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방법 논문

전임상 대형 동물 모델에서의 신장 조달

1.1K 조회수

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DOI:

10.3791/67835

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2025년 5월 2일

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기에서는 후속 기계 관류 또는 이식을 위한 전임상 돼지 모델에서 신장 조달을 위한 수술 모델을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

기계 관류는 생체 외 장기 평가, 모니터링, 치료, 최적화는 물론 보존 시간을 연장하기 위한 실행 가능한 전략으로 발전해 왔습니다. 대형 동물 모델은 이러한 기술의 개발 및 최적화에 가장 중요한 역할을 했습니다. 그러나 이식편의 품질과 데이터 재현성을 보장하기 위해서는 장기 및 조직 조달을 위한 표준화되고 임상적으로 번역 가능한 수술 기법을 따라야 합니다. 따라서 여기에서는 전임상 돼지 모델에서 신장 조달을 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 신장 회복은 혼합 품종(요크셔 교배/혼합) 돼지를 사용하여 수행됩니다. 간단히 말해서, 멸균 소독 및 수술 부위의 드레이핑 후 양쪽 신장에 대한 최적의 접근을 얻기 위해 완전한 정중선 절개를 수행합니다. 요관, 신장 정맥 및 동맥은 각각 하대정맥과 대동맥에서 기원할 때까지 절개됩니다. 신장 완전 절제 후 요관을 묶고 원위부로 절단합니다. 그런 다음 기증자 동물은 kg/체중당 100IU로 완전히 헤파린화됩니다. 다음으로, 신장 동맥을 대동맥 가까이에 고정하고, Satinsky 혈관 클램프를 사용하여 신장 정맥을 대정맥 가까이에 고정합니다. 그런 다음 신장 이식편을 절제하고 신장 동맥을 즉시 뒤쪽 캐뉼레이션합니다. 그런 다음 신장을 얼음처럼 차가운 보존 용액으로 씻어내고 기계 관류 또는 이식이 이루어질 때까지 얼음 위에 보관합니다. 마지막으로, 신장 동맥 그루터기는 2-0 실크 결찰로 결찰되고 대정맥은 6-0 폴리프로필렌 봉합사로 봉합됩니다. 이 기술은 신장을 복구하고 살아있는(단일 신장) 또는 사망한(이중 신장) 기증자 환경을 시뮬레이션합니다. 단일 신장 회복은 후속 자가이식을 수행할 수 있는 이점을 제공합니다. 사망한 기증자 모델에서는 혈액 주머니 바늘을 대동맥에 직접 삽입하여 안락사 전에 혈액을 채취하여 동물을 출혈시키고 생체 외 기계 관류를 위한 혈액을 제공할 수 있습니다.

서론

신장 이식은 말기 신장 질환(ESRD)에 대한 최적의 치료법으로, 투석1에 비해 삶의 질이 향상되고 장기적인 결과를 제공합니다. 장기 보존의 발전에도 불구하고 매일 수십 명의 사람들이 신장 이식 대기자 명단에 있는 동안 ESRD로 사망합니다2. 기계 관류는 보존 시간을 늘려 기증자 네트워크를 확장하고 보다 효율적인 장기 할당을 가능하게 하는 성장 분야입니다. 이 기술은 또한 체외 장기 모니터링 및 최적화를 가능하게 하여 허혈-재관류 손상(IRI)의 영향을 최소화합니다. 정적 냉장 보관(SCS)과 비교할 때, 기계 관류는 지연된 이식 기능의 발생을 크게 감소시키는 것으로 나타났습니다 3,4. 기계 관류는 또한 가장자리 이식편의 활성화를 입증했는데, 그렇지 않았다면 이식 기준을 충족하지 못했을 것입니다5. 기술 발전에도 불구하고 가장 일반적인 보존 기술은 얼음 위의 SCS로 남아 있습니다. 추가 전임상 실험 및 데이터는 기계 관류를 신장 보존의 주류로 만드는 데 도움이 될 수 있습니다.

신장 이식을 위한 돼지 모델은 잘 확립되어 있으며 신장 보존 기술, 특히 기계 관류의 개발에 필수적이었습니다. 단엽 설치류 신장과 달리 돼지 신장과 인간 신장은 모두 다소엽이고 크기가 비슷하며 유사한 동맥, 정맥 및 요로 해부학적 구조를 공유합니다 6,7. 따라서 돼지 신장은 특히 의료 기기 및 약물 요법 측면에서 임상 환경으로의 직접적인 번역을 용이하게 합니다. 또한, 돼지 신장은 인간의 신장과 유사한 IRI의 병태생리학을 보여주기때문에 8 신장 보존 연구에 이상적이다.

이식편의 품질과 데이터 재현성을 보장하기 위해서는 장기 및 조직 조달을 위한 표준화되고 임상적으로 번역 가능한 수술 기법을 따라야 합니다. 따라서 여기에서는 전임상 돼지 모델에서 신장 조달을 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 신장 회복을 허용하고 살아있는(단일 신장) 또는 사망한(이중 신장) 기증자 설정을 시뮬레이션합니다. 단일 신장 회복은 후속 자가이식을 수행할 수 있는 이점을 제공합니다. 이중 신장 회복 모델에서는 혈액 주머니 바늘을 대동맥에 직접 삽입하여 동물을 출혈시키고 생체 외 기계 관류를 위한 혈액을 제공함으로써 안락사 전에 혈액을 채취할 수 있습니다.

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프로토콜

설명된 모든 절차는 미국 농무부(USDA)의 허가를 받은 존스 홉킨스 대학의 기관 관리 및 사용 위원회, OLAW(Office of Laboratory Animal Welfare) 및 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 인증 기관의 승인을 받았습니다. 동물은 미국 농무부의 동물 복지법, 미국 국립보건원의 실험 동물 관리 및 사용 가이드, 미국 공중 보건국의 실험 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 정책에 따라 관리되었습니다.

1. 동물과 주거

  1. 이 프로토콜에는 임상적으로 건강한 3-6개월 된 20-40kg 요크셔 돼지(Sus scrofa domesticus) 또는 이와 유사한 것을 사용하십시오.
  2. 슬레이트 바닥으로 된 체인 링크 울타리 안에 동물들을 수용합니다.

2. 수술 전 절차 및 마취

  1. 진정제 투여 시간 최소 12시간 전에 동물을 빨리 단식시키십시오.
  2. 수술 최소 12시간 전에 경구용 시메티콘(20mg/kg)을 투여하고 진정제 최소 1시간 전에 반복하여 투여하여 장 확장을 줄입니다.
  3. 케타민(20-30mg/kg)과 자일라진(2-3mg/kg)을 단일 주사기에 근육 주사로 투여하여 여러 번 주사하지 않도록 합니다.
  4. 돼지를 수술 전 대기 장소로 옮깁니다. 귀 가장자리 정맥에 정맥 주사 카테터를 놓습니다. 절차 전반에 걸쳐 3-10mg/h의 0.9% 식염수 또는 젖산 링거 용액을 투여합니다.
  5. 돼지가 충분히 진정되면 가스 마취 및 기계 환기를 위해 기관내관(20-30kg 동물의 경우 6.0-6.5mm 커프드 기관내관, 30-40kg의 경우 6.5-7.0mm 커프)을 배치합니다. 필요한 경우 프로포폴(0.8-1.66mg/kg)을 정맥 주사하고 효과를 보기 위해 투여합니다.
  6. 동물을 수술실로 옮기기 전에 이발기를 사용하여 수술 부위와 주변의 털을 제거하고 수술 부위의 더러운 스크럽을 제거합니다.
  7. 동물을 수술대에 옮깁니다. 수술 시작 10분 전에 세파졸린(20-22mg/kg)을 정맥 투여하고 수술 중 90분마다 다시 투여합니다. 수술 시작 시 판토프라졸(0.5-1mg/kg)을 정맥 투여합니다.
  8. 절개 전에 추가 진통제를 용이하게 하기 위해 리도카인(최대 2mg/kg)을 피하 블록으로 투여합니다.
  9. 클로르헥시딘 또는 베타딘과 70% 에탄올 또는 식염수를 교대로 최소 3회 무균 상태로 준비합니다.
  10. 체액량, 심박수, 혈압, 맥박 산소 측정, 카프노그래피, 심전도 및 직장 온도를 지속적으로 모니터링합니다. 10-15분마다 이 값을 기록합니다. 저체온증을 예방하기 위해 온열 처리된 언더바디 패드와 따뜻한 공기 담요를 사용하십시오.
  11. 수술을 시작하기 전에 턱 톤, 손바닥 반사 및 이전 단계에서 나열된 매개변수의 조합을 활용하여 동물이 적절한 외과적 마취 평면 내에 있는지 확인합니다.

3. 신장 적출 절차

  1. 섹션 2에 설명된 단계에 따라 동물의 수술을 준비합니다.
  2. 멸균 소독 및 수술 부위 드레이핑 후 양쪽 신장에 최적으로 접근할 수 있도록 정중 개복술(25-30cm)을 수행합니다. 표준 복부 견인기를 삽입합니다.
  3. 결장과 소장을 따뜻한 식염수에 적신 수건으로 덮습니다. 장을 오른쪽으로 후퇴시켜 왼쪽 신장에 접근하거나 왼쪽으로 후퇴시켜 오른쪽 신장에 접근합니다.
  4. 신장 위에 있는 복막을 열고 신장 주위를 절개하여 유착을 제거합니다. 10-12cm 길이가 얻어질 때까지 요관을 절개합니다.
  5. 신장 정맥과 동맥이 각각 하대정맥과 대동맥에서 기원할 때까지 절개합니다.
  6. 신장 완전 박리 후 2-0 실크 결찰로 요관을 원위부로 묶고 넥타이에 근접하게 자릅니다. 소변 배출을 위해 근위 요관 끝을 열어 두십시오.
  7. 헤파린(100 IU/kg) 정맥 주사로 동물을 헤파린화하고 신장의 적절한 헤파린화가 보장될 때까지 2분 동안 기다립니다. 각 신장을 절제하기 전에 이 단계를 반복해야 합니다.
  8. 신장 동맥과 신장 정맥을 각각 대동맥과 하대정맥에 가깝게 두 개의 Satinsky 혈관 클램프로 고정합니다. 클램프에 가까운 신장 동맥과 정맥을 절단하여 신장 이식편을 제거합니다.
  9. 즉시 3mm 뭉툭한 팁 관류 캐뉼라로 신장 동맥을 캐뉼러화합니다. 얼음처럼 차가운 위스콘신 대학교(UW) 용액 또는 쿠스토디올 히스티딘-트립토판-케토글루타레이트(HTK) 보존 용액으로 신장을 씻어냅니다.
  10. UW 또는 HTK로 세척한 후 관류 캐뉼라를 제거하고 신장을 세척하는 데 사용된 것과 동일한 얼음처럼 차가운 보존 용액으로 채워진 멸균 장기 주머니에 신장을 넣습니다. 이 백을 두 번째 멸균 장기 백에 넣으십시오. 그 후 장기를 보관하거나 기계 관류를 시작합니다.
  11. 신장 동맥 그루터기를 2-0 실크 합자로 접합합니다. 6-0 폴리프로필렌을 사용한 2층 러닝 봉합사로 신정맥 그루터기를 닫습니다.

4. 채혈 절차

  1. 절차가 말기이고 다른 모든 외과적 개입이 수행된 경우 기계 관류 및 피출혈에 의한 안락사를 위한 혈액 채취를 진행합니다.
  2. 장을 오른쪽으로 후퇴시키고 하부 복부 대동맥을 확인합니다. 혈관을 덮고 있는 큰 유착이나 조직을 제거합니다.
  3. 채혈 주머니 바늘을 대동맥에 직접 삽입합니다. 쉽게 채울 수 있도록 동물 아래에 가방을 걸어두십시오. 주머니가 가득 차면(약 450mL의 혈액) 대동맥에서 바늘을 제거하고 천자 부위에 압력을 가합니다.
  4. 두 번째 혈액 주머니의 경우 새 바늘을 이전 천자 부위에 1-2cm 가까이 삽입합니다. 필요에 따라 여러 개의 혈액 주머니로 반복하고 각 바늘로 1-2cm 가까이 움직입니다.
  5. 필요한 모든 혈액을 채취한 후, 펜토바르비탈 성분 78mg/kg 이상의 용량으로 펜토바르비탈 나트륨/페니토인 나트륨을 정맥 주사하여 심장 마비를 유도합니다. 펜토바르비탈이 신장의 후속 분석을 방해할 우려가 있는 경우, 마취 하에 돼지에게 투여하는 경우 염화칼륨(KCl)(75-100mg/kg IV)을 대체 화학적 안락사 방법으로 사용하십시오. 심장 박동 부족, 각막 반사 부재, 체온의 현저한 저하로 사망을 확인합니다.
    참고: 제물로 바쳐진 돼지의 남은 장기와 조직은 3R 원칙에 따라 다른 연구 또는 교육 목적으로 사용할 수 있습니다.

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결과

우리 연구 그룹은 고형 장기 이식 및 혈관 복합 동종 이식 9,10,11,12,13,14,15,16,17 모두의 돼지 모델에 걸쳐 거의 15 년에 걸친 광범위한 경험을 가지고 있습니다.. 여기에서는 돼지 신장 회수 실험의 결과를 설명합니다(n = 139). 우리는 이식, 기계 관류 또는 일차 세포 배양을 위해 조달된 신장을 활용해 왔으...

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토론

신장 이식을 위한 돼지 모델은 기계 관류 기술의 개발 및 최적화에 필수적이었습니다. 인간의 신장 6,7,8과 해부학적, 면역학적, 병태생리학적으로 유사하다는 점을 감안할 때, 돼지 신장은 임상 시험 및 실습에 용이하게 전환될 수 있습니다.

돼지 신장 조달 모델은 다양한 전임상 실험에 활용될 수 있습니다. 살아있는 기증자 모델에서는 단일 신장을 회수 및 보존할 수 있으며, 이후 자가이식 및 반대쪽 신장 제거18,19. 사망한 기증자 모델에서는 두 신장을 모두 조달하여 보존 연구, 기계 관류 연구 또는 ...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

저자는 기술 지원을 해준 Johns Hopkins University School of Medicine의 많은 수의사 기술자에게 감사를 표하고 싶습니다. 우리는 또한 Jessica Izzi 박사와 Amanda Maxwell 박사, 그리고 Mallory Brown 박사, Jessica Plunkard 박사, Alexis Roach 박사를 포함한 수많은 수의사 레지던트에게 우리 동물들에게 훌륭한 임상 치료와 수의학 감독을 제공해 주신 것에 대해 감사를 표하고 싶습니다. 마지막으로, 존스 홉킨스 의과대학(Johns Hopkins School of Medicine)의 VCA(Vascularized Composite Allotransplantation) 실험실의 모든 구성원이 우리 실험실에서 수행되는 신장 조달 또는 기타 장기 조달 절차를 어떤 식으로든 지원해 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 NIDDK(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases) 보조금 R44DK136396의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
70% 에탄올 용액피셔 사이언티브04-355-122
애드슨 티슈 포스 A2:D30ps, 4.75인치, 1 x 2 치아웩슬러 서지컬FL0081.1
베어 허거 동물 건강 오버바디 담요3M53777
베어 허거 워밍 유닛3M77500
고정 측면 블레이드가 장착된 발포어 복부 견인기, 깊이 4인치, 최대 펼침 10인치MPM 의료 공급124-7017
베타딘 용액 (5% 프로비돈-요오드)MWI 동물 건강NDC-67618-155-01
세파졸린 주사, USPMWI 동물 건강NDC-63323-237-10
클로르헥시딘 용액MWI 동물 건강NDC-30798-624-31
관리인; HTK 오르간 보존 솔루션필수 제약회사25767073545
DeBakey 조직 겸자, 7.75", 2 mm 팁웩슬러 서지컬FL0789.1
유타솔(펜토바르비탈 나트륨 및 페니토인 나트륨)버박NDC-051311-050-01
헤파린 나트륨 주사, USPMWI 동물 건강NDC-71288-402-10
핫도그 온도 관리 컨트롤러어거스틴 서지컬 주식회사WC71V
핫도그 수의용 언더바디 워밍 매트리스어거스틴 서지컬 주식회사V106
인비지쉴드 격리 가방, 20" x 20"메드라인DYNJSD1003
제이콥슨 마이크로 바늘 홀더, 직선 턱, 둥근 손잡이, 7.25"웩슬러 서지컬NL0729.11
케타민 염산염 주입 용액넥스젠 제약스NC-0256
랩 스펀지 18" x 18"메드라인MDS231318LF
메첸바움 해부 가위, 7인치 곡면웩슬러 서지컬SL5011.1S
스캘럽 커넥터가 있는 비전도성 흡입 튜빙, 1/4" x 10'메드라인DYND50251
판토프라졸 나트륨 주사MWI 동물 건강NDC-55150-202-00
관류 캐뉼라, 자유 흐름, 3mm 둔한 끝MED 얼라이언스 솔루션PER-3003
강성 전구 팁 얀카우어메드라인DYND50130
새틴스키 클램프, 30mm 각도 드베이키 외상 턱, 곡선 샹크, 10인치웩슬러 서지컬AL2150.1
메스 손잡이 #3월드 프리시전 인스트루먼트500236
서베이터 B 위스콘신 대학교 (University of Wisconsin)글로벌 트랜스플랜트 솔루션JFISERB10A r2
단일 수집 유닛 프리필 CPDA-1, 450 mL요르겐센 연구소JO520
소실크 봉합 타이, 2-0, 블랙, 18"코비디엔S-195
수술용 메스 10번월드 프리시전 인스트루먼트500239
서지프로 II 봉합, 6-0, 블루, 30인치, 양손, CV-22 바늘코비디엔VP-733-X
3/4 수술용 드레이프메드라인DYNJP2414
밸리랩 전기외과용 연필과 스테인리스 스틸 전극코비디엔CVNE2516H
밸리랩 포스 FXc 전기외과 발전기코비디엔MFI-MDT-FORCE-FXC
Valleylab 폴리헬시브 성인 환자 반환 전극코비디엔E7507-SD
자일라진 염산 주입 용액넥스젠 제약스NC-0334

참고문헌

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