Profiling of Permethylated Mucin O-glycans Using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight 질량 분석기

요약

여기에서는 뮤신에서 O-글리칸을 방출하고 MALDI-TOF 질량 분석법을 사용한 후속 탈염, 과메틸화 및 분석에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

초록

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(MALDI-TOF MS)은 높은 감도와 처리량을 제공하는 뮤신 글라이칸 프로파일링을 위한 강력한 도구입니다. 여기에서는 MALDI-TOF MS를 사용하여 뮤신에서 O-linked Glycan을 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공하며, 여기에는 글라이칸 방출, 탈염, 과메틸화, 데이터 수집 및 분석이 포함됩니다. 이 연구는 이온 교환 크로마토그래피를 기반으로 한 탈염이 다공성 흑연화 탄소(PGC)를 사용한 고체상 추출에 비해 더 큰 글라이칸의 회수율을 개선하고 생성된 스펙트럼의 품질을 향상시킨다는 것을 보여줍니다. 또한, 이 연구는 시알릴화 구조의 효율적인 변형을 위해 현재 사용되는 것보다 더 긴 과메틸화 반응 시간이 필요할 수 있음을 시사합니다. 또한 글라이칸 조성 및 구조의 정확한 식별을 위한 단편화 데이터의 중요성과 필요성, 그리고 O-글라이칸 생합성 경로에 대한 사전 지식을 입증하고 뮤신 O-글라이칸 분석에서 MALDI-TOF가 제시하는 고유한 이점과 한계에 대해 논의합니다.

서론

뮤진은 점액의 구조적 구성 요소 대부분을 구성하는 큰 당단백질입니다. 그들은 배상 세포라고 하는 특수 상피 세포에 의해 생성되며 점막 표면에서 분비되기 전에 광범위한 O-글리코실화를 거칩니다. 뮤신의 당화(glycosylation)는 골지체(Golgi device)에서 일어나며, 여기서 특수한 글리코실전이효소(glycosyltransferase) 계열인 폴리펩타이드-N-아세틸갈락토사민 전이효소(ppGalNAc-T)는 GalNAc 잔기를 세린(Ser) 또는 트레오닌(^Thr)1에 부착하여 과정을 시작합니다. 그런 다음 글리코실전이효소는 갈락토오스(Gal), N-아세틸글루코사민(GlcNAc), GalNAc, N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac) 및 푸코스(Fuc) 잔기를 추가하여 글라이칸 구조를 확장하며, 다른 탄수화물 변형 효소는 글라이칸의 황화와 같은 반응을 수행할 수 있습니다¹. 뮤신 단백질 골격을 장식하는 글라이칸은 주로 Ser 및 Thr 잔기가 풍부한 단백질 영역의 클러스터에서 발견되며, 이러한 잔기의 측쇄에 있는 하이드록실기가 O-글리코실화 부위 역할을 하기 때문입니다. 이 조밀한 당화(glycosylation)는 점액에 "병 브러시(bottle-brush)"의 모양을 부여하며, 많은 양의 물을 보유하는 능력, 겔 형성 능력, 높은 점탄성과 같은 물리적 특성을 담당합니다 ^2,3. 이러한 특성으로 인해 뮤신은 윤활을 제공하고, 탈수 및 신체적 부상으로부터 상피를 보호하며, 상피와 상피의 미세환경 사이에 물리적 장벽을 형성합니다 ^4,5. 뮤신 글리칸은 또한 공생 또는 병원성 박테리아의 결합 부위 및 탄소원 역할을 할 수 있습니다 ^6,7,8. 점액의 조직과 구성은 미생물을 상피 표면에 가까이 두지 않고 멀리함으로써 상피를 보호하는 데 중요한 역할을 합니다. 뮤신 글라이칸은 또한 세포-세포 통신 및 접착에 참여합니다⁹.

뮤신 글리칸은 점막 항상성을 유지하는 데 중추적인 역할을 하며, 비정상적인 뮤신 글리코실화 프로파일은 장벽 기능 손상, 미생물 구성 변화, 종양 전이 증가, 염증성 장 질환(IBD) 및 기타 질병과 관련이 있습니다 10,11,12. 따라서 뮤신 글리코실화(mucin glycosylation)에 대한 연구는 인체 건강에서 점액과 뮤신의 역할을 이해하는 데 중요하며 질병 관리 또는 치료에 대한 새로운 접근 방식으로 이어질 수 있습니다.

질량 분석 기반 기술은 뮤신 글라이칸을 연구하는 데 가장 널리 사용되는 옵션 중 하나입니다. MALDI-TOF MS는 글리칸 및 당단백질과 같은 큰 비휘발성 생체 분자를 분석할 수 있는 소프트 이온화 기술입니다¹³. 이 접근법은 높은 감도와 넓은 질량 범위를 제공하여 풍부하지 않고 다양한 글라이칸 혼합물을 검출하고 식별할 수 있습니다. 또한 탠덤 질량 분석법(MS/MS) 실험에서 얻은 단편화 패턴은 글라이칸 조성 및 염기서열¹³에 대한 귀중한 구조 정보를 제공할 수 있습니다.

일반적으로 MALDI-TOF MS에 의한 뮤신의 O-결합 글라이칸 분석에는 다단계 워크플로우가 포함되며, 여기서 O-글리칸은 먼저 환원적 β제거와 같은 방법을 사용하여 단백질 골격에서 화학적으로 방출된 다음 화학적 방출에서 염을 제거하기 위해 탈염되고 이온화 및 검출을 향상시키기 위해 유도체화됩니다. 그런 다음 정제되고 유도체화된 글라이칸을 MALDI 타겟 플레이트에서 적절한 MALDI 매트릭스와 함께 공동 결정화하고 온전한 글라이칸 이온의 질량에 대한 정보를 제공하는 질량 스펙트럼을 획득합니다. 그 후, MS/MS 실험에서 글라이칸을 단편화하여 글라이칸¹⁴의 구조에 대한 정보를 생성합니다. 여기에서는 글라이칸의 방출, 탈염 및 과메틸화 글리칸을 MALDI-TOF MS로 분석하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

프로토콜

참고: 그림 1 에서 워크플로우의 개략도를 참조하십시오.

그림 1: 실험 워크플로우의 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 글라이칸 방출

1. β-제거 버퍼의 준비
   참고: 매번 사용하기 전에 신선하게 준비해야 합니다.
   1. 수산화나트륨(NaOH) 펠릿의 무게를 측정하고 50mL 튜브에 적절한 양의 H₂O에 용해시켜 0.1M 용액을 얻습니다.
   2. 5mL 튜브에 189mg의 수소화붕소나트륨(NaBH₄)을 1.1.1단계에서 위에서 제조한 알칼리 용액 5mL에 용해시킵니다.
      주의 : NaOH는 부식성이고 NaBH₄ 는 부식성, 독성, 가연성이며 건강에 해를 끼칩니다. 두 화학 물질 모두 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 흄 찬장 아래에서 취급해야 합니다. NaBH₄ 는 자체 발화 할 수있는 수소를 분해하고 방출하므로 H₂O에 직접 용해시키지 마십시오.
2. β-제거 반응 설정
   1. 4mL 유리 바이알에 최대 100μg의 정제된 뮤신을 250μL의 H₂O에 용해시킵니다.
      알림: 일부 뮤신은 완전히 용해되지 않고 대신 매우 작은 입자의 현탁액을 형성할 수 있습니다.
   2. β제거 완충액 250μL를 추가하고 PTFE 라이닝 캡으로 바이알을 단단히 닫습니다. 45 ^oC에서 16 시간 동안 반응을 배양하십시오.
3. 반응 중지
   1. 100mL 유리병에 95mL의 H₂O(5%(v/v) 농도)에 5mL의 빙초산을 추가합니다.
      알림: 실온에서 보관하고 재사용할 수 있습니다.  주의 : 아세트산은 가연성 및 부식성이므로 필요한 개인 보호 장비와 함께 흄 찬장에서 사용해야 합니다.
   2. 얼음 위에 5% 아세트산 용액 1mL를 각 반응(단계 1.2.3)에 적가합니다. 이 시점에서 NaBH₄ 의 과잉으로 인한 수소 방출로 인한 발포성을 찾으십시오. 1mL의 5% 아세트산을 첨가한 후에도 거품이 멈추지 않으면 이 단계를 반복합니다.
      참고: 5% 아세트산 첨가 시 발포성이 없으면 β제거 반응이 불완전하거나 실패할 수 있습니다.
4. 시료의 탈염
   1. 100mL 유리병에 5%(v/v) 아세트산에 200-400메시의 양이온 교환 수지, H⁺ 형태의 조밀한 현탁액을 준비합니다.
   2. 유리 피펫에 소량의 유리솜을 꽂습니다. 수지 현탁액 1.5mL를 위에서 유리 피펫에 넣고 침전시켜 물기를 뺍니다. 이것은 탈염 컬럼을 만들 것입니다.
   3. 2mL의 5% 아세트산으로 수지를 세척합니다. 플로우스루를 폐기합니다.
   4. 점액 샘플을 탈염 컬럼에 추가합니다. 5mL 튜브에 플로우스루를 수집합니다.
   5. 샘플 바이알을 1mL의 5% 아세트산으로 헹구고 이를 탈염 컬럼에 로드합니다. 동일한 튜브에 플로우스루를 수집합니다.
   6. 컬럼을 5% 아세트산 1mL로 2x 세척합니다. 동일한 튜브에 플로우스루를 수집합니다.
   7. 원심 증발기를 사용하여 아세트산을 제거하고 샘플을 농축합니다(5mbar, 30 ^oC, 2 h).
   8. 샘플을 -80 ^oC에서 동결하고 동결 건조기에서 밤새 건조시킵니다.
      참고: 또는 원심 증발이 계속 건조될 수 있지만 샘플을 다시 용해하는 것이 더 어려워집니다.
   9. 100mL 유리병에 95mL의 메탄올(5%(v/v) 농도)에 5mL의 아세트산을 추가합니다.
      주의 : 메탄올은 가연성이며 독성이 있습니다. 필요한 개인 보호 장비와 함께 흄 캐비닛에서 사용해야 합니다.
   10. 샘플을 0.5mL의 메탄올 아세트산에 용해시키고 질소 흐름에서 샘플을 건조시킵니다. 이 단계를 3-5회 반복합니다. 건조된 샘플을 4 ^°C에서보관하십시오.
5. 글라이칸의 과메틸화
   1. 8mL 유리 바이알에 50% NaOH 용액(0.2mL)과 0.4mL의 메탄올을 완전히 혼합하고 와류를 일궈냅니다. 흰색 침전물이 형성되어 빠르게 다시 용해됩니다.
   2. 유리 주사기를 사용하여 무수 디메틸 설폭사이드(DMSO) 4mL를 넣고 와류를 완전히 넣습니다.
   3. 용액을 2,000 × g에서 2분 동안 원심분리합니다. 이것은 튜브 바닥에 겔을 형성하고 중간에 액상을 형성하며 상단에 염을 축적합니다.
   4. 겔을 방해하지 않고 상등액과 염을 조심스럽게 기울입니다.
   5. 더 이상 염이 형성되지 않을 때까지 1.5.2-1.5.4 단계를 5x 반복합니다. 염이 튜브 벽에 달라붙으면 튜브를 부드럽게 소용돌이쳐 바닥의 젤을 방해하지 않고 염을 현탁액으로 가져오거나 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 제거합니다.
   6. 더 이상 염이 형성되지 않으면 무수 DMSO 4mL에 겔을 재현탁합니다. 이 현탁액은 과메틸화 염기입니다.
      참고: 이 양의 과메틸화 염기는 ~25개의 샘플에 충분합니다. 그에 따라 수량을 조정할 수 있습니다.
   7. 건조된 샘플에 100μL의 무수 DMSO와 150μL의 과메틸화 염기를 추가합니다. 유리 피펫을 사용하여 가능한 한 빨리 80μL의 요오도메탄을 첨가하여 환경으로부터 수분을 흡수하지 않도록 합니다.
      주의 : 요오도메탄은 독성이 있으며 건강 및 환경 위험을 초래합니다. 필요한 개인 보호 장비와 함께 흄 캐비닛에서 사용해야 합니다.
   8. 과메틸화 반응을 실온에서 30분 동안 격렬하게 흔들어 배양합니다.
   9. 0.5mL의_H2O를 첨가하여 반응을 종료합니다. 샘플이 흐려집니다.
      참고: 샘플이 흐려지지 않으면 과메틸화 반응이 불완전했을 수 있습니다.
   10. 투명해질 때까지 샘플을 질소로 세척합니다.
   11. HLB(Hydrophilic-Lipophilic-Balanced) 96웰 추출 플레이트(60mg) 또는 HLB 카트리지에 샘플을 로드합니다. 양압을 가하여 ~1mL/분의 유속으로 고체상을 통해 샘플을 밀어 넣습니다. HLB 카트리지를 사용하는 경우 고무 젖꼭지 또는 진공 매니폴드를 사용하여 샘플에 압력을 가합니다. 플로우스루를 폐기합니다.
   12. 2 x 1 mL의 H₂O로 웰을 세척합니다. 양압을 가하고 플로우 스루를 버리십시오.
   13. 1mL의 메탄올을 사용하여 HLB 플레이트에서 글라이칸을 용리합니다. 압력을 가하는 것은 플레이트에서 메탄올이 나오기 시작할 때까지만 이루어집니다. 그런 다음, 중력 흐름은 필요한 유속을 제공하기에 충분합니다. 플로우스루를 수집합니다.
   14. 용리 단계를 한 번 더 반복합니다.
   15. 원심 증발기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다.
   16. 4mL 유리 바이알에 1mL의 아세토니트릴, 998μL의 H₂O 및 2μL의 트리플루오로아세트산을 혼합하여 TA50 버퍼를 준비합니다.
       주의: 아세토니트릴은 가연성이며 트리플루오로아세트산은 부식성입니다. 둘 다 적절한 개인 보호 장비를 사용하여 연기 찬장에서 사용해야 합니다.
   17. 마이크로 원심분리기 튜브에서 10mg의 슈퍼 DHB[2,5-디하이드록시 벤조산과 2-하이드록시-5-메톡시벤조산의 9:1(w/w) 혼합물]을 TA50 1mL에 용해시켜 매트릭스 용액을 준비합니다.
   18. 건조된 샘플을 10μL의 TA50에 용해시킵니다.
   19. 시료 1μL와 매트릭스 용액 1μL를 혼합하여 강철 MALDI 타겟 플레이트에 놓고 건조시킵니다.

2. 샘플의 MALDI TOF 분석

1. 모이온 데이터를 획득하기 위한 설정
   1. 50% 강도로 레이저를 1,000발 발사합니다.
      참고: 이는 전체 기기 설정에 따라 달라질 수 있으며 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
   2. Laser carrier(레이저 캐리어) 탭에서 random walk(랜덤 워크) 설정을 complete sample(샘플 완료)로 설정합니다.
   3. Detection 탭에서 질량 범위를 500 - 3,000으로 설정합니다. 2,500-3,000m/z에서 강한 피크가 관찰되면 이 범위를 늘리십시오. 디텍터 게인을 20x로 설정합니다.
      알림: 게인은 기기의 전역 설정에 따라 달라질 수 있으며 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
   4. Spectrometer 탭에서 polarity를 positive로 설정하고 Matrix Suppression을 Deflection, 300 Da로 설정합니다.
   5. 시작 | 데이터 수집이 완료되면 다른 이름으로 저장하여 적절한 디렉토리에 데이터를 저장합니다.
2. 부모 스펙트럼을 열어 단편화 스펙트럼 획득
   1. 스펙트럼을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 Find Mass list를 선택합니다.
   2. 생성된 목록에서 단편화를 위한 관련 이온 을 선택하고 선택한 피크를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 후 MS/MS 목록에 추가를 클릭합니다.
   3. 질량 목록을 다시 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 MS/MS 목록을 선택합니다.
   4. Send to flexControl(flexControl로 보내기)을 클릭합니다.
   5. flexControl에서 LIFT 메소드를 로드하고 LIFT 탭으로 이동합니다.
   6. 로드된 각 피크를 하나씩 선택하고 Parent 모드와 Fragments 모드 사이를 전환하여 Parent 및 Fragments 이온을 모두 획득합니다. 필요에 따라 레이저 강도 와 촬영 컷수를 조정합니다. Save 를 클릭하여 각 부모 이온의 단편화 후 데이터를 저장합니다.
   7. 스펙트럼을 '.ascII' 형식으로 내보냅니다.
      참고: 나중에 추가 분석을 위해 Glycoworkbench로 가져올 수 있습니다.
3. glycoworkbench를 사용한 데이터 분석
   1. Glycoworkbench에서 질량 스펙트럼의 내보낸 .ascII 파일을 로드하고 피크 중심을 계산하기 전에 창 하단의 관련 버튼을 사용하여 기준선 보정 및 노이즈 필터링을 수행합니다. 팝업 창에서 적절한 질량 범위, 최소 신호/잡음 비율 및 최소 MS 피크 강도를 선택합니다.
   2. 피크 중심이 계산되면 Glyco-Peakfinder 도구를 사용하여 피크 목록과 일치하는 구조 조성을 찾습니다. derivatization(유도체화)으로 perMe를 선택하고, redEnd(감소)를 Reducing End(환원 말단)로, 예상되는 잔기의 최소 및 최대 수를 선택합니다.
      1. 뮤신의 경우 Hexose, N-Acetyl-Hexosamine, Deoxy-Hexose 및 N-Acetyl-Neuraminic acid를 선택합니다. 황산화 글라이칸의 경우 질량이 87.9인 다른 잔류물 옵션을 사용합니다. MALDI-TOF 데이터의 경우 Max # Na ions를 설정하고 Max # 전하를 1로 설정하고 정확도를 0.5Da로 설정합니다.
         참고: 질량 분석기의 교정에 따라 정확도를 더 높여야 할 수도 있습니다.
   3. Control 키를 누른 상태에서 각 주석을 클릭하여 올바른 주석을 모두 선택합니다. 그런 다음 주석을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 Add to the annotated peak list를 클릭합니다.
   4. 주석이 추가된 여러 스펙트럼을 비교하는 보고서를 생성하려면 도구 탭의 보고서에서 서로 다른 프로필을 비교하는 보고서 생성을 선택합니다. 보고서를 PDF로 인쇄하여 저장합니다.
   5. 글라이칸 피크를 식별한 후 각 개별 구조의 상대적 존재도를 모든 글라이칸 피크의 곡선 아래 전체 면적에 대한 백분율로 계산합니다.
   6. 단편화 스펙트럼 분석을 위해 스펙트럼을 Glycoworkbench에 로드하고 2.3.1단계와 같이 피크 목록을 생성합니다.
   7. 주석이 달린 글라이칸 조성에 해당하는 추정 글라이칸 구조를 그립니다. Fragments 도구에서 관련 compute fragments 옵션을 선택하여 그려진 각 구조에 대한 조각을 생성합니다. 그런 다음 모든 조각을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 Copy fragments into canvas(캔버스에 조각 복사)를 클릭합니다.
   8. 단편화 분석을 추가로 지원하려면 스펙트럼 뷰어에서 관심 피크를 클릭하여 선택하십시오. 다음으로, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 Find all structures matching the peaks(피크와 일치하는 모든 구조 찾기)를 선택하여 추정 글라이칸 구조에 대한 온라인 데이터베이스와 비교하여 선택한 피크의 m/z를 조사합니다.
   9. 관심 있는 추정 구조를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 적절한 옵션을 선택한 후 소프트웨어의 캔버스 창에 복사합니다.
   10. 각 글라이칸 구조에서 생성할 수 있는 가능한 단편을 계산하려면 캔버스에서 관심 있는 구조를 선택한 다음 도구 탭에서 현재 구조에 대한 단편(Fragments ) 및 단편 계산(Compute fragments)을 선택합니다.
   11. 둘 이상의 글라이칸 구조에 대한 단편이 계산된 경우 Fragments table(단편화 테이블) 보기 아래의 요약 탭에서 비교 표를 확인합니다.
   12. 각 잠재적 글라이칸 구조에 대한 피크 목록과 일치하는 단편을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼 클릭 드롭다운 메뉴에서 Copy fragments to canvas(캔버스에 단편 복사 )를 선택합니다.
   13. Tools( 도구 ) 탭의 프로파일러(profiler)에서 annotate peaks with all structures(모든 구조로 peaks 주석) 를 선택한 다음 Tools(도구) | 리포팅 | 주석에 대한 보고서를 만듭니다. 보고서를 PDF로 인쇄하여 저장합니다.

결과

다음 결과에서는 돼지 위 점액(PGM)을 사용하여 탈염 및 과메틸화 단계를 최적화했습니다. 일반적으로 사용되는 두 가지 탈염 방법을 비교하기 위해, 글라이칸 방출 후 시료를 양이온 교환(위의 프로토콜에 설명된 대로) 및 붕산염과 메탄올의 동시 증발 또는 다공성 흑연화 탄소(PGC) 카트리지를 사용한 고체상 추출에 의해 탈염했습니다. 이를 위해서는 80% 아세토니트릴 및 100% H₂O로 카트리지를 사전 컨디셔닝하고, 0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용한 세척 단계, 0.1% TFA에 25% 아세토니트릴 2mL, 0.1% TFA에 50% 아세토니트릴 2mL, 0.1% TFA에 80% 아세토니트릴 2mL를 사용한 글라이칸 용출이 필요합니다.

과메틸화 후 생성된 스펙트럼은 m/z 500 - m/z 2,500 범위에서 분석되었습니다. 이온 교환 및 붕산염 제거에 의해 탈염된 샘플에서 총 33개의 글라이칸 구조가 확인되었으며, PGC 추출에 의해 탈염된 샘플에서는 32개의 구조가 확인되었습니다(그림 2A). PGC 탈염 샘플에서 하나의 글라이칸 구조가 확인되지 않았습니다( 그림 2A에서 별표로 표시). 이 비교 분석은 PGC 추출 후 더 큰 글라이칸의 회수가 이온 교환에 비해 효율적이지 않다는 것을 보여주었습니다. 이는 또한 PGC 추출 후 총 글라이칸의 21%를 차지하는 더 큰 글라이칸의 상대적 풍부함에 의해 입증되는 반면, 이온 교환의 경우 31%를 차지합니다. 또한 이온 교환 및 붕산염 제거에 의한 탈염은 PGC를 사용한 고체상 추출에 의한 탈염 후 생성된 스펙트럼에 비해 신호 대 잡음비가 증가한 스펙트럼을 생성했습니다(그림 2B).

과메틸화 반응 시간을 최적화하기 위해, 동일한 과메틸화 반응의 분취액을 상이한 시점(즉, 5분, 30분 또는 90분)에서_H2O를 첨가하여 담금질하였다. 그 결과, 30분 또는 90분 동안 퍼메틸화된 샘플에서 m/z 500 - m/z 2,500 범위에서 33개의 글라이칸 피크를 식별할 수 있었으며, 결과 스펙트럼은 유사했습니다. 대조적으로, 과메틸화가 5분 동안 수행되었을 때 31개의 글라이칸 피크만 식별할 수 있었습니다(그림 3). 흥미롭게도, 이 짧은 반응 시간에서 확인되지 않은 두 구조( 그림 3에서 별표로 표시)는 두 개의 시알릴화 구조이며, 이는 테스트된 조건에서 시알산의 변형이 5분 이내에 효율적이지 않음을 시사합니다.

글라이칸 조성을 확인하고 글라이칸 구조를 결정하기 위해 각 PGM 글라이칸 피크에 대해 단편화를 사용했습니다. 여기에는 두 가지 예가 나와 있습니다(그림 4). 그림 4A에서는 983m/z에서 피크의 단편화 스펙트럼이 표시됩니다. 글라이칸 조성은 HexNAc₂Hex₂ 로 할당됩니다. 이 글라이칸 조성에는 Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc(글라이칸 1) 또는 Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc(글라이칸 2)의 두 가지 잠재적 구조가 있습니다. 이 화합물의 단편화는 글라이칸의 다른 단편에 할당할 수 있는 피크를 가진 질량 스펙트럼을 생성했습니다. m/z 529에서의 피크와 m/z 708에서의 피크는 각각 구조 1과 2의 특징이며, PGM 글라이칸 혼합물에 글라이칸 1과 2가 모두 존재한다는 결론을 내릴 수 있습니다.

그림 4B에는 m/z 2,026에서 피크의 단편화 스펙트럼이 나와 있습니다. Glycoworkbench는 이 피크에 대한 두 가지 잠재적 글라이칸 조성, 즉 Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ 및 Hex₃HexNAc₄dHex₂를 계산했습니다. 시알릴화된 조성물은 정확도가 낮으므로(각각 ~160ppm 및 178ppm) 첫 번째 것이 올바른 선택이어야 함을 시사합니다. 그러나 단편화 프로파일은 Neu5Ac가 아닌 Fuc의 존재를 나타냅니다. 따라서 두 번째 구성이 올바른 구성입니다. 여기에서는 4개의 추정 글라이칸 구조가 제시되며, 스펙트럼에는 각 추정 글라이칸 구조에서 계산된 단편으로 주석이 달렸습니다. 주석이 달린 스펙트럼에서 글라이칸 4와 6의 특징적인 피크만 존재하는 반면, 글라이칸 3과 5의 특징적인 피크는 확인되지 않았음을 알 수 있습니다. 이러한 데이터를 바탕으로 글라이칸 4와 6이 존재한다는 결론을 내릴 수 있습니다.

그림 2: 탈염 및 고체상 추출에 따른 글라이칸 피크 비교. (A) 양이온 교환 크로마토그래피 및 붕산염 제거 또는 PGC 고체상 추출에 의한 탈염 후 PGM 글라이칸 프로파일의 비교. (B) 식별된 각 글라이칸 피크에 대한 결과 신호 대 잡음비에서 두 가지 탈염 접근법의 비교. 별표는 양이온 교환 및 붕산염 제거에 의해 탈염된 샘플에서만 확인된 글라이칸을 지정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 5분, 30분 또는 90분 동안 과메틸화 후 PGM 글라이칸 프로필 비교. 별표는 과메틸화 30분 또는 90분 후에만 확인된 시알릴화 글라이칸을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: PGM 글라이칸의 단편화 스펙트럼의 예. (A) m/z 983에서 글라이칸 피크의 단편화. (B) m/z 2026에서 글라이칸 피크의 단편화. 상자는 잠재적인 글라이칸 구조를 나타냅니다. 단편 위의 숫자는 어떤 글리칸 구조에서 파생될 수 있는지를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

글라이칸을 연구하기 위해 연구자들은 특정 에피토프를 식별하기 위한 렉틴 사용부터 보다 정교한 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석법(LC-MS) 및 핵 자기 공명(NMR)에 이르기까지 다양한 방법론을 사용하여 글라이칸 구조의 상세한 특성을 파악합니다. 대안적인 접근법에 비해 MALDI-TOF MS의 주요 장점은 방법¹³의 감도와 고처리량 특성입니다. 그러나 동중원소 화합물을 분리할 수 있는 능력이 없기 때문에 동일한 m/z 값을 가진 다른 글라이칸 구조는 MS/MS 아래에서 단편 혼합물을 생성하며, 이는 디콘볼루션하기 어렵습니다¹³. 뮤신 글라이칸의 정확한 구조를 측정해야 하는 경우 LC-MS를 선택해야 합니다.

여기에서는 글라이칸 방출, 탈염 및 과메틸화에서 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 공정의 모든 중요한 단계를 포함하는 MALDI-TOF MS에 의한 뮤신 글라이칸 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 단계는 서로 다른 접근 방식을 사용하여 수행할 수 있으며 모두 관련 이점과 제한 사항이 있다는 점을 인식하는 것이 중요합니다.

이 프로토콜에서는 환원적 β제거법을 사용하여 글라이칸을 방출했습니다. 반응은 기본 조건에서 발생합니다. 뮤신 샘플이 이미 현탁액이고 이전에 정제되지 않은 경우 pH 지시 용지를 사용하여 pH를 확인해야 합니다. 산성인 경우 pH를 ~8-9로 높여야 합니다. 이 접근법의 한계는 글리칸의 방출에 필요한 기본 조건이 가수분해로 이어지고, 따라서 비누화로 알려진 반응에서 시알산에서 자주 발견되는 O-아세틸 기의 손실로 이어진다는 것입니다.

글리칸^15,16,17,18의 방출에 대한 다른 방법이 문헌에 설명되어 있지만, 그 중 일부는 불안정한 O-아세틸기를 보존할 수 있지만, 환원적 β-제거는 이 분야의 황금 표준으로 남아 있습니다. 이 접근 방식에는 고농도의 염이 필요합니다. 그런 다음 염 및 기타 이온 억제 오염 물질은 글라이칸의 이온화 효율 및 정량화에 영향을 미칠 수 있으므로 MALDI-TOF 분석¹⁹ 전에 제거해야 합니다. 여기서, 메탄올 증발에 의한 붕산염 제거 후 양이온 교환 크로마토그래피는 뮤신에서 방출된 글라이칸을 탈염하는 가장 효율적인 방법인 것으로 나타났습니다. 이 경우 글라이칸은 수지와 상호 작용하지 않고 대신 수지를 통해 흐르는 반면 나트륨 이온은 수지에 갇히게 됩니다. 그러나 이온 교환 컬럼의 준비는 힘들고 이 접근 방식은 수많은 샘플을 사용한 대규모 실험에서 비효율적입니다. 이러한 경우, PGC 탈염이 선호될 수 있는데, 이 수지는 96웰 플레이트 형식으로도 이용 가능하기 때문이다. 그러나 위에서 제시한 바와 같이 PGC 추출에 의한 탈염은 특히 더 큰 글라이칸의 경우 비효율적인 용출로 이어질 수 있으므로 결과를 해석할 때 이를 고려해야 합니다.

천연 글라이칸도 MALDI-TOF로 분석할 수 있지만, 천연 글라이칸은 이온화 효율이 낮기 때문에 이 반응이 검출 감도를 크게 증가시키기 때문에 일반적으로 과메틸화가 사용됩니다²⁰. 또한, 과메틸화는 황산화 또는 시알릴화 글라이칸과 같은 음전하를 띤 글라이칸을 양성 모드에서 더 쉽게 검출할 수 있도록 하고 시알산(sialic acids) 또는 푸코스(fucose)와 같은 불안정한 글라이칸 에피토프(binary)를 보존합니다²⁰. 가장 일반적으로 과메틸화는 5-10분 동안 실행될 수 있으며,^14,21, 일부 보고서에서는 반응이 최대 40분²²까지 계속될 수 있습니다. 여기서, 우리는 테스트된 조건에서 시알릴화 글리칸이 과메틸화 5분 후에 효율적으로 검출되지 않았으며 더 긴 배양이 필요함을 보여주었습니다.

반응 시간 외에도 과메틸화 효율에 영향을 줄 수 있는 또 다른 요인은 반응 중 물의 함량입니다. 물의 존재는 글리칸의 언더메틸화 또는 부분적 메틸화로 이어질 수 있으며, 모든 하이드록실기가 메틸기로 전환된 것은 아닙니다²³. 이것은 마치 언더메틸화가 발생한 것처럼 쉽게 결정할 수 있으며, 질량 스펙트럼에서 14Da(하이드록실과 메틸 그룹 간의 질량 차이)만큼 다른 피크 그룹을 관찰할 수 있습니다. 이 문제는 과메틸화 반응을 반복하고 데이터를 다시 분석하여 해결할 수 있습니다.

글라이칸 분석의 제한 요인은 스펙트럼의 해석입니다. 최근의 발전에도 불구하고 이 프로세스는 여전히 대부분 수작업으로 이루어지며 스펙트럼에 정확하게 주석을 달기 위해서는 글라이칸 생합성 경로에 대한 충분한 지식과 이해가 필요합니다. Glycoworkbench²⁴ 와 같은 도구는 가능한 주석, 글라이칸 구조 및 조성을 제공하여 도움을 줄 수 있지만, 글리칸 혼합물의 고유한 이질성으로 인해 연구자들은 여전히 어떤 선택이 올바른 선택인지 결정을 내려야 합니다. PGM을 사용하여 위에 제시된 예에서 Glycoworkbench는 mz 2,025.7620에서 피크에 대해 두 가지 잠재적인 글라이칸 조성을 제공했으며, 단편화 프로파일을 기반으로 시알릴화된 구조가 아닌 푸코실화된 구조가 존재한다는 결론을 내렸습니다. 그러나 단편화 스펙트럼을 사용할 수 없는 경우(종종 풍부 글라이칸이 적은 경우) 연구자들은 Hex3HexNAc1Neu5Ac3 조성을 가진 글라이칸이 뮤신이 아닌 강글리오사이드에서 발견된다는 지식에 근거하여 주석을 작성할 수 있으므로 이 옵션을 PGM의 맥락에서 고려해서는 안 됩니다. 따라서 확인된 글라이칸 구조 또는 조성은 이전 간행물과 상호 참조되어야 하며 O-글리칸 생합성의 원리에 동의해야 합니다. 전반적으로 이 프로토콜은 특히 당생물학 분야를 처음 접하고 점막 계면에서 발생하는 상호 작용 연구에 관심이 있는 연구자에게 귀중한 리소스 역할을 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
150mm 유리 파스퇴르 피펫	피셔 사이언티브	15202699	소비재 텍스트 내 참고 문헌(해당 시): 유리 피펫
5 mL 튜브	에펜도르프	30122305	소모품
96웰 HLB 추출판	피셔 사이언티브	16553290	소모품
아세트산	시그마-올드리치	A6283	시약
아세토니트릴	피셔 사이언티브	15624520	시약
무수성 DMSO	시그마-올드리치	5.89569	시약
무수 메탄올	시그마-올드리치	5.89596	시약
오토플렉스 질량분석기	브루커		설비
DOWEX 50w x8 수지, H+ 형태, 200-400 메시	시그마-올드리치	44519	시약 본문 내 참고문헌(해당되는 경우): 양이온 교환 수지
드라이 블록 히터	시	QBD2	설비
블록 히터용 증발기/집중기	콜-팔머	WZ-36610-99	설비
flexAnalysis	브루커		소프트웨어, 독점 및 nbsp;
flexControl	브루커		소프트웨어, 독점 및 nbsp;
제네박 EZ-2	바이오제약	EZ-2	장비 본문 참조(해당되는 경우): 원심 증발기
PTFE 캡이 맞는 유리 바이알 (4 mL)	휘튼	DWKW224582-144EA	소모품
유리 바이알과 일치하는 PTFE 캡(8 mL)	피셔 사이언티브	11587413	소모품
유리울	수펠코	1.04086	소모품
글리코워크벤치	NA		소프트웨어; https://glycoworkbench.software.informer.com/ 에서 다운로드 가능
HLB SPE 탄환	수펠코	57493-U	96웰 HLB 추출판의 대안으로 소모품
요오도메탄	시그마-올드리치	289566	시약
MALDI 표적 판	브루커		설비
ModulyoD 동결건조기	써모피셔	모듈리오D-230	장비 본문 내 참고 사항(해당 시): 동결 건조기
NaBH4	시그마-올드리치	452882	시약
NaOH 펠릿	시그마-올드리치	567530	시약
NaOH 용액 50%	시그마-올드리치	415413	시약
양압-96 프로세서	바다	186006961	설비
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