방법 논문

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

DOI:

10.3791/67651

⸱

2025년 4월 18일

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

초록

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단핵구-대식세포 계통의 세포는 다기능적이며 거의 모든 신체 조직에서 발견됩니다. 이들은 선천면역과 적응면역의 시작 단계와 해결 단계를 조율하여 보호 면역과 면역 매개 병리학적 손상에 큰 영향을 미칩니다. 조직에 상주하는 대식세포는 안정된 상태에서 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 하지만, 손상이나 염증성 모욕 후 말초 혈액에서 조직으로 많은 양의 단핵구가 동원됩니다. 단핵구 유래 대식세포(M-DM)는 많은 동적 아형으로 분화할 수 있으며, 그 표현형과 기능은 국소 조직 환경에 따라 다릅니다.

M-DM 분화 및 분광 중 다양한 자극 또는 환경 조건을 비교하기 위해 인간 비분극 M-DM M0 및 일부 기본 사이토카인 편광 대식세포, IFNγ/LPS 유래 M1, IL-4 유래 M2a 및 IL-10 또는 덱사메타손 유래 M2c의 체외 모델을 표준화하여 유세포 분석 및 실시간 PCR에 의한 M-DM의 편향 재프로그래밍을 분석했습니다. CD64, CD206, CD163, CD14 및 MERTK는 유세포 분석을 통해 비편광 M0와 편광 M1, M2a 및 M2c를 명확하게 구별할 수 있음을 발견했습니다. 또한, IRF1 및 CXCL10을 IL-4 유래 M2a에 대한 고전적 IFNγ/LPS 유래 M1-, IRF4-, CCL22 및 TGM2 특이적 전사체에 대한 특이적 유전자로, 그리고 덱사메타손 유래 M2c에 대한 MERTK 유전자로 정의했습니다. 요약하자면, 우리의 표준화된 M-DM 프로토콜은 다양한 자극 하에서 인간 M-DM의 분화 및 편광을 분석하기 위한 기본 체외 맵을 제공할 수 있습니다.

서론

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대식세포는 메치니코프(Metchnikoff)가 식세포 능력으로 처음 확인한 것으로, 후생동물(Metazoan) 생명체의 근간이 되는 고대 세포입니다. 성인 포유류에서 흔히 발견되는 이 식물은 놀라운 해부학적, 기능적 다양성을 보여줍니다. 단핵 식세포 시스템의 일부로서 수지상 세포 및 단핵구와 함께 대식세포는 발달 및 항상성에서 병원체에 대한 면역 반응에 이르기까지 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 합니다1,2. 조직 미세환경에 특화된 상주 대식세포는 조직 건강을 모니터링하고 생리적 변화와 외부 위협에 대응하는 파수꾼 역할을 합니다. 그들의 제한된 가소성은 조직 항상성을 유지하기 위한 진화적 적응으로 생각됩니다. 대조적으로, 모집된 단핵구는 더 유연하며 염증 중에 다양한 대식세포 표현형으로 분화할 수 있습니다. 염증과 조직 틈새의 이러한 이중 영향은 대식세포의 기능적 다양성을 형성합니다3. 따라서 국소 조직 환경에 따라 단핵구 유래 대식세포(M-DM)는 많은 아형으로 분화될 수 있습니다. 국소 대사 산물, 성장 인자, 사이토카인 및 세포-세포 상호 작용4,5,6은 표현형과 기능을 간략하게 설명합니다. 또한 대식세포는 염증을 완화하고 재혈관화 및 조직 복구를 촉진하는 요인의 주요 생산자입니다7,8.

적어도 3개의 주요 팔이 분극(외인성, 내적 및 조직 환경 조건)을 제어한다는 점을 감안할 때 대식세포 분극은 다차원으로 보아야 합니다2. 대식세포 분화 및 분극을 설명하는 데 있어 주요 장애물과 함정은 문헌 전반에 걸쳐 이질적인 실험 조건과 시험관 내 및 생체 내 실험에서 대식세포 용어를 정의하는 것에 대한 합의가 부족하다는 것입니다9. 그럼에도 불구하고 다양한 실험 시나리오에 대해 실험 표준의 일부 통일이 시작되었습니다.

인간 대식세포 분야를 더 잘 이해하려면 특정 기능뿐만 아니라 연결, 분화, 편광, 표현형 및 재프로그래밍을 위한 표준화되고 잘 정의된 M-DM의 체외 모델이 필요합니다. 우리의 목표는 유세포 분석 및 Real-Time PCR에 의한 M-DM의 왜곡 재프로그래밍을 연구하기 위해 인간 비편광 M-DM M0 및 사이토카인 편광 대식세포의 표준화된 체외 모델을 설정하는 것이었습니다. 대식세포 분극은 높은 가소성과 환경의 여러 신호를 통합하는 능력으로 인해 역동적인 과정이지만, 여기서는 비편광 M-DM(M0) 및 일부 체외 편광 상태를 IFNγ 및 LPS로 유도된 M1으로도 일반적으로 인식되는 고전적인 전염증성으로 특성화했습니다. 마찬가지로, 조직 복구 및 조절 M2 대식세포는 IL-4로 유도될 때 M2a로, 덱사메타손 또는 IL-10으로 자극될 때 M2c로 정의될 수 있습니다. 이러한 편광 상태는 시간과 공간에서 넓은 M-DM 환경 스펙트럼의 스냅샷을 캡처하지만 테스트 조건의 위치를 분석할 맵을 설정하기 위한 몇 가지 기본 지점을 제공합니다.

표면 마커와 전사 프로그램의 복잡하고 역동적인 조합에도 불구하고, in vitro M-DM을 분석할 때 CD64, CD206, CD163, CD14 및 MERTK가 IFNγ/LPS 유도 M1, IL-4 유도 M2a 및 IL-10 또는 유세포 분석에 의한 덱사메타손 유도에서 비분극 M0 상태를 분리할 수 있도록 설정했습니다. 또한, IRF1 및 CXCL10 유전자 발현은 IFNγ/LPS 유도 M1에 특이적인 것으로 정의되었습니다. IL-4 유래 M2a에 대한 IRF4, CCL22 및 TGM2 특이적 전사체; 덱사메타손 유래 M2c에 대한 MERTK 유전자, 다른 자극으로 도전하거나 다른 세포 유형과 공동 배양된 M-DM의 편향 재프로그래밍을 비교하기 위해 추가 기본 포인트를 설정합니다.

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프로토콜

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모든 건강한 자발적 헌혈자는 서면 동의서를 제출했으며, 이 연구는 아르헨티나 국립의학원(IMEX-CONICET-ANM) 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료 및 시약에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 말초혈액 단핵세포(PBMC) 분리

참고: PBMC는 40mL의 항응고된 말초 혈액에서 3.8%의 구연산나트륨과 Ficoll-Hypaque 밀도 구배(1077) 원심분리를 사용하여 분리됩니다. 이 프로토콜은 BSL2 Biosafety 캐비닛의 멸균 조건에서 수행됩니다.

  1. 투여된 항응고된 말초 혈액 샘플을 원심분리를 위해 적절한 15mL 또는 50mL 튜브로 옮깁니다.
  2. 실온에서 200 ×g의 혈액 샘플을 15분(가속: 4, 감속: 2, 최대 5일 때) 원심분리기 샘플로 상부에는 혈소판이 풍부하고 아래에는 적혈구와 백혈구를 포함한 세포 분획이 있습니다. 그림 1.
  3. 상부 분획(PRP)을 15mL 튜브(혈장이 저장되는 경우)로 옮기고 600 × g에서 10분(최대 가속 및 감속) 동안 원심분리하여 혈소판이 없는 최종 혈장 분획을 얻습니다. 플라즈마는 -20°C에서 보관하십시오.
  4. 실온에서 예열된 멸균 1x 인산염 완충 식염수(1x PBS)를 사용하여 첫 번째 원심분리에서 얻은 세포 분획을 2x(최소)에서 3x(최대)로 희석합니다. 이를 부드럽게 균질화하고 이 희석된 분획을 Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리에 사용합니다.
  5. 15mL의 Ficoll-Hypaque를 멸균 50mL 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 상이 혼합되지 않도록 Ficoll 위에 희석된 혈액 30mL를 조심스럽게 천천히 첨가합니다. 10mL 이하의 희석된 혈액으로 작업하는 경우 4mL의 Ficoll-Hypaque를 15mL 튜브에 옮긴 다음 10mL의 희석된 혈액 샘플을 추가합니다.
    참고: 이 단계는 단핵 분획을 얻는 데 중요합니다.
  6. Ficoll plus 희석된 혈액이 들어 있는 튜브를 600 ×g에서 25분 동안 원 심분리(가속: 1; 감속: 0) 실온에서.
  7. 멸균 3mL 파스퇴르 피펫으로 노란색 상층의 일부를 제거합니다. 그런 다음 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 노란색 최상층과 Ficoll 층 사이에 형성된 계면(단핵 "고리" 분획)을 조심스럽게 수집합니다. 이 "고리"에는 관심 있는 단핵 세포(PBMC)가 포함되어 있습니다.
    참고: 나머지 플라즈마 상 중 일부는 수집할 수 있지만 Ficoll 상은 PBMC에 독성이 있을 수 있으므로 피해야 합니다.
  8. 수집된 PBMC를 최소 3mL의 멸균 1x PBS가 들어 있는 새 15mL 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 해당 용량의 멸균 1x PBS를 12-15mL로 보충합니다. PBMC를 600 × g(최대 가속 및 감속)에서 10분 동안 원심분리합니다.
  9. 상등액을 버리고 PBMC를 다시 세척합니다. 1mL의 멸균 1x PBS를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시킨 다음 추가 멸균 1x PBS를 12-14mL까지 채웁니다. 튜브를 600 × g(최대 가속 및 감속)에서 10분 동안 원심분리합니다.
  10. 상층액을 버리고 PBMC 펠릿을 불활성화태아 소 혈청 2%(1x PBS-2% FBS)를 함유한 멸균 1x PBS에 재현탁하고 부피를 최대 10mL까지 가져옵니다. 자동 세포 계수기를 사용하거나 세포 계수를 수행하여 멸균 저온 1x PBS로 희석한 다음 Trypan Blue에서 (1:2) 1:5 세포 현탁액을 준비하여 1:10의 최종 희석을 얻습니다. 계수를 위해 광학 현미경을 사용하십시오.
  11. PBMC 현탁액을 300 × g에서 8-10 °C에서 5분 동안 스핀다운합니다. 원하는 부피의 멸균된 차가운 1x PBS-2% FBS에 세포를 재현탁하여 108 cells/mL의 최종 농도를 얻습니다. 다음 단계까지 이 셀을 4°C로 둡니다.
    참고: 수집된 PBMC를 당일에 사용하지 않을 경우 적절한 동결 매체(10%의 디메틸설폭사이드, DMSO를 포함하는 FBS의 90%)에서 108 cells/mL의 극저온 바이알에서 동결하는 것이 좋습니다. 폴리에틸렌 글리콜 용기에 -80°C에서 하룻밤 동안 보관하여 세포가 천천히 얼도록 하여 세포 손상을 최소화합니다. 다음날 세포를 보관 상자로 옮기고 며칠 동안 -80 °C로 두거나 액체 질소 탱크로 옮겨 장기간 보관하십시오.

2. 마그네틱 비드를 사용한 CD14+ 단핵구 분류

참고: 건강한 기증자의 PBMC에서 발견되는 CD14 단핵구의 양은 연령과 성별에 따라 다릅니다. 사용 가능한 경우 세포 계수기를 사용하여 각 샘플에서 단핵구의 %를 얻은 다음 필요한 CD14 단핵구를 분류하는 데 필요한 PBMC의 수를 계산합니다. 세포 계수기를 사용할 수 없는 경우 PBMC 샘플당 단핵구의 10%는 광범위한 접근 방식으로 간주될 수 있습니다4,6,7,10,11,12,13.

CD14+ 단핵구는 human CD14 positive selection kit를 사용하여 분리5. 당사는 100 μL의 반응에서 1-2 × 107 PBMC를 사용하여 분리 프로토콜을 표준화했습니다. 더 높은 숫자에 이 비율을 사용합니다. 제안된 최소 반응 부피는 100 μL이며, 1 × 107 PBMC보다 낮은 세포 수에서도 가능합니다.

  1. 1mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(1x PBS-2% FBS-1mM EDTA) 완충액을 포함하는 1x PBS-2% FBS에서 1-2 × 108 cells/mL 농도의 PBMC 세포 현탁액을 준비하고 원하는 양의 PBMC를 5mL 폴리스티렌 라운드-바텀 튜브로 옮깁니다.
  2. 세포 현탁액 100μL마다 10μL의 Positive Selection Cocktail을 추가하고 잘 혼합한 다음 실온에서 15분 동안 배양합니다.
  3. 세포 현탁액 100μL당 자성 나노입자 10μL를 추가하고, 자성 나노입자를 균일하게 현탁시키기 위해 5배 이상 위아래로 격렬하게 피펫팅하고, 실온에서 10분 동안 배양합니다.
    참고: 볼텍싱은 권장되지 않습니다.
  4. 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA 버퍼를 추가하여 세포 현탁액의 총 부피를 2.5mL로 높입니다. 튜브의 세포를 위아래로 2-3번 부드럽게 피펫팅합니다. 튜브를 자석 분류기에 삽입하고 5분 동안 따로 둡니다.
  5. 자석을 잡고 자석과 튜브를 한 번의 연속 동작으로 뒤집어 상등액 분획을 버리십시오. 자기적으로 표지된 세포는 튜브 내부에 남아 있습니다. 자석과 튜브를 2-3초 동안 거꾸로 두었다가 수직으로 세로로 돌립니다.
    알림: 튜브 입에 매달려 있는 방울을 남겨 두십시오. 흔들거나 더럽히지 마십시오.
  6. 자석에서 튜브를 제거하고 2.5mL의 1x PBS-2% FBS-1mM EDTA 버퍼를 튜브에 다시 추가합니다. 세포 현탁액을 위아래로 2-3회 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 튜브를 자석에 다시 삽입하고 5분 동안 따로 둡니다.
  7. 한 번의 연속 동작으로 자석과 튜브를 모두 반전시켜 상등액 분획을 버립니다. 자석에서 튜브를 제거하고 적절한 양의 1x PBS-2% FBS 버퍼(EDTA 제외)로 세포를 재현탁합니다. 이제 양으로 선택된 셀을 사용할 준비가 되었습니다.
    참고: 자석에는 총 2번의 5분 간격이 필요합니다.
  8. 1x PBS-2% FBS 버퍼를 사용하여 분류된 CD14 세포를 세척하고 세포 현탁액을 12-14mL로 가져와 남아 있는 EDTA를 희석한 다음 600×g(최대 가속 및 감속)에서 10분 동안 원심분리합니다.
  9. 상층액을 버리고 먼저 1mL의 1x PBS-2% FBS 완충액으로 세포 펠릿을 재현탁한 다음 부피를 12-14mL로 보충하여 세척을 반복합니다. 튜브를 600 × g(최대 가속 및 감속)에서 10분 동안 원심분리합니다.
  10. 상등액을 버리고 양성으로 선택된 CD14 단핵구를 2mL의 1x PBS-2% FBS 완충액에 재현탁합니다. 자동 세포 계수기를 사용하거나 멸균된 저온 1x PBS에서 세포 현탁액(1:5)을 희석한 다음 광학 현미경을 사용하여 Trypan Blue에서 (1:2)하여 세포 수를 계산합니다. 배양이 준비될 때까지 세포를 얼음 위에 두십시오.
    참고: 세포 순도는 유세포 분석으로 테스트할 수 있으며, 세포 현탁액 50μL를 취하여 CD14+ 세포(클론 HCD14)로 염색할 수 있습니다. 순도 90% 이상이 권장됩니다.
  11. 배양을 위해 세포 현탁액을 300 × g에서 8-10 °C에서 5분 동안 스핀다운합니다. 10% 불활성화 FBS와 1% 페니실린-스트렙토마이신(RPMI-10% FBS-1% P/S)이 보충된 RPMI 1640을 사용하여 펠렛을 106 cells/mL 농도로 재현탁합니다.
    참고: 고품질의 저내독소, 열 비활성화 FBS를 사용하는 것이 중요합니다. 도금하기 전에 단핵구가 플라스틱 벽에 부착되지 않도록 항상 얼음 위에 유지하십시오.

3. 단핵구 유래 대식세포(M-DM) 분화 및 분극

참고: M-DM 배양은 500 μL의 RPMI-10% FBS-1% P/S를 함유한 48웰 플레이트에 2.5 ×10 5 CD14+ 단핵구를 도금하고 37°C의 가습 인큐베이터에서 CO2(5%)로 7일 동안 배양하여 수행합니다. 플레이트에 대한 단핵구 부착력을 향상시키기 위해 처리된 플레이트를 선택하십시오.

  1. 기저 M-DM(M0), 염증성 M1, 조직 복구 M2a, 조절 M2c 및 원하는 테스트 조건에 대한 웰을 포함하여 실행할 모든 실험 조건을 정의합니다.
  2. 단계 2.11에서 준비한 세포 현탁액의 250 μL를 피펫으로 하여 각 웰에 2.5 ×10 5 CD14+ 단핵구를 시딩합니다.
  3. 각 웰에 250μL의 RPMI-10% FBS-1% P/S와 50ng/mL의 M-CSF를 추가하여 총 부피 500μL를 완성합니다.
  4. 세포 배양 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5% CO2로 4일 동안 배양하여 대식세포 분화의 첫 번째 단계를 허용합니다.
    참고: 세포 배양 분화를 주기적으로 확인하여 형태학적 변화가 예상대로 발생했는지 또는 원치 않는 부착되지 않은 세포가 존재하는지 확인합니다.
  5. M-DM 배양 4일차에 배양 배지의 절반(250μL의 RPMI-10% FBS-1% P/S)을 교체합니다. 분극 조건에 대한 사이토카인 또는 시약을 추가하고 3일(종말점 7일차) 동안 배양합니다: LPS(1ng/mL)와 IFNγ(50ng/mL)는 M1, IL-4(40ng/mL)는 M2a, IL-10(50ng/mL) 또는 M2c는 dexamethasone(0.1μM).
  6. 7일째에 M-DM을 수확하여 표현형 특성화를 수행하거나, 다음 두 단계에 표시된 대로 mRNA 발현을 위해 수집하거나, 기능 분석을 수행합니다.

4. 유세포 분석에 의한 편광 M-DM의 표면 표현형 특성화

  1. 총 배양 배지 부피(48웰 플레이트의 500μL)를 버리고 세포 수확을 위해 200μL의 1x PBS-2% FBS-1mM EDTA 완충액을 추가합니다. 얼음에서 20분 동안 배양한 다음 200μL의 1x PBS-2% FBS를 첨가하여 EDTA 완충액을 희석합니다. 1.5 mL 마이크로튜브에서 위아래로 피펫팅하여 M-DM을 수집합니다. 이러한 수확된 세포를 1x PBS-2% FBS로 한 번 세척하고 800 × g에서 3분 동안 원심분리합니다.
  2. M-DM 펠릿을 200μL의 1x PBS-5% FBS로 재현탁하고 96웰 둥근 바닥 마이크로플레이트로 옮겨 실온에서 15분 동안 차단합니다.800× g에서 3분 동안 세포를 원심분리합니다.
  3. 1x PBS-2% FBS에서 직접 접합 항체의 적절한 조합을 준비합니다. 각 웰 또는 컨디션(1x)을 50μL의 항체 패널로 염색하고 어두운 곳에서 4°C에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 여기서 항체 패널은 CD11b-APC/Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP/Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 및 MERTK-biotin과 Streptavidin-PE로 구성되었습니다. Pretitered 항체 농도는 표 1에 열거되어 있습니다.
  4. 150μL의 1x PBS를 첨가하여 염색된 M-DM을 세척하고 800×g에서 3분 동안 원심분리합니다.
  5. 세포 생존율을 측정하기 위해 정착성 생존도 염료 Zombie Violet 100μL(1x PBS에서 1:1,000)를 추가하고 4°C에서 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다.
  6. 100μL의 1x PBS를 첨가하고 800×g의 원심분리기를 3분 동안 세척합니다. 200μL의 1x PBS를 사용하여 세척 절차를 반복합니다.
  7. M-DM 펠릿을 100μL의 고정액 시약(고정액/투과성 키트에서)으로 재현탁하고 얼음과 어둠 속에서 20분 동안 배양하여 수정합니다.
    알림: 적절한 고정을 위해서는 세포 펠릿을 올바르게 균질화하는 것이 중요합니다.
  8. 100μL의 1x PBS-2% FBS를 첨가하고 800×g에서 3분 동안 원심분리하여 M-DM을 세척 합니다. 200μL의 1x PBS-2% FBS를 사용하여 세척 절차를 반복합니다.
  9. M-DM pellet을 200μL의 1x PBS에 재현탁시키고 염색된 세포를 유세포분석기에서 실행합니다.

5. qPCR에 의한 M-DM 분극을 구별하는 유전자 프로그램 프로파일

참고: 배양 7일차에 고품질 총 RNA의 분리를 위해 RNA 추출 시약을 사용하여 2.5 ×10 5 M-DM을 수확할 수 있습니다. RNA 분리는 컬럼 기반 RNA 추출 및 용출 키트와 같은 대체 방법을 사용하여 수행할 수도 있습니다.

  1. 추출 시약 350 μL를 직접 첨가하여 총 배양 배지 부피와 용해된 M-DM을 폐기합니다. 이 세포 현탁액을 균질화하여 1.5mL RNase-/DNase-free 마이크로튜브로 옮기고 RNA 분리를 계속합니다.
    참고: RNA 분리가 당일에 수행되지 않는 경우 5.1단계의 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 또는 -20°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
  2. nucleoproteins complex의 완전한 해리를 허용하려면 25°C에서 5분 동안 step 5.1의 균질화된 샘플을 배양합니다
  3. 각 샘플에 70μL의 클로로포름을 추가합니다. 누출을 방지하기 위해 각 튜브의 뚜껑을 단단히 닫고 튜브를 흔들어 내용물을 완전히 혼합합니다. 샘플을 2-3분 동안 배양한 다음 4°C에서 15분 동안 12,000×g으로 샘플을 원심분리합니다. 이 단계는 상을 하부 페놀-클로로포름상, 간기 및 무색 상부 수성상으로 완전히 분리합니다.
    참고: 클로로포름의 부피는 용해 단계에서 사용된 추출 시약 1mL당 클로로포름 0.2mL의 비율을 기준으로 합니다.
  4. RNA를 포함하는 수성상을 새로운 1.5 mL RNase-/DNase-free microtube.
    로 옮깁니다. 참고: 수성상을 취할 때 계면 또는 유기 층이 이동하지 않도록 소량을 남겨 두십시오.
  5. 각 샘플에 175μL의 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 침전시킵니다. 4 ° C에서 10 분 동안 배양하거나 -20 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오 .
    참고: 이소프로판올의 부피는 초기 추출 시약 mL당 0.5mL의 이소프로판올 비율을 기준으로 합니다.
  6. 12,000 × g의 시료를 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 전체 RNA의 흰색 젤 같은 펠릿이 튜브 바닥에 침전됩니다. 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 제거하고 폐기합니다.
  7. 350μL의 75% 에탄올(용해에 사용되는 추출 시약(v/v) 1mL당 1mL)에 흰색 젤 같은 펠릿을 재현탁하여 RNA를 세척합니다.
    참고: RNA는 -20°C에서 최대 1년 동안 또는 4°C에서 최대 1주일 동안 75% 에탄올에 저장할 수 있습니다.
  8. 현탁액을 7,500 × g에서 4 °C에서 5분 동안 짧게 와류시킵니다. 마이크로피펫을 사용하여 상층액을 제거하고 폐기합니다. RNA 펠릿을 5-10분 동안 자연 건조하거나 진공 청소기로 청소합니다
    참고: RNA를 가용화하려면 RNA 펠릿의 과건조를 피하십시오.
  9. 위아래로 피펫팅하여 20-30 μL의 RNase-free 물에 펠릿을 재현탁합니다. 55-60 °C로 설정된 수조 또는 열 블록에서 10-15 분 동안 배양하십시오. RNA 농도 측정을 진행하고 RNA를 -70°C에서 보관합니다.
  10. cDNA 합성 키트를 사용하여 20μL의 반응 부피에서 100-500ng의 RNA(각각 최소 및 최대)를 사용하여 역전사(cDNA copy)를 수행합니다.
  11. 1 μL의 cDNA(5-25 ng)를 사용하여 Real-Time PCR 반응을 실행합니다.
    1. 5 μL의 SYBR 녹색 혼합물(2x), 0.2 μL의 각 프라이머(정방향 및 역방향) 및 3.6 μL의 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 각 튜브(1x)에 대한 반응 혼합물을 준비합니다. 샘플 번호에 따라 모든 구성 요소를 확장합니다. 반응 혼합물을 철저히 혼합하고 9μL를 각 qPCR 튜브에 분주하고 마지막으로 1μL의 cDNA를 분주하여 최종 총 부피인 10μL에 도달합니다.
    2. Real-Time PCR 기기에서 열 사이클링 프로토콜을 다음과 같이 프로그래밍할 수 있습니다: 98°C에서 2-3분(1x); 98°C에서 5-15초, 60°C에서 15-30초(35-40x); 마지막으로 2-5초/단계에서 0.5°C 단위로 용융 곡선 분석(65-95°C)을 포함하거나 기기의 기본 설정을 사용합니다.
      참고: 이 반응은 범용 SYBR Green 혼합물을 사용하여 표준화되었습니다. M-DM 분극 분석에 권장되는 프라이머는 표 2에 나열되어 있습니다.
  12. 진핵생물 번역 신장 인자 1 알파 1(EEF1A1)을 참조 유전자로 사용하여 결과를 정규화하고 해리 곡선 분석을 통해 증폭된 산물의 특이성을 확인합니다.
    참고: 해리 곡선 분석을 통해 반응에서 qPCR 증폭 산물이 하나만 존재하는지 확인할 수 있습니다.

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결과

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수년간의 대식세포 특성 분석에 대한 연구를 바탕으로 체외 M-DM의 다양한 하위 집합을 명확하게 구별하는 정확한 마커 조합을 설정했습니다. 표현형 마커는 이전에 수행한 문헌 및 광범위한 이전 스크리닝을 기반으로 선택되었습니다9,14,15,16,17. 또한, CD64, CD206, CD163, CD14 및 MERTK가 비분극 M-DM(M0), 편광 IFNγ/LPS 유도 M1, IL-4 유도 M2a 및 IL-10 또는 덱사메타손 유도 M2c를 유세포 분석으로 명확하게 구별하는 데 도움이 될 수 있음을 확인했습니다4,5

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토론

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대식세포 분화, 활성화 및 분극화는 면역학, 조직 항상성, 질병 병인 및 염증 해결의 중심 초점이 되었습니다. 또한, 조직 대식세포가 항상성 붕괴 조건에서 순환하는 단핵구에서 파생될 수 있다는 새로운 그림은 정의된 표현형, 전사 프로그램 및 활성화 경로를 특징으로 하는 정확한 M-DM 모델의 필요성을 강조합니다.

성공적인 구현을 위해 이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계를 여기에서 논의해야 합니다. 첫째, 1차 M-DM 배양이 확립되는 혈액 샘플은 연령, 성별, 유전적 배경 또는 일부 생물학적 반응에서 상당한 변화를 생성할 수 있는 환경 변수와 관련하여 이질적일 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 따라서 동일한 기증자로부터 기초 생물학적 및 실험적 대조군을 갖는 것이 중요합니다. 쌍을 이루는 분석이 권장됩니다. 그럼에도 불구하고 반응 스펙트럼이 생물학적 중요성을 더 잘 반영하기 때문에 높은 변동은 장점으로 간주될 수도 있습니다. 단일 세포 현탁액은 분류하기 전에 70% 이상의 생존 ...

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공개 사항

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저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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이 작업은 EACS에 PICT 2018-3070 및 2021-I-A-00807 보조금을 통해 ANPCyT-FONCYT(National Agency for the Promotion of Science and Technology)와 E.A.C.S.에 PICT 2021-I-A-00716을 지원하고, PIP 2022-0763을 통해 국가 과학 기술 연구 위원회(CONICET)와 Proyectos de Investigación y Desarrollo en Áreas Estratégicas con Impacto Social(PIDAE) 2022를 통해 부에노스아이레스 대학교의 지원을 받았습니다. A.E.E.E.C.S. 및 A.E.E.는 CONICET의 경력 조사관입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 488 마우스 안티 휴먼  CD206 항체 클론 15-2BioLegend, San Diego, CA, USA.고양이# 321113; RRID:AB_571874
APC 마우스 항인간 CD64 항체 클론 10.1BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.고양이# 305013; RRID:AB_1595539
APC/Cy7 쥐 안티 마우스/인간 CD11b 항체 클론 M1/70BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.고양이# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, USACat# 554714고정제/투과화 키트
비오틴 항인간 MERTK 항체 클론 590H11G1E3BioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.고양이# 367616; RRID:AB_2721500 
CFX-Connect 장비 Bio-Rad, Hercules, CA, USA
EasySep 인간 CD14 포지티브 셀렉션 키트; EasySep 포지티브 셀렉션 칵테일; EasySep 자성 나노 입자; Easy SepMagnet STEMCELL Technologies, 밴쿠버, 캐나다Cat# 18058
FACS Canto cytometer Becton Dickinson, 프랭클린 호수, 뉴저지, 미국.
Fetal Bovine Serum, 예선, 뉴질랜드 Gibco™   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA USA 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Life Sciences, USACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad 프리즘   GraphPad 소프트웨어 Inc.RRID:SCR_002798
iScript cDNA 합성 키트, 5x 역전사 반응 믹스, iScript 역전사효소, 뉴클레아제가 없는 물포함 Bio-Rad, Hercules, CA, USACat# 1708891
Partec CyFlow 공간 사이토미터 Sysmex Partec, 독일
PE StreptavidinBioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.Cat# 405203
PE/Cy7 마우스 anti-human CD14 항체 클론 HCD14BioLegend, San Diego, CA, USA.고양이# 325618; RRID:AB_830691
PerCP/Cy5.5 마우스 안티 휴먼 CD163 항체 클론 GHI/61BioLegend, 샌디에고, 캘리포니아, 미국.고양이# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 미디엄Gibco™   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA USA 		Cat# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, 이는 항체 매개 핫스타트 Sso7d fusió를 포함하고 있습니다; n 중합효소, dNTP, MgCl2, SYBR Green I 염료, 인핸서, 안정제 및 수동 참조 염료(ROX 및 플루오레세인 포함) 혼합물.Bio-Rad, Hercules, CA, USACat# 1725271
TriZol 시약Thermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
Carlsbad, CA, USA 		Cat#  15596026RNA 추출 시약
Zombie Violet Fixable Viability KitBioLegend, 샌디에이고, 캘리포니아, 미국.고양이# 423113

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