 펜을 사용하여 슬라이드의 섹션 주위에 원을 그립니다. 1x PBS 버퍼가 들어 있는 Coplin 용기에 슬라이드를 담그십시오. Coplin 용기를 슬로우 셰이커에 놓고 2× 10분 동안 섹션을 세척하여 OCT 화합물을 제거합니다.
  3. 차단 및 투과화
    1. 슬라이드를 수분 챔버에 수평으로 놓습니다. 동그란 부분에 차단 용액을 추가하고 실온에서 30분 동안 차단 및 투과화를 허용합니다.
  4. 1차 항체 배양
    1. 슬라이드에서 차단 용액을 조심스럽게 흡입합니다. 차단 용액에 희석된 1차 항체를 절편에 추가합니다. 수분 챔버의 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 배양하여 표적 항원에 대한 항체의 최적 결합을 보장합니다.
  5. 2차 항체 배양
    1. 기본 항체 용액을 흡인하고 1x PBS로 2× 10분 동안 슬라이드를 두 번 세척합니다. 적절한 2차 항체를 추가하고 DAPI와 혼합하여 차단 용액에 희석합니다.
    2. 실온의 어두운 수분 챔버에서 1시간 동안 절편을 배양하여 2차 항체 결합 및 DAPI로 counterstaining을 허용합니다.
  6. 장착
    1. 2차 항체 용액을 흡인하고 1x PBS로 슬라이드를 2× 10분 동안 헹굽니다. Kimwipe를 사용하여 슬라이드에 남아 있는 PBS를 닦아냅니다.
    2. 섹션에 적절한 양의 퇴색 방지 장착 매체를 바르고 커버슬립으로 덮습니다. 장착된 시료를 4°C의 어두운 곳에 보관하여 형광을 보존하고 광표백을 방지합니다.

4. 이미징

  1. 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 면역 염색된 망막 절편에서 형광 신호를 획득합니다. 최적의 해상도와 감도에 대한 설정을 조정하여 선명하고 뚜렷한 형광 신호를 캡처할 수 있습니다.
  2. 실험에 사용된 형광단의 특정 파장을 검출하기 위해 적절한 필터를 사용했는지 확인합니다.

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결과

위에서 설명한 프로토콜에 따라, 생후 1개월 된 야생형 C57Bl/6J 마우스의 눈을 4% PFA로 고정했습니다. 그런 다음 고정된 샘플을 OCT에 삽입하고 동결 절편했습니다. 절편을 항-PDE6B 항체로 면역염색하고 DAPI로 대조염색하여 핵을 라벨링했습니다. PDE6B는 간상 광수용체 세포(rod photoreceptor cells)에서 특이적으로 발현되는 광변환 단백질(phototransduction protein)이다4. 기존 프로토콜과 비교했을 때, 이 프로토콜은 마우스 망막의 형태와 면역형광 이미지의 품질을 모두 크게 개선하여 뛰어난 일관성을 제공합니다. 대표적인 결과는 anti-PDE6B를 사용한 망막 동결절편의 성공적인 면역 염색을 보여줍니다(그림 2). 광수용체 외부 세그먼트는 anti-PDE6B로 명확하게 라벨링되었습니다. 모든 광수용체 바깥쪽 분절은 형태학적으로 온전한 것처럼 보였고, 개별 분절은 식별할 수 있었다...

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토론

조직 절편의 질에 영향을 미치는 요인은 여러 가지가 있는데, 여기에는 고정 용액의 구성, 고정 및 동결 보호 시간, 포매 방법5. 마우스에서 안구를 적출할 때 안구에 부착된 안구 외 근육 및 기타 결합 조직을 제거하는 것이 필수적입니다. 제대로 제거하지 않으면 이러한 조직이 안와에서 추출하는 동안 안구의 변형을 일으켜 잠재적으로 망막 박리를 유발할 수 있습니다. 고정 과정에서 안압(IOP)을 해제하기 위해 각막을 절개해야 합니다. 이러한 절개가 없으면 안구가 줄어들어 변형과 망막 박리가 발생할 수 있습니다. 고정 중 안구의 투과성이 증가하면 안구는 안구내 공간에서 수액의 유출을 강제할 수 있습니다. 각막을 절개하면 안구의 내부 압력이 완화되어 수축을 방지하고 고정제가 안구 내 공간을 보다 효과적으로 침투하여 최적의 고정을 할 수 있습니다.

망막은 구조적으로 뚜렷하고 섬세한 조직...

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공개 사항

저자는 공개할 충돌이 없습니다.

감사의 글

이 연구 프로젝트는 중국 국립 자연 과학 재단(82371059(H.Z.), 82102470(JW)), 쓰촨 과학 기술 프로그램(2023JDZH0002(H.Z.))의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
-80 > C freezerHaierDW-86L626
접착 현미경 슬라이드CITOTEST80312-3161
Alexa488-Goat anti-RabbitProteintechSA00006-2
C57BL/6J 마우스The Jackson Laboratory664
cryyosection microtomeLeicaN/A
CryostatLEICAN/A
DAPI세포 신호 전달 기술4083S
해부 현미경ZEISS3943030830
당나귀 혈청SolarbioS9100
임베딩 몰드Thermo Fisher Scientific1841
미세 해부 가위RWDS13001-10
미세 집게RWDF11020-11
플루오로마운트 수성 장착 매체Sigma-AldrichF4680
인큐베이터Shanghai YuejinN/A
KClSigma-Aldrich1049330500
KH2PO4Sigma-Aldrich1048771000
KimwipesThermo Fisher ScientificFIS-06666
레이저 컨포칼 현미경ZEISSN/A
현미경 커버 유리CITOTEST80340-3610
Na2HPO4Sigma-Aldrich1065860500
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHSigma-Aldrich1091371003
O.C.T 화합물사쿠라4583
아빠 펜시그마 - 알드리치Z672548
PFA시그마 - 알드리치441244
토끼 안티 PDE6BProteintech22063-1-AP
셰이커SCILOGEX8042210200
스프링 가위RWDS11036-08
설탕BioFroxx1245GR500
슈퍼 글루델리7147S
테니스 스트링 (1.24mm)GosenTS761
트리브로모에탄올맥클린T831042
트리톤 X-100SolarbioIT9100

참고문헌

  1. Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
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  3. Usukura, E., et al. A cryosectioning technique for the observation of intracellular structures and immunocytochemistry of tissues in atomic force microscopy (AFM). Sci Rep. 7 (1), 6462(2017).
  4. Park, P. S. Supramolecular organization of rhodopsin in rod photoreceptor cell membranes. Pflugers Arch. 473 (9), 1361-1376 (2021).
  5. Boonstra, H., Oosterhuis, J. W., Oosterhuis, A. M., Fleuren, G. J. Cervical tissue shrinkage by formaldehyde fixation, paraffin wax embedding, section cutting and mounting. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 402 (2), 195-201 (1983).
  6. Stradleigh, T. W., Ishida, A. T. Fixation strategies for retinal immunohistochemistry. Prog Retin Eye Res. 48, 181-202 (2015).
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  8. Li, L., et al. An improved method for preparation of mouse retinal cryosections. Eur J Histochem. 64 (3), 3154(2020).
  9. Yang, J., et al. A quick protocol for the preparation of mouse retinal cryosections for immunohistochemistry. Open Biol. 11 (7), 210076(2021).
  10. Szel, A., et al. Unique topographic separation of two spectral classes of cones in the mouse retina. J Comp Neurol. 325 (3), 327-342 (1992).

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