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방법 논문

종양 조직에서 자연적으로 방출된 엑소좀(Collection of Naturally Released Exosomes from Tumor Issue)

599 조회수

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DOI:

10.3791/67739

⸱

2025년 6월 10일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 종양 조직에서 엑소좀을 자연적으로 방출하고 반복적으로 수집하여 엑소좀을 추출하는 새로운 방법을 보여주며, 종양 발생에서 엑소좀의 기능을 연구하기 위한 실험적 기반을 제공합니다.

초록

엑소좀은 세포에서 분비되는 소포로서 다양한 핵산, 단백질, 지질을 둘러싸고 전달하며 서로 다른 세포 간의 소통에 참여합니다. 종양 미세환경의 엑소좀은 종양 세포의 생물학적 특성에 중요한 역할을 하며 다른 세포의 상태에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 종양 발생에서 엑소좀의 특정 기능을 추가로 연구하기 위해서는 종양 조직에서 엑소좀을 추출하고 분리하는 것이 당연히 필요합니다. 종양 조직에서 엑소좀을 직접 추출하면 체외 세포 배양의 필요성이 줄어들며, 종양 조직에서 추출한 엑소좀은 자연 상태의 엑소좀과 더 유사할 수 있습니다. 따라서 종양 조직에서 엑소좀의 자연 상태를 유지하는 것이 추출 과정의 핵심입니다. 효소 분해는 종양 조직에서 엑소좀을 추출하기 위해 초원심분리와 결합되는 경우가 많습니다. 여기에서는 종양 조직에서 엑소좀을 추출하는 새로운 방법을 제공합니다. 무혈청 배지를 사용하여 쉐이킹 테이블에서 작은 종양 조직 조각을 배양하고, 종양 조직에서 자연적으로 방출되는 엑소좀을 반복적으로 수집 및 추출하고, 추출된 엑소좀 구조, 농도 및 특성을 규명하여 종양 발생에서 엑소좀의 기능을 연구하는 연구자들에게 새로운 방법을 제공했습니다.

서론

엑소좀은 세포에서 분비되는 세포외 소포체의 아형으로, 일반적으로 30nm에서 200nm 사이입니다 1,2. 이들은 세포간 통신에 참여하여 핵산(예: 디옥시리보핵산(DNA), 전령 RNA(mRNA), 마이크로 리보핵산(miRNA), 긴 비암호화 RNA(lncRNA), 원형 RNA(circRNA)), 단백질 및 지질 1,3,4,5를 포함한 다양한 신호 분자를 수용 세포에 전달하여 수용 세포의 생리적 기능에 영향을 미칩니다 6,7. 엑소좀은 처음에 양의 망상적혈구8에서 확인되었으나 이후 혈액, 타액, 소변, 뇌척수액, 복수, 양수, 모유 등 다양한 체액에서 확인되었습니다 9,10,11,12,13,14,15,16 . 또한 엑소좀은 림프구, 대식세포, 비만세포, 지방세포, 종양세포 등 다양한 유형의 세포에서 분비될 수 있습니다17. 엑소좀은 광범위하게 분포하는 다양한 병리학적 과정, 특히 암과 배아 발달, 조직 복구 및 재생, 면역 조절을 포함한 다양한 생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다 18,19,20.

최근 몇 년 동안 엑소좀은 종양 발생, 침입, 전이, 화학요법 내성, 항종양 또는 전종양 면역을 촉진하는 것으로 나타났습니다 20,21,22. 암 유래 엑소좀은 수용체 또는 주변 암세포에서 유전자 발현을 활성화하여 생물학적 표현형을 변화시킬 수 있으며, 암세포는 종양 미세환경의 기질 세포와 상호 작용하여 암세포 증식, 침입 및 혈관 신생을 촉진할 수 있습니다 23,24,25. 종양세포에서 분비되는 엑소좀은 독성 약물을 배설하는 데 도움이 될 수 있으며, 기질세포 유래 엑소좀은 암세포의 형성을 촉진할 수 있습니다20. 암 유래 엑소좀은 암세포 전이의 다양한 단계에 관여하는데, 여기에는 주변 조직의 침입, 순환계를 통한 전달, 먼 장기로의 전이 등 다양합니다20. 마지막으로, 엑소좀은 암에서 운반하는 리간드, 단백질, miRNA에 따라 면역 활성화 기능과 면역 억제 기능을 모두 수행합니다20. 종양 조직 유래 엑소좀의 중요한 기능으로 인해 종양의 조기 진단, 정확한 치료 및 예후 모니터링에 잠재적으로 적용할 수 있는 가치가 있습니다21,22.

종양 조직 유래 엑소좀의 중요성을 감안하여 많은 연구자들이 그 특성과 기능을 추가로 연구하기 위해 엑소좀을 추출하려고 시도했습니다. 종양 조직에서 엑소좀을 직접 추출하면 체외 세포 배양의 필요성이 줄어들 뿐만 아니라 엑소좀의 자연 상태와 더 유사합니다. 따라서 종양 조직에서 엑소좀의 자연 상태를 유지하는 것이 추출 과정의 핵심입니다. 엑소좀의 물리적 특성은 일반적인 추출 방법의 기초이며, 추출 과정에서 자극으로 인한 엑소좀 성분의 변화는 거의 고려되지 않습니다. 실제로, 엑소좀의 품질은 다양한 엑소좀 추출 절차에 의해 큰 영향을 받습니다26,27. 현재 종양 조직은 효소에 의해 소화되고 밀도 구배 원심분리, 초원심분리, 한외여과, 크기 배제 크로마토그래피(SEC), 폴리머 침전, 면역친화성 크로마토그래피 및 미세유체 방법과 같은 방법을 거쳐 분리전에 2,21,28,29 . 여기에서는 종양 조직에서 엑소좀을 추출하는 방법을 제공합니다. 무혈청 배지를 사용하여 셰이커에서 작은 종양 조직 블록을 배양한 다음, 종양 조직에서 자연적으로 방출되는 엑소좀을 수집 및 추출하고 추출된 엑소좀의 농도와 특성을 확인함으로써 종양 발생에서 엑소좀의 기능을 연구하기 위한 기초 재료와 실험적 증거를 제공했습니다.

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프로토콜

모든 종양 조직 엑소좀 관련 실험은 관련 지침과 규정에 따라 진행되었습니다. 이 연구는 쓰촨대학교(20220301101) 화서병원 윤리위원회(Ethics Committee of West China Hospital, Sichuan University, )의 지침에 따라 승인되고 수행되었다. SGC-7901 세포를 접종한 지 4주 후, 나체 마우스 한 마리(BALB/c, 수컷, 8주령, 26g)를 자궁경부 탈구를 통해 안락사시켰다.

1. 종양 조직의 획득

  1. 75% 알코올에 5분 동안 담그십시오.
  2. 멸균 수술대로 이동하여 멸균 수술 용 가위를 사용하여 이소성 종양의 바깥 피부를 엽니 다.
  3. 이소성 종양 조직을 벗겨낸 다음 자르고 무게를 측정하여 같은 무게의 두 조각을 얻습니다.
    참고: 이 프로토콜에 따라 종양 조직 한 조각은 엑소좀 추출에 사용되고, 동일한 무게의 다른 종양 조직 조각은 효소 분해에 의한 엑소좀 추출에 사용됩니다30.

2. 종양 조직의 전처리

알림: 얼음 위와 멸균 환경에서 다음 단계를 수행하십시오.

  1. 예냉각된 PBS(Phosphate Buffer Saline) 10mL(0.01M)를 피펫으로 만들어 종양 조직을 세척하여 표면 혈액과 지방을 제거합니다.
  2. 10cm 멸균 페트리 접시에 2mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)이 포함된 20mL의 PBS에 안과 가위를 사용하여 종양 조직(~400mm3)을 1-2mm 조각으로 자릅니다. 위의 혼합물을 50mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.

3. 엑소좀의 방출

  1. 1.2 단계에서 튜브를 200 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리하십시오.
  2. 상등액을 버리고 펠릿을 α-MEM(Minimum Essential Medium α) 배지 20mL로 재현탁합니다. 37°C, 100rpm, 항온 쉐이커에서 1시간 동안 배양합니다.
  3. 200 × g 에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기.
  4. 상층액을 버리고 펠릿을 10mL의 α-MEM 배지로 재현탁합니다. 37°C, 100rpm, 항온 쉐이커에서 6시간 동안 배양합니다.
    참고: 모든 단계에서 부드럽게 진행하십시오. 짧은 배양과 α-MEM 배지로 한 번의 세척으로 세포 내 소포 및 소기관을 포함하여 절단으로 인해 누출되는 세포 내 구성 요소를 제거하기에 충분합니다.
  5. 200 × g 에서 5 분, 4 ° C 동안 원심 분리기를 원심 분리기하고 새 튜브에 상층액을 수집합니다.
  6. 10mL의 α-MEM 배지로 종양 조직을 재현탁합니다.
  7. 2.4단계부터 배양을 반복한 다음 2.5단계까지 반복합니다.
  8. 2.5 및 2.7 단계에서 수집 된 배지 상등액을 혼합합니다.
    참고: 모든 단계에서 부드럽게 진행하십시오. 두 번의 6h 배양은 종양 조직 조각에서 엑소좀의 자연 방출을 유도했습니다.

4. 초원심분리

  1. 0.45μm 미세 다공성 필터를 통해 상층액을 여과합니다.
  2. 상층액을 12,000 × g 에서 4 °C에서 30 분 동안 원심 분리하여 큰 소포를 제거합니다.
  3. 상층액을 새 튜브에 옮기고 120,000 × g 의 온도에서 4°C에서 90분 동안 원심분리하여 엑소좀을 수집합니다.
  4. 엑소좀 침전물을 PBS(0.01 M)로 세척한 후 다시 140,000 × g 에서 4°C에서 60분간 원심분리합니다.
  5. 침전된 엑소좀을 PBS(0.01M)에 현탁시켜 즉시 사용하거나 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 모든 단계에서 부드럽게 진행하십시오. 가능한 가장 작은 원심력과 가장 짧은 원심 시간으로 각 단계를 수행합니다.

5. 엑소좀 동정 결과 발표

  1. 투과전자현미경(TEM)30을 통해 종양 조직에서 엑소좀의 형태를 확인합니다.
  2. 나노입자 추적 분석(NTA)30을 통해 종양 조직에서 엑소좀의 크기와 농도를 측정합니다.
  3. 웨스턴 블롯(Western Blot, WB)30을 통해 엑소좀 단백질 마커 CD9 및 CD63을 식별합니다.
    참고: 엑소좀 마커의 기준으로 CD63, CD9를 사용하는 것을 포함한 엑소좀 연구에 대한 최근 지침31.

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결과

TEM은 이 방법을 통해 종양 조직에서 유래한 엑소좀이 전형적인 컵 모양의 구조를 가지고 있으며(그림 1A), 이 방법으로 추출한 엑소좀과 효소 분해로 추출한 엑소좀의 모양 사이에는 큰 차이가 없음을 밝혔습니다(그림 1B). NTA 결과 평균 엑소좀 직경은 172.8nm로 30-200nm 범위에 있으며 엑소좀의 크기와 일치하는 것으로 나타났습니다. 입자 농도는 5.9 × 106/mL였습니다(그림 1C). 효소 분해로 추출한 엑소좀의 평균 직경은 175.5nm였습니다. 입자 농도는 1.7 × 106/mL였습니다(그림 1D). WB 검사 결과, 종양 조직에서 유래한 엑소좀 표면에서 마커 단백질 CD9 및 CD63의 발현이 밝혀졌으며, 이는 엑소좀의 단백질 특성과 일치했습니다(

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토론

이 방법에서는 누드 마우스의 이소성 위암 조직에서 종양 조직에서 유래한 엑소좀을 추출했으며, 엑소좀의 방출, 삼출, 분리 및 정제가 핵심 단계였습니다. 엑소좀 2,21,28,29의 물리적 특성과 조성에 따라 다양한 엑소좀 분리 방법이 설계되고 검증되었으며, 각각 장단점이 있지만, 목적은 다양한 엑소좀 추출 절차가 엑소좀 특성 26,27에 미치는 영향을 최소화하는 것입니다. Thery 등은 엑소좀 분리를 위한 고전적인 초원심분리 방법을 처음 제안했으며,32 그 이후로 차등 초원심분리는 엑소좀 분리에...

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공개 사항

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 쓰촨성 과학기술지원프로그램(2024NSFSC0592, 2023YFS0064)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Anti-CD63 항체Biossbsm-43117M
Anti-CD9 항체Biossbs-2489R
원심분리기 튜브Thermo339650
항온 쉐이커ThermoMAXQ4450
일회용 멸균 피펫-10 mLJET
EDTABiosharpBS107
전기 피펫Thermo9501
수평 제어 온도 원심 분리기ThermoSorvall ST1R plus
나노 입자 추적 분석기MalvinNanoSight Pro
안과 가위JinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
포스포텅스텐 산   시그마455970-10G
외과 가위JinzhongJ21010
2 차 항체BiossBs-0295G염소 안티 토끼 IgG H & L/FITC
투과 전자 현미경NikonPlan Apo WF
초원심관Beckman355618
GSP01001

참고문헌

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