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방법 논문

Stable Isotope In-Vivo Labeling for Mass-Spectrometry Identification of Paternal Metabol Ites Transport to Spermation During fertilization (수정 중 정자에서 난모세포로 전달된 부계 대사산물의 질량 분광법 식별을 위한 안정 동위원소 생체 내 라벨링)

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/67765

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2025년 6월 17일

 ,  ,  ,  , 
1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

이 논문에서

요약

이 절차는 2H2O 또는 U13C 포도당으로 안정 동위원소 표지를 사용하여 수정 중에 정자에서 난모세포로 전달되는 대사 산물을 확인한 후 대사체 분석을 수행하는 것을 목표로 합니다. 중수소 표지 된 씨수말은 표지되지 않은 댐과 짝짓기를 합니다. 수집된 착상 전 배아는 질량 분석법으로 분석하여 모계(비중수소화된) 대사 산물에서 부계(중수소화된) 대사 산물을 분류합니다.

초록

배아 유전학에 대한 부계의 기여는 지금까지 수십 년 동안 대립유전자 염기서열에 국한되어 왔습니다. 대신, 10년간의 결과는 후성유전학적 요인들(DNA 메틸화, 히스톤 변형, 염색체 조직, 조절 RNAs)이 부계 유전에서 중요한 역할을 하고 배아 발달과 접합자 유전자 발현에 영향을 미친다는 것을 시사한다. 핵산과 함께 정자 대사체(지질, 탄수화물, 유리 아미노산)는 후성유전학적 신호로 작용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 질량 분석법을 통해 정자에서 난모세포로 전달된 대사 산물을 식별하는 것을 목표로 합니다. 이 절차에는 2H2O 또는 U13C 포도당을 가진 정자 세포의 안정 동위원소 라벨링이 포함되어 대사체학을 통해 수정 중 난모세포로 전달된 부계 대사 산물을 추적합니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 신진대사장애에 대한 자손의 감수성에서 부계 정자 대사체의 역할을 밝히는 것이며, 식단 및 오염 물질에 대한 노출과 같은 환경 조건이 부계의 대사 메시지를 어떻게 변화시켜 자손의 건강과 당뇨병, 비만 및 심혈관 질환에 대한 경향에 잠재적으로 영향을 미치는지에 대한 통찰력을 제공하기 위해 조정될 수 있습니다.

서론

부계 후성유전체(paternal epigenome)는 신진대사장애에 대한 자손의 감수성에 영향을 미친다
배아 발달 과정에서 엄마가 착취하는 임신 전후의 과다한 역할과는 달리, 정자 세포의 기여는 수십 년 동안 전적으로 유전적인 것으로 생각되어 왔습니다. 유전 유전 이론에 따르면, 개체의 표현형 다양성(질병에 대한 감수성 포함)에 대한 부계의 기여는 전적으로 부계로 유전된 대립형질 변이의 유전적 염기서열과 모계로 유전된 변이들과의 상호 작용에 기인해야 했습니다1. 오늘날에는 대립유전자가 수정 과정에서 아버지가 자손에게 전달하는 유일한 유전적 메시지가 아니며, 대신 수많은 후성유전학적 신호가 부계 유전 2,3,4에 기여한다는 것이 분명합니다. 지금까지 확인된 후성유전학적 신호는 다음과 같습니다: (1) 부모 게놈 5,6,7의 사이토신에 공유 결합으로 추가된 메틸기, (2) 정자 염색체와 연관되어 난모세포로 전달되는 히스톤의 번역 후 변형(아세틸화, 메틸화)8, (3) 접합체에서 지속되는 염색체 내 상호 작용(위상학적 결합 도메인, TAD라고도 함)으로 이어지는 부계 염색체의 3D 조직9, 10 및 (4) 조절 RNA 분자 (miRNA, tRNA 유래 단편 및 piwi 상호 작용 RNA) 11, 12 및 수정 중에 정자에서 난모세포로 방출되는 rRNA13 및 tRNA14.

부계 후성유전체(epigenome)는 자손에게 중요한 정보 전달 수단입니다. 부계 정보는 접합자, 발달 중인 배아, 그리고 출생 후 신진대사 장애 및 질병에 대한 자손의 성향에 영향을 미칩니다. 이러한 비멘델적 유전(한 세대 또는 여러 세대에 영향을 미치는지 여부에 따라 세대 간 또는 세대 간 유전이라고 함)은 많은 저자에 의해 서구 선진국에서 발생하는 대사 질환의 급격한 증가에 책임이 있는 은밀한 요인 중 하나로 간주되고 있습니다15. 실제로, PoHaD(Paternal Origin of Health and Disease, 건강과 질병의 부계 기원) 이론과 DoHaD(Developmental Origin of Health and Disease) 이론에 따르면, 부모의 후성유전학적 기여는 자손이 성인이 되었을 때 당뇨병, 비만, 심혈관 질환을 발병하기 쉬운 요인 중 하나이다16,17. 흥미롭게도, 부모의 후성유전체(epigenome)는 환경적 자극에 매우 민감하며, 신진대사 상태(예: 약물 사용, 식이 습관, 신진대사 적합성)18 뿐만 아니라 엄격한 환경적 매개변수(예: 오염 물질에 대한 노출, 사회적 관계, 정신적 및 관계적 스트레스)의 영향을 받을 수 있습니다.5,11. 따라서 위에서 언급한 각 자극은 생식 세포(정자 및 난모세포)의 후성유전체를 변경하고 미래 세대에 영향을 미칠 수 있습니다.

고지방 식단(HFD) 섭취는 가장 광범위하게 연구된 환경 자극 중 하나로, 부계 후성유전체를 변형시키고 자손에게 해로운 메시지를 전달할 수 있다19. 이 자극은 자손 표현형(최대 3세대)에 영향을 미치며, 이들은 종종 칼로리 섭취에 관계없이 신진대사 장애를 일으키는 경향이 더 큽니다. HFD를 섭취하는 아버지의 자손은 생쥐와 쥐 모두에서 성장 지연, 포도당 불내성 및 인슐린 저항성을 나타냅니다20,21. 인간의 경우, 후성유전학적 유전은 주로 기근이나 과식 기간 동안과 그 직후에 태어난 세대에서 연구되어 왔다22. Överkalix 코호트에서 친조부모의 느린 성장 기간 동안 식량 가용성은 손자의 전체 사망 위험, 심혈관 질환, BMI, 허리 둘레 및 지방량과 상관관계가 있었다23. 최근에는 다른 코호트에서도 부계 세대 간 전염의 증거가 확인되었다24.

세대 간 유전(intergenerational inherit)에 관여하는 부계 대사 산물
임상적, 역학적 증거에도 불구하고, 부계 세대 간 유전의 분자 세부 사항은 불분명하다. 우선, 후성유전학적 정보의 모든 분자 변환기의 식별은 아직 완료되지 않았습니다. 과학적 증거는 정자의 핵 구성 요소만으로는 세대 간 유전의 복잡성을 설명할 수 없음을 시사합니다. DNA 메틸화의 변화는 실제로 HFD를 먹인 마우스와 쥐의 정자에서 측정되었지만, 정자 개체군의 비율이 너무 낮기 때문에 자손에서 관찰된 대사 이전성 표현형의 높은 침투율을 설명할 수 없습니다25. 반면에, 정자에서 난모세포로 전달되는 신호 RNA 풀은 반감기가 매우 짧고 접합자 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있음에도 불구하고 수정 후, 2일째, 3일째 배아, 모룰라 및 배반포의 접합자에서 효과적인 농도로 유지될 가능성은 거의 없는 것으로 보입니다. 따라서, 새로운 분자 결정 요인이 세대 간 유전 메커니즘에 관여해야 한다는 것은 분명해 보인다.

핵산과 함께 정자는 또한 지질, 탄수화물 및 아미노산과 같은 접합자에 대사체 구성 요소를 제공합니다 26,27,28,29. 이러한 대사 산물, 특히 조절 활성을 부여받은 대사 산물은 접합 유전자 발현 및 배아 발달에 영향을 미칠 수 있으므로 후성유전학적 신호로 작용할 수 있습니다30. 더욱이, 핵산과 마찬가지로, 정자 내 이러한 대사 산물의 농도와 상대적 풍부도는 아버지가 경험한 환경 조건의 영향을 받을 수 있으며, 따라서 자손을 위한 정보 매개체가 될 수 있다 28,30,31,32,33,34. 실제로, 성숙한 정자의 정자 대사체는 아버지의 건강 상태에 따라 달라지며 식단, 신체 운동, 독성 물질 및 내분비 교란 물질과 같은 환경적 요인의 영향을 받는 것으로 나타났습니다.

배아 발달에서 정자 대사 산물의 역할을 이해하는 것은 몇 가지 기술적 한계로 인해 복잡합니다 : (1) 정자와 난모 세포의 크기 차이로 인해 접합자에 대한 정자의 대사 질량 기여가 최소화되고 (2) 정자가 생산 단계 (정자 형성), 부고환 성숙 단계에서 겪는 여러 대사체 변화, 사정, 그리고 난모세포와의 융합.

정자 성숙 중 정자 대사체의 변동
포유류에서 정자는 정자 형성(spermatogenesis)을 통해 고환에서 생성되는데, 이는 정자 형성(spermatogonial stem cell-dependated process)을 통해 정자 형성(spermatogonia is dependent process)을 통해 정자세포(spermatogonia is applied spermatogonia)가 1차 정세포(primary spermatocyte)로 발달하여 감수분열(meiosis)에 들어가 둥근 반수체 정자(round 반수체 정자체)를 생성합니다. 이러한 세포의 정자형성(morphogenesis)은 정자형성(spermatogenesis)의 마지막 단계에 해당하는 둥근 세포에서 길쭉한/응축된/고도로 전문화된 세포에 이르기까지 정자형성(spermatids)의 대규모 형태 기능적 리모델링인 정자형성(spermiogenesis)을 통해 발생합니다. 그러나, 그 결과로 생성된 정자는 움직이지 않으며 아직 수정이 가능하지 않다35. 정자 형성 후, 정자가 망상 고환에서 부고환으로 방출됨에 따라 정자 세포는 상피 부고환 세포와 상호 작용하고 이 세포에서 분비되는 단백질 및 엑소좀 소포(부고환모좀, 스핑고미엘린과 아라키돈산이 풍부함)와 접촉합니다. 부고환을 통과하면 정자가 완전히 성숙할 수 있으며, 비록 수용 전 상태로 유지되더라도 운동성을 위한 능력을 획득한다36. 부고환 전달 동안, 정자막은 더 음전하를 띠게 되고 스핑고미엘린(sphingomyelin)으로 풍부해집니다. 정자막은 콜레스테롤의 점진적인 감소와 그에 수반되는 고도불포화 지방산(주로 아라키돈산, 도코사펜타엔산, 도코사헥사엔산)의 증가로 인해 더 유동적이 됩니다. 사정 후, 여성 생식기에서 정액 단백질과 알부민은 과분극과 칼슘 유입을 촉진하여 정자 운동성을 활성화함으로써 정자 수용력을 촉진합니다. 용량이 있는 정자의 원형질막은 유동성을 더욱 증가시키고, 콜레스테롤과 인지질의 비율을 낮추며, 시알산, GM1 강글리오시드 및 트리글리세라이드 함량을 감소시킨다31,37.

난모세포를 만나기 전에, 정자는 아크로솜 반응, 즉 아크로솜(정자핵의 앞쪽 부분을 덮고 정자 형성 중에 형성되는 골기 유래 막질 소기관)과 정자 원형질막의 융합을 겪으며, 이는 정자 원형질막의 재편성 및 난모세포를 둘러싼 당단백질 기질인 투명대(ZP)를 관통할 수 있는 능력을 촉진합니다35, 38. 마지막 단계로, 정자 단백질 IZUMO1, SPACA6 및 TMEM9539에 의해 촉진되는 정자와 난모세포 사이의 반융합은 정자 지질이 난모세포막으로 통합되고 핵 및 대사 내용물이 난모세포로 전달되는 결과를 낳습니다.

절차의 이론적 근거
이 절차의 목적은 수정 시 정자에 의해 운반되어 난모세포로 전달된 대사 산물을 식별하는 것입니다(그림 1). 접합체에서 정자와 난모세포 유래 대사 산물을 구별하기 위해 정자는 중수소 산화물, 2H2O40으로 생체 내 대사 표지를 사용하여 중수소(2H, 수소 동위원소) 또는 13C(탄소 동위원소)로 표지하거나 U13C Glucose41로 균일하게 표지합니다. 그런 다음 동위원소 표지된 수컷 마우스는 표지되지 않은 암컷과 짝짓기를 하여 궁극적으로 접합자, 모낭 및 배반포를 수집합니다. 초기 단계의 배아는 (1) 극성, (2) 비극성 대사 산물 및 (3) 스테롤을 추출하기 위해 처리됩니다. 그런 다음 질량 분석 기술을 사용하여 대사체를 분석합니다. 동위원소 표지(부계) 대사 산물은 식별되고 표지되지 않은(모계) 대사 산물과 구별되어 부계 기원을 명확하게 입증합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 이탈리아 나폴리 페데리코 II 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. C57BL/6J 수컷의 선택 및 그룹화

  1. 약 12 주의 C57BL/6J 수컷을 선택하십시오.
  2. 수컷을 두 그룹으로 나누고 LABELED(안정 동위원소 표지 진행 중) 또는 UNLABELED(대조군으로 사용되며 정자 세포와 모류에서 동위원소 표지의 효능을 측정하는 데 사용됨)라고 명명합니다.
  3. 표지되지 않은 정자 세포에서 부고환을 비우기 위해 수컷이 쌍을 이룬 암컷과 짝짓기를 할 수 있도록 합니다.

2. C57BL/6J 수컷의 안정되어 있는 동위원소 레테르를 붙이는

  1. 생체 내 라벨링을 위해 2H2O를 사용하는 경우, 100mL의 2H2O와 900mL의 수돗물을 혼합하여 식수로 사용할 10% v/v 2H2O 농축수를 준비합니다. 생체 내 라벨링을 위해 U13C-Glucose를 사용하는 경우 50-13 C-Glucose 50g을 13 L의 수돗물에 용해시켜 식수로 사용할 5%-13C-Glucose 물을 준비합니다.
    주의 : 2H2O를 장기간 섭취하면 생쥐에게 유독합니다. 각 특정 마우스 균주에 대해 설정하고, 최대 2H2O의 양으로 음용수를 첨가하여 최대 라벨링 효율과 최소한의 부작용을 달성합니다. 포도당을 장기간 섭취하면 생쥐에서 고혈당증과 당뇨병을 유발합니다. 식수에 추가할 U13C-Glucose의 최대량을 설정하여 라벨링 효율성을 극대화하고 부작용을 최소화합니다.
  2. 물병을 동위원소가 표시된 식수가 들어 있는 물병으로 교체하고 생쥐가 2.5-5주(정자 형성의 절반 이상을 포함) 동안 마실 수 있도록 하고 일주일에 두 번 액체를 갱신합니다.
  3. 치료 기간이 끝나면 표지된 수컷이 과배란된 암컷과 짝짓기를 할 수 있도록 합니다.

3. C57BL/6J 암컷의 과배란

  1. 사춘기 이전 연령에 체중이 12.5-14g 사이인 약 4주 된 암컷을 선택하십시오.
  2. PMSG(임산부 암말 혈청)의 5 IU/50 μL/mouse를 복강내 주사하여 난포 성숙을 유도합니다.
  3. 47 시간 후, 황체 형성 호르몬 HCG (인간 융모막 성선 자극 호르몬, 5 IU / 50 μL / 마우스)를 복강에 주입하여 난포의 성숙 완료를 촉진하고 배란과 황체의 형성을 유도합니다.
  4. HCG 주입 후, 암컷이 그림 1의 1 단계에 따라 LABELED 및 UNLABELED 마우스와 짝짓기를 할 수 있도록합니다.
  5. 짝짓기 후 질 플러그 제어42를 수행합니다. 긍정적인 암컷을 분리하여 우리에 가두십시오.

4. 플러싱에 의한 착상 전 배아 수집

  1. 기관적으로 승인된 프로토콜(모룰라를 수집하기 위해 2.5일 사후 성교)에 따라 질 플러그 양성 암컷을 희생합니다.
  2. 동물들을 등쪽에 누워 테이블 위에 놓습니다. 70% 에탄올로 복부를 적시고 넓은 개복술을 시행합니다.
  3. 자궁경부를 꼬집고 자궁경부의 꼬리 끝을 잘라 한쪽의 자궁을 제거합니다. 다른 쪽에서는 자궁 뿔 (안저 부분)의 끝을 잘라냅니다.
  4. PBS가 있는 페트리 접시에 자궁을 넣어 헹군 다음 잔여물이 남지 않도록 다른 깨끗한 페트리 접시에 옮깁니다.
  5. 자궁을 세척하기 위해 2.5mL 주사기에 배양 배지를 로드하고 33G의 뭉툭한 해밀턴 바늘에 부착합니다.
  6. 위와 같이 준비한 난관의 안저에 바늘을 삽입하고 자궁 전체를 씻습니다.
  7. 배양 배지 한 방울에 모룰라를 모아 잔여 점막과 혈액에서 씻어냅니다.
  8. 수집된 샘플을 새로운 수집 튜브로 옮기고, LABELED 또는 UNLABELED 씨수말과 관련된 짝짓기 이벤트에서 파생되었는지 여부에 따라 LABELED MORULAE 및 UNLABELED MORULAE로 그룹화합니다. 샘플을 액체 질소에서 스냅 동결합니다.
  9. 수정되지 않은 난모세포를 수집하기 위해 교미하지 않은 과배란 암컷 그룹(제도적으로 승인된 프로토콜에 따라)을 희생합니다. 수집된 샘플을 새 수집 튜브로 옮기고 UNLABELED OOCYTES로 표시합니다. 샘플을 액체 질소에서 스냅 동결합니다.

5. 부고환 꼬리표에서 정자 채취

  1. LABELED 또는 UNLABELED 폐하를 희생하십시오.
  2. 등쪽 누운 동물을 테이블 위에 놓고 70% 에탄올로 복부를 적신 다음 넓은 개복술을 수행합니다.
  3. 부고환을 제거하고 즉시 PBS 3mL(pH 7.6)에 담그고 느슨하게 잘라 관에서 정자를 배출합니다.
  4. 무명천을 통해 정자 샘플을 걸러냅니다.
  5. 정자 세포를 800 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다(실온에서).
  6. 펠릿을 차가운 탈이온수 1mL에 재현탁시킵니다. 정자 세포만 저장성 용액에 저항하는 반면 비정자 세포는 파열됩니다.
  7. 실온에서 10분 동안 800 x g 의 정자 세포를 원심분리합니다.
  8. 튜브에 라벨을 붙이고, LABELED 또는 UNLABELED 씨수말에서 채취했는지 여부에 따라 LABELED SPERM 및 UNLABELED SPERM으로 그룹화합니다.
  9. 샘플을 액체 질소로 스냅 동결하고 샘플을 -80°C에서 보관합니다.

6. 지질과 극성 대사 산물의 추출

  1. 얼음 위에서 1°C에서 4°C에서 5-1단계의 샘플을 평형화합니다.
  2. 샘플에 225μL의 얼음처럼 차가운 메탄올(MeOH)을 추가하고 -30°C에서 1분 동안 배양한 후 10분 동안 음파 수조에 넣습니다.
    1. 선택 사항: 실험 조건을 설정하는 동안 C16-Ceramide-13 C3-15N 및 L-Lysine-ε-15N hydrochloride를 모두 0.1-2ppm을 내부 표준으로 추가하여 각각 비극성 및 극성 대사 산물에 대한 추출 효율을 측정합니다.
  3. 750μL의 얼음처럼 차가운 메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)를 4°C(550rpm)에서 1시간 동안 써머믹서에 추가합니다.
  4. 원심분리 후 샘플에 188μL의H2O를 추가합니다. 상부(지질)와 하부기(극성 대사산물)를 분리하고 건조시킵니다.
    주의 : MeOH는 삼키면 실명과 간, 신장 및 심장에 손상을 일으킵니다. 과다 노출은 중추 신경계에 누적 효과를 미칩니다. MTBE는 피부, 눈 및 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드 아래에서 작업하십시오.
  5. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다. 질량/분광법 분석이 이루어질 때까지 건조된 시료를 -80°C에서 보관하십시오.
    참고: 건조된 샘플은 -80°C에서 최대 6개월 동안 보관하면서 질량/분광 분석을 기다릴 수 있습니다. 착상 전 배아에서 덜 대표되는 대사 산물을 식별하려면 동일한 짝짓기 쌍 및 짝짓기 이벤트에서 얻은 샘플을 풀링해야 할 수 있습니다.

7. 스테롤 추출

알림: 플라스틱 튜브와 팁의 사용을 피하십시오[무극성 유기 용매에 의해 용해됨]; 대신 유리관과 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 액체를 분배하십시오.

  1. 얼음 위에서 4°C에서 1-5단계의 샘플을 평형화합니다. 수집된 샘플을 500μL의 메탄올/H20 70% v/v 용액에 재현탁하고 현탁액을 유리관으로 옮깁니다.
    1. 30초 동안 와류로 균질화합니다. 균질산염을 4°C에서 16시간 동안 그대로 둡니다.
    2. 선택 사항 : 실험 조건을 설정하는 동안 스테롤 추출 효율을 측정하기 위해 내부 표준으로 식물 스테롤 Sitostanol-5,6,22,23-d4의 0.1-2ppm을 추가합니다.
      주의 : MeOH는 삼키면 실명과 간, 신장 및 심장에 손상을 일으킵니다. 과다 노출은 중추 신경계에 누적 효과를 미칩니다.
  2. 실온에서 15분 동안 3.220 x g 에서 샘플을 원심분리합니다. 상층액을 깨끗한 유리관에 옮기고 500μL의 PBS를 보충합니다.
  3. 얼음처럼 차가운 디에틸 에테르 7mL를 넣고 1분 동안 와류를 일으킵니다. 샘플을 1-2분 동안 그대로 두고 상 분리를 기다립니다. 튜브를 드라이 아이스/아세톤 수조에 담그면 얼립니다. 동결되지 않은 디에틸 에테르 상을 새로 표지된 유리관으로 옮깁니다.
    주의 : 디 에틸 에테르는 인화성이 매우 높은 액체 및 증기이며 공기와 빛에서 폭발성 과산화물로 분해됩니다. 화염과 밀접하게 접촉하여 작업하지 마십시오. 디에틸 에테르는 삼키면 위험하고 피부에 해롭습니다.
  4. 37°C에서 물 상태를 해동하고 4.3단계를 반복합니다. 4.3-4.4 단계에서 수집된 디에틸 에테르 상을 단일 유리관에 결합합니다.
  5. 진공 농축기를 사용하여 샘플을 건조시킵니다. 질량/분광법 분석이 이루어질 때까지 건조된 시료를 -80°C에서 보관하십시오.

8. 샘플 유도체화

참고: 샘플은 특정 대사 산물(콜레스테롤, 지방산, 아미노산) 분석을 위해 TMS 유도체화의 이점을 얻을 수 있습니다.

  1. 실온에서 샘플을 평형화합니다.
    주의 : 불완전한 평형은 튜브 벽과 샘플에 대기의 물을 응결시킬 수 있습니다. 물은 TMS 유도체화를 위해 치열한 경쟁을 벌입니다.
  2. 샘플을 50μL의 피리딘에 용해시키고 25μL의 N,O-Bis(트리메틸실릴(TMS)트리플루오로아세트아미드(BSTFA)를 첨가하여 유도체화합니다. 60°C에서 90분 동안 샘플을 배양합니다. 샘플을 스핀하고 즉시 GC-MS 분석을 진행합니다.
    주의 : 피리딘은 가연성, 자극성 및 독성이 있습니다. BSTFA는 가연성, 부식성 및 자극성입니다. 흄 후드 아래에서 작업하고 보호 장갑을 사용하십시오.

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결과

정자에서 난모세포로의 대사산물 이동을 모니터링하기 위해 LABELED 및 UNLABELED 그룹의 씨수말과 짝짓기한 C57 BL/6J 암컷에서 분리된 모룰라를 질량 분광법 기반 대사체학에 의해 수집하고 분석합니다. 대사 산물은 6-7 단계에서 설명한 대로 추출하고 8 단계에서 설명한 대로 TMS로 유도체화했습니다. LABELED morulae, UNLABELED morulae, UNLABELED 난모세포, LABELED 및 UNLABELED 정자 세포의 대사체 및 지질체 프로파일링을 수행했습니다. 결과 프로파일은 LABELED morulae 및 LABELED 정자 세포 모두에 구체적으로 존재하고 UN morulae 및 UNLABLLED 난모세포에는 없는 화학 종을 식별하기 위해 통계적으로 분석, 정렬 및 비교되었습니다. 후보 화학 종은 더 무거운 분자 질량(주로 2-4 Da의 Δm/z)을 부여받아야 하며 자연적으로 발생하는 화학 종과 함께 용리되어야 합니다. 이러한 더 무거운 종의 존재는 수정 시 특정 부계 대사 산물이 난모세포...

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토론

설명된 프로토콜은 2H2O 또는 U13C 포도당을 가진 수컷 마우스의 안정 동위원소 표지를 사용하여 수정 중에 정자에서 난모세포로 전달되는 대사 산물을 식별한 후 대사체 분석을 수행할 수 있도록 합니다. morulae에서 발견되는 동위원소 표지된 대사 산물은 부계 기원입니다.

수소와 중수소는 동위원소이지만 화학적 거동 측면에서 완전히 동일하지는 않습니다. 2H2O 의 녹는점 및 끓는점은 H2O 의 녹는점과 끓는점보다 높습니다. 또한 생물학적 시스템 (예 : KCl, NaCl 및 인산염)에서 일반적으로 발견되는 염의 점도와 용해도는 2H2O에서 크게 다릅니다. 이 차이는 2H2O에 용해 된 생물학적 시스템의 3 차원 구조와 특성...

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공개 사항

저자는 경쟁 이익이 없음을 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2H2O 여과, 99.8 원자 % 2H시그마 알드리치756822
아세톤시그마 알드리치179124
애질런트  실-8애질런트(미국 캘리포니아주 산타클라라)
C16-세라마이드-13C3-15NLGC 표준TRC-C342770-25MG
디클로로메탄시그마 알드리치34856
디에틸 에테르 시그마 알드리치673811
에탄올시그마 알드리치1,11,727
HCG(인간 융모막 성선 자극 호르몬,시그마 알드리치CG5-1VL
L-라이신-&엡실론;-15N 염산염시그마 알드리치608971
남성과 여성  C57BL/6JOlaHsd 마우스이노티브 C57BL/6JOlaHsd
메틸 tert-부틸 에테르(MTBE)시그마 알드리치306975
기상OH시그마 알드리치1,06,035
N,O-비스(트리메틸실릴(TMS)
트리플루오로아세트아미드(BSTFA)		수펠코15238
PBS응용A0965-9010
PMSG(임신한 암말' S 혈청)리 바이오솔루션즈493-10
피리딘시그마 알드리치360570
시마즈 GCMS 2010plus 시마즈
시토스타놀-5,6,22,23-d4시그마 알드리치680028
트리플루오로아세테이트 나트륨시그마 알드리치1615138
솔라리엑스 XR 7T 브루커 달토닉스
TimsTOF 프로 Q-TOF 브루커 달토닉스
U13C 포도당 시그마 알드리치389374
궁극의 RS3000 UHPLC 써모 피셔 사이언티픽
VanGuard CSHTM 프리컬럼(5.0 × 2.1 mm; 1.7 μ m, 130 Å)바다

참고문헌

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Stable Isotope In-Vivo Labeling for Mass-Spectrometry Identification of Paternal Metabol Ites Transport to Spermation During fertilization (수정 중 정자에서 난모세포로 전달된 부계 대사산물의 질량 분광법 식별을 위한 안정 동위원소 생체 내 라벨링)
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