방법 논문

전임상 모델에서 폐 섬유증 평가 향상을 위해 Micro-CT를 사용한 일측성 폐 용적 분석

DOI:

10.3791/67837

⸱

2025년 6월 20일

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1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Second Department of Elderly Respiratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangdong Provincial Geriatric Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 병변 측의 기관내 점안을 통해 편측성 블레오마이신 유도 폐섬유증 모델에서 환기 부위를 정량화하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 활용하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

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폐섬유증(PF)은 진행성 및 비가역적 간질성 폐질환으로, 예후가 좋지 않고 치료 옵션이 제한적이라는 특징이 있습니다. 블레오마이신의 기관 내 점안으로 유도된 폐 섬유증의 전통적인 마우스 모델은 불균일한 약물 분포와 높은 폐사율을 초래할 수 있습니다. 생쥐의 블레오마이신 투여를 위한 개선된 일방적 기관내 주입 방법을 통해 보다 균일하고 통제된 폐 섬유증 모델을 만들 수 있어 인간의 질병에 대한 더 나은 시뮬레이션을 제공할 수 있습니다. 여기에서는 병변 측의 기관내 점안을 통해 편측성 블레오마이신 유도 폐섬유증 모델에서 환기 부위를 정량화하기 위해 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)을 활용하는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법을 사용하면 전체 폐 용적과 환기된 폐 부위를 정량화할 수 있어 질병 진행 및 치료 반응에 대한 민감하고 정확한 측정을 제공할 수 있습니다. 이 연구에는 마취, 정확한 약물 투여, 마이크로 CT 스캔 및 이미지 분석을 위한 3D 슬라이서 소프트웨어를 사용한 후처리가 포함됩니다. 블레오마이신 치료 후 편측성 폐용적 분석은 대조군에 비해 폐용적이 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. Masson의 트리크롬 염색은 BLM 처리된 마우스에서 콜라겐의 존재와 증가된 침착을 확인했습니다. 본 연구에서는 micro-CT를 이용한 편측 폐 용적 분석을 실시하여 전임상 모델에서 폐 섬유증을 평가하였으며, 연구자들에게 PF 연구에서 치료적 개입을 평가하기 위한 정확하고 철저한 평가 방법을 제공하였다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

폐섬유증(PF)은 치료 방법이 제한된 파괴적이고 돌이킬 수 없는 폐 질환입니다. 전 세계적으로 PF의 발병률은 100,000명당 1명에서 13명 사이이며,1세가 됨에 따라 유병률이 크게 증가하는 것으로 관찰됩니다. 지난 수십 년 동안 상당한 노력이 있었음에도 불구하고 PF의 치료 환경은 여전히 제한적이며, 현재 PF2 치료제로 승인된 항섬유화제는 닌테다닙(nintedanib)과 피르페니돈(pirfenidone) 두 가지뿐입니다. 폐 섬유증의 기저 발병 기전은 매우 복잡하며 분자 및 세포 생리학의 다양한 측면을 포괄합니다3. 다양한 제제에 의해 유도되는 실험적인 생체 내 동물 모델은 현재 병원성 메커니즘 및 질병 표현형을 조사하는 데 필수적인 도구입니다.

기관내 점안술을 통해 투여되는 블레오마이신 유도 폐섬유증 마우스 모델은 기저의 세포 및 분자 메커니즘을 규명하고 잠재적인 치료 표적을 식별하는 것으로 광범위하게 인정받고 있습니다4. 그러나 기관내 주입된 블레오마이신의 비대칭적이고 비선택적인 분포는 주로 불균일한 섬유증과 양측 폐 손상으로 인해 높은 사망률을 유발할 수 있습니다 5,6. 이 문제를 해결하기 위해 우리는 좌측 폐 내에서 실험제의 균일한 전달을 보장하고 PF 환자에서 관찰된 병리학적 과정을 더 잘 모방하기 위해 일방적인 기관내 투여 접근법을 제안했습니다 7,8,9. 또한, 일방적 투여 기법은 국소 분배가 필요한 약물을 평가하거나 특정 폐를 표적으로 하는 다른 실험적 개입에도 활용할 수 있습니다.

전임상 모델에서 마이크로 컴퓨터 단층촬영(micro-CT)은 폐 병리학을 조사하는 데 점점 더 가치가 높아지고 있으며, 질병 진행과 치료 중재에 대한 반응을 모니터링하기 위한 질적 및 정량적 데이터를 제공할 수 있는 종단 연구를 위한 강력한 도구임이 입증되었습니다10. Micro-CT는 총 부피, 환기 및 비환기 영역, 기관지 형태 및 조직 밀도를 평가하는 데 활용되었습니다. 이전 연구를 바탕으로 마이크로 CT를 사용하여 편측성 폐 부피를 분석하고 폐 섬유증 7,8,9의 쥐 모델에서 섬유증 수준을 평가하는 새로운 이미징 방법을 개발했습니다. 이 방법을 사용하면 폭기된 폐 부위를 정량화할 수 있어 질병 진행 및 치료에 대한 반응을 보다 정확하고 민감하게 측정할 수 있습니다.

본 연구는 블레오마이신을 투여한 생쥐의 마이크로 CT 스캔에서 파생된 편측 인공호흡 폐용적 분석 방법을 소개합니다. 이 혁신적인 방법은 폐 섬유증에 대한 보다 정확하고 포괄적인 평가를 제공하여 전임상 연구에서 치료 중재의 효능을 평가하는 방법을 잠재적으로 변화시킬 수 있습니다. 이 연구는 전임상 폐 섬유증 모델 분석에 탁월한 개선에 기여하여 질병 진행과 함께 치료 효과를 평가하기 위한 강력한 정량적 분석 방법을 제공합니다.

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프로토콜

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모든 동물 실험은 광저우 의과 대학의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 실험은 생후 6-8주, 25-30g 수컷 C57BL/6 마우스에서 수행되었습니다. 마우스는 음식과 물에 대한 임시권으로 12시간의 라이트/다크 사이클(라이트: 25lux) 하에 수용되었으며 대조군 및 BLM 그룹에 무작위로 할당되었습니다.

1. 편측성 폐동맥 기관내 점안

  1. C57BL/6 수컷 마우스(6-8주, 25-30g)를 1% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)의 복강 내 주사로 마취합니다.
  2. 호흡수와 사지 철수 반사를 관찰하여 마취 수준을 모니터링합니다.
  3. 70°-90° 각도의 플라스틱 보드에 누운 자세로 마우스를 고정하고 앞니와 팔다리로 고정합니다.
  4. 멸균된 뭉툭한 집게를 사용하여 혀를 부드럽게 집어넣습니다.
  5. 작은 동물 후두경을 사용하여 맞춤형 22G 뭉툭한 바늘을 기관에 삽입하여 후두개와 구인두 구조를 시각화합니다. 보드를 시계 반대 방향으로 -70°로 회전하여 왼쪽 주 기관지를 주 기관지와 평행하게 정렬합니다. 저항이 느껴질 때까지 바늘을 전진시킵니다.
    알림: 최적의 삽입 길이를 보장하기 위해 비슷한 크기의 연습용 마우스를 사용하여 카테터 길이를 미리 측정하십시오.
  6. 30° 각도로 빠르게 회전하고 40μL의 블레오마이신 용액(0.02mg)을 주입합니다. 바늘을 제거합니다.
  7. 적절한 약물 분배를 보장하기 위해 최소 30초 동안 마우스를 제자리에 유지합니다.
  8. 마우스가 따뜻한 담요 위에서 엎드려 회복하도록 합니다.

2. 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(마이크로 CT) 스캐닝

참고: 마우스는 제조업체의 지침에 따라 micro-CT 시스템을 사용하여 스캔했습니다.

  1. 블레오마이신 점안 후 3주 동안 마우스에서 마이크로 CT 스캔을 수행합니다.
  2. 소동물 가스 마취기의 기화기에 적당량의 이소플루란을 첨가하고 기화기를 켜고 유도 농도를 3%로 조정한 다음 쥐가 플립플롭 반사를 잃고 느리고 깊은 호흡을 보일 때까지 유도 상자에 쥐를 넣습니다.
  3. 인덕션 박스에서 마우스를 꺼내 스캐닝 테이블에 누운 자세로 놓아 마우스가 팔다리를 펴고 몸이 정중선을 따라 정렬되도록 합니다.
  4. 스캐닝 표에서 이소플루란 유지 농도를 1%로 설정합니다.
  5. Micro-CT 스캐닝 모드 설정: 가로 시야 43mm, 해상도 2K x 2K, 픽셀 크기 0.042mm, 슬라이스 두께 0.042mm.
  6. 스캔 후 쥐가 깨어날 때까지 따뜻한 담요 위에 쥐를 놓습니다.

3. Micro-CT 후처리: 일방적 선택적 폐 분할 및 부피 분석

참고: 이미지 처리 및 정량 분석은 제조업체의 지침에 따라 무료 오픈 소스 소프트웨어인 3D 슬라이서(http://www.slicer.org)를 사용하여 수행되었습니다. 폐 창에 대한 임상 Hounsfield Unit(HU) 범위는 HU 이미지를 정규화하기 위해 적용되었으며, 이전에 보고된 바와 같이 폐 실질을 정상 폭기 영역([-1000, -350] HU)으로 분할했습니다 8,9,11. 이미지 처리 절차는 다음과 같이 요약됩니다.

  1. 3D 슬라이서를 엽니다. 운영 인터페이스는 그림 1에 설명되어 있습니다.
  2. 로드를 클릭하여 이미징 데이터를 DICOM 형식으로 가져옵니다. Axial, coronal 및 sagittal 이미지가 기본 인터페이스에 표시됩니다(그림 2).
  3. 그림 3 (선택 사항)과 같이 sagittal view와 관련된 매개변수를 조정합니다. (1: 숨겨진 옵션 표시, 2: 현재 볼륨 이름 바꾸기 선택, 3: 새 이름 입력).
  4. 세그먼트 편집기 모듈에서 추가를 클릭하여 선택적 폐 분석(오른쪽 폐)을 위한 세분화를 만듭니다(그림 4)(1: 볼륨; 2: 세그먼트 편집기; 3: 세그먼트 추가; 4: 임계값 설정; 5: 임계값 범위 조정; 6: 마스킹에 사용, 7: 구 브러시 설정).
  5. 임계값 범위를 [-1000, -350] HU로 조정하고 마스킹에 사용 옵션을 활성화합니다.
  6. 구 브러시와 함께 페인트 도구를 사용하여 원하는 폐 영역을 분할합니다.
  7. 고립(Island) 도구를 선택하고 선택한 고립영역 유지(Keep Selected Island)를 선택합니다. 오른쪽 폐를 강조 표시한 다음 Show 3D(3D 표시)를 클릭하여 시각화 패널(그림 5)에 3D 모델을 표시합니다(1: 고립영역(연결된 구성 요소) 편집, 2: '선택한 고립영역 유지' 선택, 3: 3D 모델 표시).
  8. 용어 패널에서 3D 모델의 색상을 파란색(선택 사항)으로 변경합니다.
  9. 왼쪽 폐에 대해 3.4-3.6단계를 반복합니다. 축 방향 흉부 CT 이미지를 레이어별로 처리하여 인공호흡된 왼쪽 폐 용적을 계산하고 3D 모델을 생성합니다(그림 6).
  10. 3D 왼쪽 폐 모델의 색상을 노란색으로 변경합니다(선택 사항).
  11. 오른쪽 폐 분할의 불투명도를 0.2로 설정합니다.
  12. 필요에 따라 3D 모델을 내보냅니다(그림 7).
  13. 3D 뷰 또는 슬라이스 이미지의 스크린샷을 캡처하고 저장합니다(그림 8)(1: 주석 스크린샷, 2: 이미지 형식 선택, 3: 저장 경로 수정).
  14. Segment Statistics 모듈을 사용하여 각 세그먼트에 대한 폐 부피(mm3)를 계산하고 정상 폭기 영역의 정량 분석을 수행합니다(그림 9).

figure-protocol-1
그림 1: 3D 슬라이서 소프트웨어의 인터페이스. 이 그림은 3D 슬라이서 소프트웨어의 주요 작동 인터페이스를 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-2
그림 2: 마우스에서 편측성 기관내 점안술에 의해 유발된 폐 섬유증의 CT 이미지. 축방향, 관상동맥 및 시상 보기와 함께 3D 폐 재건 후 블레오마이신 주입. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-3
그림 3: 시상면 매개변수 조정. 이 그림은 정밀한 시각화 및 분석을 가능하게 하는 매개변수 조정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-4
그림 4: 세분화 편집 및 매개변수 조정. 이 그림은 세분화 편집 과정과 해당 매개변수 조정을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 우폐의 3D 분절. 이 프로세스에는 폐 분할을 위한 연결된 구성 요소 편집(1단계), 오른쪽 폐를 분리하기 위해 선택한 아일랜드 유지 (2단계), 시각화 패널에서 모델을 렌더링하기 위한 3D 표시(3단계 참조)의 세 가지 순차적 단계가 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-6
그림 6: micro-CT 분석을 기반으로 한 왼쪽 폐의 3D 재구성. 축방향 흉부 CT 영상은 폭기 부위를 분할하고, 환기량을 정량화하고, 3D 모델을 재구성하기 위해 층별로 처리되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-7
그림 7: 편측 폐 섬유증 모델에서 인공호흡 폐용적의 micro-CT 분석을 기반으로 한 3D 폐 재건. 재구성된 모델은 지정된 형식으로 미리 정의된 디렉토리로 내보내졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-8
그림 8: 이미지 저장 가이드. 이 그림은 Annotation Screenshot 메뉴를 통해 저장 기능을 시작하는 것부터 형식을 선택하고 저장 경로를 정의하는 것까지 이미지를 저장하는 순차적 단계를 간략하게 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-protocol-9
그림 9: 편측성 폐섬유증 모델에서 micro-CT를 기반으로 한 통계 분석. 규범 폭기 지역에서 파생된 정량적 데이터를 분석했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

4. Masson의 trichome 염색

  1. 폐 샘플을 4% 파라포름알데히드로 실온(RT)에서 밤새 고정하고 등급이 매겨진 에탄올 시리즈를 사용하여 탈수한 다음 파라핀에 삽입합니다. 회전식 마이크로톰으로 5μm 두께의 슬라이스를 준비합니다.
  2. 다음과 같이 단면에 Masson의 삼색 염색을 수행합니다.
    1. 탈파라핀 및 재수화된 부분을 증류수로 헹구고 56-60°C에서 1시간 동안 또는 RT에서 하룻밤 동안 예열된 Bouin Fluid에서 매염제 처리를 합니다.
    2. 세척 후 Weigert의 철 헤마톡실린 용액으로 단면을 10분 동안 염색하고 흐르는 따뜻한 수돗물에 10분 동안 헹구고 Biebrich scarlet-acid fuchsin 용액에 10-15분 동안 담그십시오.
    3. 포스포몰리브딕-포스포텅스텐 산 용액을 사용하여 10-15분 동안 분화를 달성하고 콜라겐이 풍부한 영역이 빨간색에서 투명으로 바뀔 때까지 모니터링합니다.
    4. 그런 다음 슬라이드를 아닐린 블루 용액에 5-10분 동안 직접 옮기고 증류수로 헹구고 1% 아세트산 용액에서 2-5분 동안 분화합니다.
    5. 등급이 매겨진 에탄올(95%에서 절대 알코올) 및 자일렌 투명화를 통해 탈수한 후 수지 매체로 섹션을 장착합니다.

5. Masson의 트리크롬 염색 기계 학습 분석

  1. Masson의 트리크롬 염색을 사용하여 대조군 및 블레오마이신 처리된 폐의 콜라겐 조성 분석을 조직병리학적으로 평가합니다.
  2. 관찰자 의존 편향을 줄이려면 전체 슬라이드 이미지 스캐너를 사용하여 염색된 폐 절편의 고해상도 디지털 이미지를 획득합니다.
  3. 그런 다음 자동화된 소프트웨어 궤도 이미지 분석을 사용하여 콜라겐 영역을 정량적으로 분석합니다 8,9,12. 교육 과정은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다.
    1. 각 조직 범주에 대한 몇 가지 대표적인 주석(예: 콜라겐, 정상 조직 및 섬유성 조직)을 수동으로 설명합니다. 주석이 달린 훈련 영역에서 추출된 픽셀 단위 특징을 사용하여 SVM(Support Vector Machine)에 대한 훈련 세트를 구성할 수 있습니다.
    2. Masson-stained section의 경우 조직 분류를 콜라겐, 정상 조직 및 배경의 세 가지 범주로 정의합니다.
      참고: 기계 학습 모델은 병리학자가 검증한 평가에서 정확한 조직 분류가 확인될 때까지 반복적인 주석 및 개선을 통해 전체 슬라이드 이미지(WSI)에 대한 반복적인 훈련을 받습니다. 만족스러운 분류 정확도가 달성되면 프로세스가 완전히 자동화됩니다: 유효한 관심 영역(ROI) 내의 각 픽셀에서 특징이 추출되고 SVM은 이후에 해당 조직 범주를 높은 정밀도로 예측합니다.

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결과

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그림 10A-D는 폐 용적 변화 및 염색 분석의 결과를 보여줍니다.

블레오마이신(BLM)이 폐 조직에 미치는 영향을 평가하기 위해 3D 이미징 기술을 사용하여 식염수 처리 그룹(Ctrl)과 BLM 처리 그룹 간의 폐 용적량 비교 분석을 수행했습니다. 좌측 폐 용적은 Ctrl에 비해 BLM 그룹에서 현저히 감소합니다. 좌측 폐 용적(mm3)의 정량화는 BLM 그룹에서 상당한 감소를 보여줍니다(그림 10A,C).

Masson의 트리크롬 염색은 폐 조직에서 섬유증의 특징인 콜라겐 침착 정도를 평가하는 데 사용되었습니다. 정량적 결과는 BLM 그룹에서 Masson 양성 염색이 크게 증가했음을 보여주며, 이는 BLM 그룹이 ...

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토론

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폐섬유증(Pulmonary Fibrosis)은 폐 조직에 점진적으로 흉터가 생기는 것을 특징으로 하는 파괴적인 질병으로, 폐 기능의 저하와 궁극적으로 호흡 부전을 초래한다1. 다양한 약리학적 제제 및 투여 방법에 의해 유도되는 폐 섬유증 마우스 모델은 질병 진행을 이해하고 특히 블레오마이신 기관 내 점안술에서 잠재적 치료제의 효능을 평가하는 데 필수적인 도구입니다13. 그러나 블레오마이신 기관내 주입 모델은 폐 전체에 블레오마이신이 고르지 않게 분포되어 있고 주입의 비선택적인 특성으로 인해 높은 사망률이 발생할 수 있는 등 한계가 있습니다. 이 연구에서는 제제의 일방적인 기관내 투여에 대해 설명합니다. 이 접근법은 양측 기관내 투여에 대한 고전적인 접근법에 비해 두 가지 뚜렷한 이점을 제공합니다. 첫째, 이 방법은 일반적으로 마우스의 단일 엽으로 구성된 왼쪽 폐에 선택적으로 일방적으로...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 중국 국가자연과학재단(82300092)과 국가중점호흡기질환연구소 독립연구(SKLRD-Z-202302)의 보조금, 광둥성 연구기관(KD032024001)의 혁신 역량 강화 프로젝트 기금의 지원을 받았다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
식염수 0.9%호프바이오HBPP008-100
22G 무딘 바늘BD383922
3D 슬라이서  이미지 컴퓨팅 플랫폼3D 슬라이서 https://www.slicer.org/
블레오마이신MCE하이-17565
이소플루란RWDR510-22
Masson 얼룩 키트예센60532ES58
마이크로 CT핀삼SNC-100
궤도궤도 이미지 분석https://www.orbit.bio/
펜토바르비탈 나트륨시그마P3761
작은 동물 후두경유옌 악기CG-02M
스프스IBM버전 19.0 
따뜻한 담요랩 애님 테크위도-16-0323

참고문헌

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