조직 샘플의 피부 세포 표현형 및 증식 상태를 평가하기 위한 고처리량 이미징 및 분석 워크플로우

Summary

IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity)와 상용 뉴클레오티드 표지 분석(Click-iT EdU)의 조합은 고정된 냉동 쥐 조직 절편에서 매우 역동적인 과정에서 분열하는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다. 또한 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인은 처리량이 많은 이미지 획득 및 분석을 제공합니다.

Abstract

피부 손상은 다양한 세포 유형을 관여시키는 복잡한 재생 캐스케이드를 시작합니다. 그 중에서도 말초 신경교세포는 복구 과정의 성공을 보장하는 데 중요한 역할을 합니다. 그러나 이러한 프로세스에 대한 우리의 이해는 현재 기술의 한계로 인해 불완전합니다. 따라서 조직 재생에 관여하는 주요 세포 유형 및 구조에 의해 발현되는 단백질에 대한 항체를 사용하여 피부의 세포 구성 변화를 특성화하기 위해 IBEX(Iterative-bleaching-extends-multiplexity) 방법을 사용했습니다. 중요한 것은 세포 증식 마커에 대한 항체가 종종 피부에서 분열하는 세포의 수를 과소평가한다는 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 Click-iT EdU 화학을 IBEX 분석법과 결합하여 증식하는 세포 유형의 상세한 특성화를 가능하게 했습니다. 완전 자동화된 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 24웰 플레이트로 절편된 샘플의 반복 이미징을 위한 고처리량 워크플로우가 개발되었습니다. Click-iT EdU 를 사용하여 세포 상태를 현장에서 평가하기 위해 IBEX 방법을 확장하는 것 외에도 이미지 보정, 스티칭 및 등록을 수행하는 새로운 오픈 소스 이미지 처리 파이프라인도 도입되었으며 광범위한 프로그래밍 경험이 없는 연구원도 사용할 수 있습니다. 또한 고도로 다중화된 이미징 데이터 처리 및 시각화에 대한 자세한 문서(Fiji 및 QuPath를 포함한 기존 이미지 분석 소프트웨어 사용)도 제공됩니다. 요약하면, 이 프로토콜은 IBEX 프로토콜의 다양성을 강조하고 확립된 기존 이미징 플랫폼에 대한 적응성을 보여줍니다. 특히, IBEX와 Click-iT EdU 라벨링을 결합하면 온전한 조직과 공간 해상도에서 매우 역동적인 프로세스 동안 활발하게 분열되는 세포 유형을 검출하고 분류할 수 있습니다.

Introduction

피부는 인체의 가장 큰 기관이자 외부 환경으로부터 신체를 보호하는 원시 장벽입니다¹. 결과적으로 장벽 기능을 손상시키는 수많은 외부 문제에 노출됩니다. 따라서 피부는 손상 후 조직의 무결성과 기능을 회복하는 복잡한 메커니즘을 개발했습니다. 피부 상처 치유는 염증, 증식, 성숙/리모델링의 세 가지 중첩 단계로 이루어집니다. 이 세 단계에는 진피 섬유아세포 및 면역 세포와 같은 여러 가지 세포 유형이 포함되며, 이들은 함께 작용하여 손상된 피부 조직의 초기 생물학적 특성을 복원합니다 ^1,2,3.

피부는 조밀하게 신경분포된 기관이며, 성공적인 복구 과정을 위해서는 신경 분포가 중요한 것으로 알려져 있습니다 ^4,5,6. 축삭 신호^{전달 4,7,8} 외에도, 일반적으로 축삭을 감싸는 말초 아교세포는 성공적인 조직 재생에 참여합니다 ^9,10,11. 그러나 말초 신경교세포와 같이 과소 대표되는 세포 유형의 역할은 피부 조직 재생과 같은 동적 과정에서 잘 이해되지 않고 있습니다. 이러한 세포의 기능을 더 잘 결정하려면 세포 미세 환경과 재생 과정에서 상호 작용할 수 있는 인접 세포 유형을 분석하는 것이 중요합니다. 또한, 세포 증식은 조직 재생의 핵심 단계이기 때문에 복구 과정 전반에 걸쳐 증식하는 세포 유형을 정확하게 검출하고 분류하는 것이 중요합니다.

IBEX¹²와 같은 다중화, 고함량, 광학 이미징 방법은 세포 구성을 특성화하고, 세포-세포 상호 작용을 시각화 및 정량화하고, 공간 해상도에서 복잡한 조직 내의 미세 환경 패턴을 해부하기 위해 개발되었습니다. 다른 멀티플렉싱 방법에는 특수 기기와 독점 시약이 필요한 반면, IBEX의 특별한 장점은 표준 연구 환경에서 접근할 수 있는 상업적으로 이용 가능한 항체, 시약 및 현미경을 사용하여 상대적으로 저렴한 비용으로 구축할 수 있다는 것입니다. IBEX 패널에서 자주 사용되는 항-Ki-67 항체는 많은 조직에서 증식하는 세포 유형을 안정적으로 표지하는 반면^13,14, Ki-67 양성(Ki-67+) 세포의 수는 급성 쥐 피부 상처의 고정된 냉동 조직 절편에서 다른 방법론에 비해 과소평가된 것으로 밝혀졌습니다. 따라서 Click-iT EdU 화학과 IBEX를 결합한 결과 EdU⁺ 세포의 수가 다른 방법론으로 얻은 증식 세포의 총 수를 보다 정확하게 나타낸다는 것을 발견했습니다.

또한, 완전 자동화된 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 24웰 플레이트에 배치된 조직 절편의 반복 이미징을 위한 고처리량 워크플로우가 설정되었습니다. 그런 다음 결과 이미지는 여러 오픈 소스 Python 도구를 고르지 않은 조명에 대해 이미지를 수정하고 개별 타일의 스티칭을 수행하며 궁극적으로 이미지 등록을 수행하는 새로운 이미지 처리 파이프라인으로 결합하여 처리됩니다. 상세하여, BaSiCPy 라이브러리(¹⁵ )는 조명 보정을, m2stitch 라이브러리는 이미지 스티칭을, 위상 교차 상관은 주기 등록을 위해 사용되었다. 등록된 이미지는 OME-TIFF로 저장된 다음 Fiji¹⁷ 및 QuPath¹⁸과 같은 기존 이미지 분석 소프트웨어에 로드할 수 있으며, 여기서 이미지를 추가로 처리하고 세포 유형 분류 및 강도 및 거리 계산과 같은 기타 측정을 수행할 수 있습니다. 종합하면, 본 프로토콜을 통해 우리는 말초 신경교세포 집단을 둘러싼 세포 미세 환경에 특히 초점을 맞춰 재생 피부의 주요 세포 유형에 대한 상세하고 매우 효율적인 특성화를 수행할 수 있었습니다.

Protocol

모든 동물 사육, 사육 및 실험은 스위스 취리히 주 수의학 사무소의 지침에 따라 수행되었습니다.

1. 전층 피부 상처(0일)

1. 8-10주 령의 마우스를 70% O₂ 중 5% 이소플루란으로 유도하고 2.5% 이소플루란을 사용하여 유지한다.
2. 등 피부를 면도하고 깨끗이 청소하십시오.
3. 수술 전 항균 비누와 70% EtOH 용액을 사용하여 소독하십시오.
4. 부프레노르핀(30μg∙mg^∙kg-1)을 피하 주사하여 수술 전 진통제를 적용합니다.
5. 각 동물의 허리 피부에 직경 5mm의 원형 전층 절제 상처 4개, 양쪽에 2개, 동물의 정중선에서 1cm, 서로 약 2cm 떨어져 있는 상처를 생성합니다¹⁹.
6. 식수(2% 자당이 포함된 9μg/mL)를 통해 부프레노르핀을 3일 동안 치료하여 수술 후 진통을 수행합니다.
7. 드레싱 없이 상처가 치유되도록 하십시오.
8. 조직학적 검사 및 유세포 분석을 위해 정의된 시점에서 상처를 수집합니다.
9. IBEX 프로토콜의 경우 4°C에서 밤새 4% 파라포름알데히드(PFA) 용액으로 피부 조직을 해부하고 고정합니다. 시중에서 판매되는 생검 캡슐을 사용하여 고정 중 샘플이 말리는 것을 방지하십시오. 4°C에서 밤새 PBS의 30% 자당에 있는 4% PFA 고정 조직을 냉동 보호합니다. 조직을 30% 자당과 O.C.T 화합물의 1:1 혼합물에 RT에서 2시간 동안 옮기고 마지막으로 O.C.T에 포매한 후 이소펜탄에서 급속 냉동합니다.

2. 샘플 준비(1일차)

1. 24웰 플레이트를 200μL의 크롬 명반 젤라틴으로 로커 셰이커에서 15분 동안 코팅합니다. 그런 다음 젤라틴을 완전히 제거하고 코팅된 웰을 40°C 오븐에서 60분 동안 건조시킵니다. 백업으로 필요한 우물을 두 배로 코팅합니다. 웰당 2mL의 PBS를 추가합니다.
   알림: 티슈를 놓기 전에 코팅이 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 우물은 하루 전에 코팅하고 RT에서 밤새 건조할 수도 있습니다. 코팅된 후에는 코팅된 웰을 냉장고나 냉동고에 보관하지 말고, 최상의 결과를 얻으려면 코팅된 24웰 플레이트를 1-2일 이내에 사용하십시오.
2. 저온 조절기에서 O.C.T 포매 조직을 15-30μm 두께로 자르고 2mL의 PBS가 들어 있는 코팅된 웰로 빠르게 옮깁니다.
   참고: 조직은 금속 주걱이나 겸자를 사용하여 옮길 수 있습니다.
3. 조직 절편을 웰 중앙에 유지하는 것을 목표로 1mL 피펫을 사용하여 PBS를 조심스럽게 제거합니다. 이를 효과적으로 수행하려면 웰 가장자리에서 PBS를 천천히 흡인하고 필요에 따라 피펫 위치를 조정하여 조직이 이동하는 것을 방지합니다.
   참고: 조직의 정확한 배치는 프로토콜의 성공에 필수적입니다. 조직이 코팅된 표면에 부착되면 위치를 변경할 수 없습니다.
4. 조직 절편을 37°C 오븐에서 1시간 동안 건조시킵니다.

3. 조직 차단, EdU Click-iT 반응 및 항체 면역표지, IBEX 주기 1(1일)

1. 1mL의 PBS로 5분 동안 재수화합니다.
2. RT에서 30분 동안 PBS에 500μL의 0.5% Triton으로 조직을 투과화합니다.
3. PBS로 조직을 2회 짧게 씻습니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 RT에서 30분 동안 Click-iT 반응을 수행합니다.
   알림: 샘플을 빛으로부터 보호하십시오.
5. PBS로 조직을 2회 짧게 씻습니다.
6. 차단 완충액을 사용하여 실온(RT)에서 1시간 동안 조직을 차단합니다.
   참고: 여기에서는 PBS의 10% 당나귀 혈청이 이 실험에 사용되었지만 필요에 따라 조정할 수 있습니다. 표준 면역 표지 프로토콜과 호환되는 모든 차단 완충액이 적합합니다.
7. 1차 항체(블로킹 완충액에 희석, 재료 표 참조)를 4°C에서 밤새 1주기 동안 적용합니다.
   참고: 차단 및 면역 표지는 Radtke et ^al.12에 설명된 바와 같이 가열되지 않는 마이크로파를 사용하여 ~1시간 동안 수행할 수도 있습니다. 그러나 피부 상처의 경우 1차 항체를 밤새 배양할 때 최상의 신호 대 잡음비를 얻을 수 있습니다. 면역 표지 조직 절편은 이미징 전 며칠 동안 PBS에 보관할 수 있습니다. 최적의 신호 품질을 위해 다음날 이미징을 권장합니다.

4. 2차 항체 면역표지 및 핵 대조염색(2일차)

1. 3 x 1mL의 PBS로 웰을 세척합니다.
2. 조직 절편을 차단 용액에서 항-토끼 2차 항체 염색(1:300)과 함께 핵 대대 염색 Hoechst 1:1,000과 함께 어두운 RT에서 1시간 동안 배양합니다.
3. RT에서 1mL의 PBS로 3 x 5분 세척합니다.
4. 각 웰에 ~500μL의 PBS를 남겨두고 플레이트를 현미경으로 가져옵니다.
   참고: 이것은 일시 중지 지점일 수 있습니다: 샘플은 4°C에서 며칠 동안 안정적이지만 신호 대 잡음비는 면역 표지 후 24시간 이내에 이미징할 때 가장 좋습니다.

5. 첫 번째 IBEX 주기의 현미경 설정 및 이미징(2일차)

1. 현미경에 로그인하고 소프트웨어를 로드한 다음 사용자 프로필에 로그인합니다.
2. 획득 설정을 입력합니다( Screening | Acquisition Setup)을 사용하여 프로토콜 구성 및 이미지 획득을 수행할 수 있습니다.
3. 꺼내기 버튼을 사용하여 플레이트를 현미경에 로드합니다.
4. 플레이트를 현미경에 넣기 직전에 70% 에탄올로 24웰 플레이트의 바닥을 청소합니다. 플레이트 로드 버튼을 클릭하여 플레이트를 현미경에 로드합니다.
5. 대 물렌즈 및 카메라에서 원하는 배율 및 획득 모드를 선택합니다. 획득 모드로 공초점 51μm 슬릿 모드를 선택합니다.
   참고: 여기에서는 개구수가 0.95인 20x 수침 대물렌즈와 250μm 간격으로 50μm 핀홀이 있는 회전 디스크를 실험에 사용했습니다.
6. 플레이트 탭에서 사용된 플레이트 모델을 선택합니다.
7. 접시/방문 사이트 탭으로 이동합니다. 사이트 옵션에서 고정 사이트 수를 클릭합니다. 대략 전체 웰이 덮이도록 열과 행의 수를 선택합니다. 사이트 10% 중복을 클릭합니다.
   알림: 개별 타일의 스티칭을 보장하려면 이 버튼을 활성화해야 합니다.
8. 유정 맵에서 해당 유정을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 획득할 첫 번째 채워진 유정만 선택합니다. 선택한 우물은 녹색이고 선택되지 않은 우물은 회색입니다.
9. 플레이트 맵에서 첫 번째 채워진 웰과 사이트맵의 중앙 근처 부위를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 스테이지를 조직이 있어야 하는 위치로 이동합니다. 현재 위치를 나타내는 우물과 사이트의 더 어두운 색상을 찾으십시오.
10. 획득 탭으로 이동합니다. 레이저 기반 초점 활성화 및 Z 시리즈 획득 옵션을 선택합니다.
11. 획득/자동 초점 탭으로 이동합니다. 웰 자동 초점의 경우 플레이트 및 웰 하단에 포커스 옵션을 선택하고 사이트 자동 초점의 경우 모든 사이트 옵션을 선택합니다.
12. 파장 탭으로 이동하여 현재 주기에서 이미징할 염료 수를 선택합니다. 파장 탭 아래에 열리는 해당 수의 새 탭을 찾습니다.
13. 첫 번째 파장 탭으로 이동합니다. 조명 에서 관심 있는 형광단에 가장 적합한 필터 설정을 선택합니다(예: Hoechst가 사용된 경우 DAPI 선택).
14. z-포지셔닝에 대해 Z-오프셋이 있는 레이저를 선택하고 오프셋 계산 버튼을 클릭하여 올바른 이미징 높이를 설정합니다. 일련의 이미지가 서로 다른 z-위치에서 획득됩니다. 샘플에 가장 잘 초점을 맞춘 것을 선택하십시오.
    알림: 스테이지 위치가 티슈가 있는 위치로 설정되어 있는지 확인하십시오. 이 위치에 조직이 보이지 않으면 다른 부위를 선택하고 다시 시도하십시오(4.9단계 참조).
15. 초점 버튼을 누르고 조직의 초점이 맞춰진 이미지가 표시될 때까지 기다립니다.
16. 조명 파워에서 50%를 선택합니다. 타겟 최대 강도에 2000을 입력하고 자동 노출을 눌러 노출 시간을 자동으로 조정합니다.
    알림: 획득 속도를 높이기 위해 레이저 출력을 높여 노출 시간을 줄일 수 있습니다. 그러나 이로 인해 더 많은 사진 표백이 발생할 수 있으며, 이로 인해 개별 타일이 겹치는 이미지 아티팩트가 발생할 수 있습니다.
17. Z 시리즈에서 Z 시리즈 및 2D 프로젝션 이미지를 선택하고 음영 보정에서 FL 음영만을 선택합니다.
18. 다른 파장에 대해 5.13-5.17단계를 반복하되 Z-오프셋이 있는 레이저 대신 W1에서 Z-오프셋 을 선택하고 0을 선택합니다.
19. Z 시리즈 탭으로 이동합니다. 원하는 스텝 크기를 입력합니다(20x 대물렌즈의 경우 0.5μm의 스텝 크기 사용).
    참고: 권장 값의 2-3배인 스텝 크기를 사용하여 획득 속도를 높일 수 있습니다.
20. 포커스 버튼을 클릭하고 현재 위치라고 표시된 화살표가 나타날 때까지 기다립니다.
21. 라이브 시작을 클릭하고 라이브 이미지가 있는 새 창이 나타날 때까지 기다립니다. 티슈 바닥에 도달할 때까지 현재 위치 화살표를 드래그하고 B 설정 버튼을 클릭합니다. 조직의 상단에 도달할 때까지 현재 위치 화살표를 드래그하고 T 설정 버튼을 클릭합니다. F2: 중지를 클릭합니다.
    알림: Active Wavelength에서 라이브 이미징에 사용되는 파장을 선택할 수 있습니다.
22. 획득할 사이트를 선택합니다. 먼저 스테이지를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 스테이지가 첫 번째 웰에 있는지 확인하고 라이브 시작을 다시 누릅니다. 사이트 맵의 다른 사이트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 우물 내부의 다른 위치로 이동합니다. 조직의 경계를 찾고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 획득할 조직이 포함된 모든 부위를 표시합니다. 선택한 사이트는 녹색이고 선택 취소된 사이트는 회색으로 표시됩니다.
    참고: 지금은 첫 번째 웰에 대해서만 이 작업을 수행하고 첫 번째 웰만 획득을 위해 선택되었는지 확인하십시오.
23. 실행 탭으로 이동합니다. 플레이트 이름의 이름을 "Cycle{i}_Well{w}_{description}"으로 지정합니다. {i}, {w} 및 {description}을 해당 값/설명으로 바꿉니다.
24. 프로토콜 저장을 클릭하고 이름에 "Cycle{i}_Well{w}"를 다시 포함하여 저장합니다.
25. 다른 모든 유정에 대한 획득 영역을 설정합니다. 이를 위해 5.22-5.24단계를 반복합니다.
    참고: 획득할 각 웰에 대해 개별 프로토콜 파일을 저장해야 합니다. 새 ROI를 그리기 전에 올바른 유정이 활성화되었는지 확인하십시오. 결과는 획득할 웰당 하나의 저장된 프로토콜이어야 합니다. 이것은 조직의 모양이 우물마다 다르기 때문에 필요합니다. 웰 간에 ROI와 z-스택이 동일한 경우 반복되는 5.22-5.24단계를 건너뛸 수 있으며 5.26-5.29단계도 건너뛸 수 있습니다. 이 경우 이미징할 모든 웰을 선택하고(5.22단계 참조) 실행 탭으로 이동한 다음 플레이트 획득을 누르기만 하면 됩니다.
26. 제어 | 저널 | 녹음을 시작한 다음 즉시 제어 | 저널 | 녹음을 중지합니다. 생성된 저널을 저장하고 Control | 저널 | 저널 편집.
27. 왼쪽 패널에서 Plate Acquisition - Load Protocol From File 및 Plate Acquisition 을 찾아 두 번 클릭하여 해당 단계를 저널에 추가합니다. 오른쪽 패널에서 찾으십시오. 추가된 Plate Acquisition - Load Protocol From File 을 두 번 클릭하고 첫 번째 웰에 대해 저장된 프로토콜을 선택합니다(5.24단계 참조).
28. 획득할 각 웰에 대해 5.27단계를 반복하고 항상 해당 프로토콜을 로드합니다.
29. 저장을 클릭하고 마지막으로 저널 실행을 클릭하여 수집을 시작합니다(z-스택이 15μm인 180개의 타일을 수집하는 데 약 3시간이 소요됨).

6. 형광단 표백(2일차)

1. 저널이 끝나기 약 30분 전에 표백 시약을 준비합니다. 10mg의 수소화붕소리튬을 10mL의_ddH2O에 녹이고 0.22μm 필터를 통과시킵니다. 거품이 형성될 때까지 10분 동안 그대로 둡니다. 효율적인 표백을 위해서는 준비 후 4시간 이내에 표백 시약을 사용하십시오.
   주의 : 수소화 붕소리튬은 공기와 반응하여 가연성 수소 가스를 생성할 수 있으므로 화학 후드 아래에서 작업하십시오.
2. 표준 주변 조명에 노출된 상태에서 15분 동안 1mg/mL의 수소화붕소 리튬 1mL로 형광단을 표백합니다. 표백 절차 중에 조직에서 작은 거품을 찾으십시오.
   알림: 화학 후드 아래에서 작업할 때 표백 절차 중에 조명이 자동으로 꺼지지 않도록 하십시오.
3. 1mg/mL의 수소화붕리튬(동일한 용액에서 제조)을 15분 동안 또 다른 1mL로 표백을 반복합니다.
4. 1mL의 PBS로 3 x 5분 동안 웰을 세척합니다.
   참고: 표백 시약을 불완전하게 제거하면 다음 항체 패널이 손상될 수 있으므로 세척 시간을 단축하지 마십시오.

7. IBEX 주기(2일차)

1. 다음 면역표지 주기(단계 3.7)를 위해 1차 항체를 적용하고 4°C에서 밤새 배양합니다. 4.4-5.4단계를 반복합니다.
   참고: 4.2-4.3단계는 비결합 토끼 항체가 첫 번째 IBEX 주기에서만 사용되므로 반복되지 않습니다. 그러나 닭이나 기니피그와 같이 덜 흔한 종에서 배양된 비결합 항체는 2차 항체가 결합된 1차 항체와 교차 반응하지 않기 때문에 이후 주기에서도 사용할 수 있습니다. 각 주기에 사용되는 항체에 대한 정확한 세부 정보는 재료 표에서 확인할 수 있습니다.
2. 현미경에서 로컬 PC에 Cycle{i}_Well{w}로 저장된 로드 프로토콜 을 클릭하여 해당 웰에 대한 이전 IBEX 사이클의 프로토콜 설정을 로드합니다(5.24단계). 프로토콜 설정에는 ROI(획득할 타일 선택), 배율, 자동 초점 설정 및 이전 IBEX 주기(5.5-5.25단계)에서 저장된 추가 획득 설정이 포함됩니다.
3. 파장 탭을 선택하고 새로운 항체 패널에 대한 노출 및 조명 전력을 조정합니다(단계 5.12-5.18). 나중에 주기를 정렬하기 위해 모든 주기에 걸쳐 하나의 마커(일반적으로 DAPI 또는 Hoechst)를 이미지화해야 합니다.
   참고: Radtke et ^al.18에서 보고된 바와 같이, GFP 및 tdTomato와 같이 일반적으로 사용되는 형광 단백질은 리튬 붕소화물 표백에 민감하지 않습니다. tdTomato와 같은 내인성 형광 단백질이 포함된 조직으로 작업할 때 이미지 등록에 필요하지 않은 경우 주기 1 이후 해당 파장을 획득에서 생략할 수 있으므로 이미징 속도가 빨라집니다. 파장은 획득 채널 수를 줄여 전체 파장 탭에서 제거할 수 있습니다. 또한, 이미징 주기 동안 조직 자가형광의 일관된 증가가 관찰되지 않았습니다. 그러나 이것은 조직 유형에 따라 다를 수 있습니다¹⁸.
4. z-Stack 설정이 여전히 합리적인지 확인하고 그에 따라 조정합니다(5.19-5.21단계).
   참고: z-스택의 단계 크기가 모든 주기에서 동일한지 확인하십시오.
5. 실행 탭에서 플레이트 이름을 업데이트하고 프로토콜을 다시 저장합니다.
6. 획득할 모든 우물에 대해 7.2-7.5단계를 반복합니다.
   알림: 첫 번째 웰에서 사용된 모든 파장에 대한 노출 설정을 기록하고 모든 후속 웰에서 동일한 설정을 사용하는 것이 좋습니다.
7. 저널을 편집하고, 새 프로토콜 파일을 선택하고, 이 주기에 대한 저널을 저장하십시오.
8. 저널을 실행합니다.
9. 6.1-6.4단계를 반복하여 형광단을 표백합니다.
10. 원하는 양의 면역 표지가 달성될 때까지 단계 7.1-7.9를 반복합니다.

8. 이미지 처리(2일차)

1. IBEX 주기의 이미지 획득을 완료한 후 이미지 데이터를 내보냅니다.
   1. 선별 심사 | 플레이트 데이터 유틸리티 | 이미지 내보내기.
   2. 플레이트 선택을 클릭하고 각 사이클과 웰에 대해 획득한 모든 플레이트를 선택합니다.
   3. 모든 Z 평면을 선택하고 출력 디렉토리를 선택한 다음 확인을 눌러 데이터를 내보냅니다.
      참고: 데이터는 각 타일 및 평면에 대한 개별 tiff 파일로 내보내집니다. 모든 타일과 주기를 결합하기 위해 다음 처리 단계가 수행되었습니다.
2. 다음 구성표에 따라 내보낸 데이터를 폴더에 정렬합니다. 각 주기가 하나의 폴더이고 각 채널에 대해 다시 하나의 폴더가 포함되어 있는지 확인합니다. 이름은 다음과 같습니다: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", 여기서 {i} 및 {well}은 해당 주기 및 well이고 *는 임의의 문자입니다. 예: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   참고: 후속 처리 단계에는 올바른 이름 지정 및 폴더 구조가 필요합니다.
3. 필요한 Python 패키지 설치: Python 환경을 관리하기 위해 Miniforge를 사용합니다. 설치 지침은 https://github.com/conda-forge/miniforge 를 참조하십시오.
   참고: 처리 단계의 코드는 Jupyter Notebook 형식으로 제공됩니다. https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove 또는 보충 파일(보충 파일 1, 보충 파일 2, 보충 파일 3, 보충 파일 4 및 보충 파일 5)에서 찾을 수 있습니다.
4. Github에서 코드를 다운로드할 때 코드 | ZIP을 다운로드 하고 README.md 파일의 설치 지침을 따릅니다.
5. Jupyter-Lab 시작(보충 파일 2):
   1. 터미널에 conda activate zmb-ibex-jove 를 입력하여 설치된 conda 환경을 활성화합니다.
   2. 터미널에서 예를 들어 cd C:\path\to\zmb-ibex-jove를 입력하여 다운로드한 디렉토리로 변경합니다.
   3. 터미널에 jupyter-lab을 입력하여 Jupyter-Lab 을 시작합니다. 브라우저 창이 jupyter-lab으로 열립니다.
6. 조명 보정 계산:
   1. 왼쪽 탭에서 " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" 노트북으로 이동하여 두 번 클릭하여 엽니다. 이 노트북은 BaSiCPy 라이브러리(보충 파일 3)를 사용하여 조명 보정 이미지를 계산합니다.
   2. "base_dir"과 "save_dir"을 올바른 경로, 데이터가 있는 위치, 조명 보정 이미지를 저장해야 하는 위치로 변경합니다.
   3. Notebook 내에서 코드를 실행하려면 각 셀 을 선택하고 Shift+Enter 키를 눌러 실행합니다. 노트북을 위에서 아래로 실행합니다.
7. 각 개별 주기에 대해 스티칭을 수행합니다(보충 파일 4):
   1. 왼쪽 탭에서 다음 노트북으로 이동하여 "02_stitching_MD.ipynb" 를 엽니다 . 이 노트북에서는 각 사이클에 대해 개별 타일을 로드하고, 조명을 수정하고, 함께 연결하여 웰 및 사이클당 하나의 이미지 파일을 생성합니다. 스티칭에는 m2stitch 라이브러리(https://github.com/yfukai/m2stitch)를 사용합니다.
   2. 첫 번째 셀의 입력을 올바른 파일 경로로 변경합니다. 노트북을 위에서 아래로 다시 실행 합니다.
8. 주기 사이에 이미지 등록을 수행합니다(보충 파일 5):
   1. 왼쪽 탭에서 다음 노트북으로 이동하여 "03_registration_pcc.ipynb" 를 엽니다 . 이 노트북에서 개별 주기는 오픈 액세스 scikit-image 라이브러리(https://scikit-image.org/)의 위상 교차 상관 알고리즘으로 계산되는 병진 변환만 사용하여 서로 정렬됩니다.
   2. 첫 번째 셀의 입력을 올바른 파일 경로로 변경합니다. 사용할 참조 주기 및 참조 채널(일반적으로 DAPI)을 선택합니다. 노트북을 위에서 아래로 다시 실행 합니다.
      참고: "옵션 1: 모든 채널을 함께 로드 및 저장" 및 "옵션 2: 채널을 개별 파일로 로드 및 저장" 장 중 하나만 실행하면 됩니다. 첫 번째 장에서는 모든 주기의 모든 채널을 포함하는 하나의 큰 파일을 만듭니다. 두 번째 장에서는 각 채널에 대한 개별 파일을 만듭니다. 두 번째 옵션은 처리하는 데 더 적은 메모리가 필요합니다.

9. 이미지 분석(2일차)

1. Fiji(https://imagej.net/software/fiji/downloads)를 다운로드하여 엽니다.
   참고: 결과 이미지는 3D 이미지로 분석할 수 있는 다중 평면 및 다중 채널 이미지입니다. 여기에서는 최대 강도 투영이 먼저 계산되는 2D 데이터에 대해서만 예제 분석 워크플로우가 표시됩니다.
2. 파일을 피지 창으로 드래그하여 피지에서 파일을 엽니다.
3. 이미지 | 스택 | Z 프로젝트...를 선택하고 최대 강도를 선택한 다음 확인을 누릅니다. 파일 | 다른 이름으로 저장 | 오메-티프".
4. 세포를 분석하려면 오픈 소스 소프트웨어 QuPath를 사용하십시오. https://qupath.github.io/ 에서 다운로드하여 설치하십시오.
5. QuPath를 열고 빈 폴더를 창으로 드래그하여 새 프로젝트를 만듭니다.
6. 모든 파일을 QuPath 창으로 드래그하고 표준 설정으로 가져오기 를 눌러 프로젝트로 가져옵니다.
7. 왼쪽 패널에서 이미지를 두 번 클릭하여 엽니다. 메시지가 표시되면 형광으로 지정합니다.
8. Shift+C를 눌러 밝기/대비 창을 엽니다.
   알림: 여기에서 표시할 채널을 선택하고 밝기와 대비를 조정할 수 있습니다. 이름을 두 번 클릭하여 채널 이름과 색상을 변경할 수도 있습니다.
9. 도구 | 다각형 도구를 사용하고 조직 영역에 주석을 달 수 있습니다. 주석 탭에서 새 주석을 찾습니다. 주석을 선택하고 클래스(예: 기타)를 선택한 다음 클래스 설정을 눌러 특정 클래스로 설정합니다.
10. 세포 검출: 분석으로 이동 | 세포 검출 | 세포 검출.
    1. 핵 채널을 선택합니다.
    2. 대부분의 설정은 그대로 두되 마우스로 핵 위로 마우스를 가져가고 오른쪽 하단 모서리에 표시된 강도를 확인하여 임계값을 조정합니다. 배경 영역 위로 마우스를 가져가서 강도를 다시 확인합니다. 배경과 전경 사이의 중간 값을 임계값으로 선택합니다.
    3. 실행을 클릭합니다.
11. 세포 및 측정값 검사:
12. 셀을 두 번 클릭하거나 계층 탭에서 셀을 선택하여 왼쪽 하단 패널에서 측정값을 검사합니다. 세포, 핵 및 세포질에 대해 서로 다른 모양과 강도 측정을 추가해야 합니다.
13. 셀 분류:
    1. 채널의 강도에 따라 감지된 세포를 분류하려면 분류 | 객체 분류 | 단일 측정 분류기를 생성합니다.
    2. 채널 필터에서 원하는 채널을 선택하고 측정에서 적절한 측정값(예: 셀: 채널 평균)을 선택합니다.
    3. 양수 셀과 음수 셀 위로 다시 마우스를 가져가서 둘 사이의 값을 선택하여 임계값을 조정합니다.
    4. 예를 들어, 임계값 초과에 대해 양수, 임계값 미만에 대해 음수를 선택합니다. 라이브 미리보기를 확인하여 결과를 확인합니다.
    5. 적용을 눌러 셀을 분류합니다.
14. 주석이 달린 물체(예: 신경다발)까지의 거리 측정:
    1. 도구 | 브러시 도구.
    2. 관심 영역(예: 신경 다발)을 그립니다.
    3. 주석 탭으로 이동합니다. 모든 새 주석을 선택하고 해당 클래스를 선택한 다음 클래스 설정을 누릅니다.
       참고: 클래스 창에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 추가/제거 | 클래스를 추가합니다.
    4. 공간 분석 | 주석 2D에 대한 부호 있는 거리를 선택하고 메시지가 표시되면 예를 누릅니다.
    5. 각 셀에 새 측정값을 추가하여 지정된 클래스의 가장 가까운 주석까지의 거리를 나타냅니다.
15. 수출 측정:
    1. 측정 | 감지 측정값을 표시하고 모든 감지의 모든 측정 목록이 나타날 때까지 기다립니다.
    2. 저장 버튼을 통해 테이블을 .txt으로 내보냅니다.
    3. 추가 분석을 위해 선택한 데이터 처리 소프트웨어로 데이터를 가져옵니다.

Results

이 방법을 사용하면 고정된 냉동 쥐 피부 절편에서 EdU Click-iT 화학과 IBEX를 결합하여 증식하는 세포 유형을 적절하게 검출할 수 있습니다. 증식 세포 유형의 검출은 다양한 방법론, 특히 Ki-67 항체로 증식 세포 유형을 라벨링하고 EdU Click-iT 화학 접근법을 사용하여 세포 증식을 검출하는 방법을 사용하여 비교되었습니다(그림 1). 우리는 Ki-67 항체 표지가 고정된 냉동 쥐 피부 절편에서 증식 세포의 수를 과소평가하는 반면(그림 1B,D), EdU 통합은 증식 세포의 수를 적절하게 반영하는 것을 관찰했습니다(그림 1A,C). EdU 통합에 의해 얻은 결과를 유세포 분석 결과(그림 1G

Discussion

세포 증식은 피부 복구의 네 가지 주요 단계 중 하나이며, 염증 단계와 증식기 사이의 전환은 성공적인 복구 과정에 매우 중요합니다²⁰. 장기간의 염증은 심각한 글로벌 건강 문제인 만성 상처로 이어질 수 있으므로 잘 조절된 면역 반응이 필수적입니다^1,21. 증식은 조직 복구뿐만 아니라 발암을 포함한 유기체 발달 및 질병 평가에도 중요한 핵심 생물학적 과정입니다. 세포 증식을 측정하기 위한 다양한 방법론이 존재하며, 세포 계수를 통해 간접적으로 또는 Ki-67 또는 DNA 통합 시약과 같은 마커를 사용한 면역 표지를 통해 직접 측정합니다. 진단 도구로 널리 사용되는 Ki-67 면역 표지는 암 환자의 진단 및 예후에 적용되는 Ki-67 표지 지수의 개발로 이어졌습니다 22,23,24.<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
항체와 시약들;	근원	식별자	코멘트
<강>항체
CD31 알렉사 플루어 647 (사이클 2)	바이오레전드	고양이#102516	1:100
AB_2161029
CD45 알렉사 플루어 488 (사이클 2)	바이오레전드	고양이#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (사이클 1)	바이오레전드	고양이#151212	1:50
AB_2814055
키-67 치킨 (ck)	LSBio	캣#LS-C772946	1:800
Ki-67 쥐 (rt)	바이오레전드	캣#652402	1:100
AB_11204254
뉴로필라멘트 H& M (NF-H/NF-M) 알렉사 플루어 647 (사이클 3)	바이오레전드	카탈로그#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (사이클 1)	세포 신호 전달 기술	Cat#8238  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; AB_10839265	1:1500
비멘틴 알렉사 플루어 488 (사이클 3)	바이오레전드	고양이#699305	1:100
AB_2888889
알렉사 플루어 647 당나귀 안티 래빗	잭슨 면역연구소	카탈로그#711-605-152
Reagentsnbsp;
셀비스 24웰 유리 바닥판	셀비스	P24-1.5 고북
크롬 알룸 젤라틴	신입 공급	카탈로그#1033A
Click-iT EdU 키트	써모피셔 사이언티브	C10637
호에슈트 33342	시그마-올드리치	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, 리튬 보로하이드라이드, 95%	써모피셔 사이언티브	고양이#10438443
티슈텍 O.C.T 컴파운드 사쿠라	바이오시스템즈 스위스	카탈로그 번호#7109-4583
PBS	써모피셔 사이언티브	카탈로그#10010-015
슈퍼프로스트 플러스 부착 현미경 슬라이드	에프레디아	고양이#J1800AMNZ
트리톤 X-100	시그마-올드리치	카탈로그#T8787
<스트롱>장비
헤어 브러시 & nbsp;	파우스트 AG	Cat#9172051와 9172050
미세절기 블레이드	바이오시스템즈 스위스	고양이#207500011
현미경	분자 장치, ImageXpress 공초점 HT.ai
오븐	써모피셔 사이언티브	고양이#HBMCR4220
로커 셰이커	에드먼드 비움르; 헤러 GmbH	캣#32310015