In Vitro Human-Based Advanced Model of Pulmonary Fibrosis의 수립 및 평가

Summary

섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 기반으로 인간의 정밀하게 절단된 폐 절편에서 섬유아세포의 활성화를 평가하기 위해 이미징 방법이 개발되었습니다. 이 방법론은 섬유화 진행을 병기화하기 위한 강력하고 재현 가능한 플랫폼을 구축하여 인간 조직 미세환경의 충실도를 유지하면서 치료 개발을 위한 중개 체외 모델을 발전시킵니다.

Abstract

폐 섬유증은 폐포 구조의 돌이킬 수 없는 파괴와 세포 외 기질의 과도한 침착이 특징입니다. 동물 모델은 폐 섬유증 연구에 널리 사용되어 왔지만, 현재 사용 가능한 모델 중 어느 것도 IPF의 진행성 특성이나 섬유아세포 병소와 같은 조직학적 특징을 완전히 요약하지 못합니다. PCLS(Precision-Cut Lung Slices)를 포함한 고급 체외 모델은 종종 생리학적으로 가장 관련성이 높은 폐 검사 시스템으로 간주되며 약물 스크리닝에 성공적으로 사용되었습니다. 그럼에도 불구하고, IPF 폐의 섬유화 정도를 구별할 수 없기 때문에 얻은 PCLS의 맹검과 불확실성을 초래했습니다. 이전 연구에서는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이 ILD의 전섬유화 활성을 평가할 수 있음을 보여주었으며, 이는 조기 진단과 적절한 치료 기간 선택에 잠재적으로 기여할 수 있습니다. 본 연구에서는 쇼크 슬라이서를 사용하여 건강한 기증자와 IPF 환자로부터 600μm PCLS를 획득하고 FAP를 표적으로 하는 분자 프로브를 사용하여 평가하여 형광 신호 강도를 기반으로 섬유아세포 활성의 정도를 결정합니다. 이 접근 방식은 폐 섬유증 연구를 위한 고급 체외 모델 및 평가 기술을 제공하여 질병 메커니즘을 연구하고 치료 개입을 평가하는 능력을 향상시킵니다.

Introduction

폐섬유증(PF)은 원인을 알 수 없고 예후가 특히 좋지 않은 흔한 형태로, 5년 생존율 중앙값이 25%¹에 불과합니다. 기관내 블레오마이신 투여 모델은 현재 전임상 연구에서 가장 널리 사용되는 동물 모델입니다². 그러나 블레오마이신에 의해 유발된 섬유증은 일시적이며 시간이 지남에 따라 해결되며, 이는 IPF³의 비가역적 특성과 뚜렷한 대조를 이룹니다. 더욱이, 기관내 블레오마이신 모델은 외과적 또는 비수술적 기관내 투여로 인한 섬유증의 이질적인 중증도로 인해 상당한 문제를 제시합니다. 현재 동물모델의 이러한 한계는 IPF⁴를 대상으로 하는 임상시험의 높은 실패율에 기여합니다.

PCLS(Precision-cut Lung Slices)는 질병 특이적 세포 누화 네트워크와 미세환경을 충실히 보존하기 때문에 다양한 질병에 사용되어 왔습니다 ^5,6,7. 폐 섬유증에서 IPF 폐의 PCLS는 고유 조직 구조와 세포 이질성을 유지하여 다양한 세포 유형과 세포-세포 외 기^{질 상호 작용을} 관찰할 수 있으며^8,9 폐 병태생리학을 조사하기 위한 대표적인 생체 외 모델로 자리 잡았습니다. 그러나 폐섬유증은 폐의 이질적인 섬유화 병변이 특징이기 때문에 PCLS 샘플링은 본질적으로 맹검입니다. 얻어진 절편이 정지기, 활성기 또는 정상 폐 조직의 섬유화 영역을 나타내는지 시각적으로 구별하는 것은 불가능합니다. 이러한 한계는 시각적 평가 및 선별 도구의 필요성을 강조합니다. 이전 연구에서는 섬유아세포 활성화 단백질(FAP)이 IPF 환자의 폐 조직에서 높고 특이적으로 발현된다는 사실을 발견했으며, 이는 FAP가 ILD¹⁰의 전섬유화 활성을 평가할 수 있음을 나타냅니다.

이 연구에서는 FAP에 대한 단쇄 항체를 ICG(indocyanine green)로 표지하여 조직 침투가 향상된 표적 분자 이미징 프로브를 개발했습니다. 건강한 기증자와 IPF 환자로부터 얻은 600μm PCLS를 이 프로브를 사용하여 이미지화하고 형광 신호 강도를 기준으로 섬유아세포 활성을 평가했습니다. 이 이미징 방식은 작동이 간편하고 세포구조학적 무결성과 생존력을 유지하는 동시에 병원성 진행을 종적으로 추적할 수 있어 기존 섬유증 평가 기술(웨스턴 블로팅, qPCR, Masson의 트리크롬 염색 또는 면역형광)을 능가합니다. 더 중요한 것은 작동이 쉽고 90분밖에 걸리지 않는다는 것입니다. 이는 PCLS 체외 모델을 위한 고급 스크리닝 도구를 제공하여 폐 섬유증 연구를 용이하게 합니다.

Protocol

이 연구는 광저우 의과대학 제1병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다(2021G-29). IPF는 ATS/ERS/JRS/ALAT (2022)에서 수립한 진단 기준에 따라 신체 검사 및 흉부 고해상도 컴퓨터 단층 촬영 결과를 기반으로 진단되었습니다. 모든 IPF 환자 표본은 폐 이식 또는 폐 생검을 통해 얻었습니다. 뇌사 진단을 받은 장기 기증자로부터 건강한 폐 조직 샘플을 채취했습니다10. 조직 채취에 대한 서면 동의서는 채취 전에 각 환자 또는 환자의 가족으로부터 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 솔루션 및 기기에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 인간 PCLS의 준비

참고: 환자는 폐 이식 또는 생검 전에 HIV, HCV 또는 매독과 같은 바이러스에 대해 정기적으로 검사를 받으며, 실험실 직원의 직업적 안전을 보장하기 위해 후속 실험을 진행하기 전에 음성 판정을 받아야 합니다.

1. 솔루션 준비
   1. 인산염 완충 용액(1× PBS)을 준비하고 4°C에서 예냉각합니다.
   2. 2% 아가로스 용액을 준비합니다. 아가로스 2g의 무게를 달아 삼각 플라스크에 옮깁니다. PBS 100mL를 넣고 철저히 혼합한 다음 혼합물이 격렬하게 끓어오를 때까지(≥95°C) 완전히 투명하고 균질하며 눈에 보이는 입자나 줄무늬가 없어질 때까지 전자레인지에서 가열합니다. 과도한 끓는 것을 방지하기 위해 가열하는 동안 때때로 플라스크를 소용돌이치십시오. 사용할 때까지 37°C의 수조에 용액을 넣으십시오.
2. 정밀하게 절단된 폐 절편
   1. PBS로 폐 조직의 외부 표면을 세척하여 과도한 불순물과 혈액을 제거합니다.
   2. 20mL 주사기(1.2mm 바늘)를 사용하여 적절한 양의 아가로스를 흡인하고 기관에 삽입합니다. 완전히 부풀어 오를 때까지 천천히 폐엽에 아가로스를 주입합니다. 아가로스 누출을 방지하기 위해 현저한 내성이 발생하면 주입을 중단하십시오.
      참고: 5 × 2 × 1cm 조직 블록마다 약 10mL의 아가로스가 필요하여 오버플로를 방지합니다. 더 작은 조직 조각의 경우 5mL 주사기와 임베딩 몰드(예: 실리콘 몰드, 플라스틱 트레이 또는 크기에 맞게 자른 원심분리기 튜브)를 사용하여 포매를 돕습니다. 1-2mm 두께의 아가로스 베이스 층을 금형에 붓고 반응고되도록 합니다. 반고체 아가로스에 폐 조직을 부드럽게 놓은 다음 거품을 피하고 조직을 완전히 덮도록 추가 아가로스를 천천히 붓습니다. 아가로스가 완전히 굳어지도록 합니다.
   3. 아가로스 중합이 가능하도록 폐를 얼음 위에 약 30분 동안 놓습니다. 중합을 확인하기 위해 흉막의 경도와 차가움을 확인하십시오. 필요한 경우 계속 식히십시오.
   4. 날카로운 칼날을 사용하여 폐 조직을 1-2cm 조각으로 자릅니다.
   5. 얼음 목욕 트레이를 커팅 벤치의 중앙에 놓고 사전 냉각을 위해 미리 얼음 조각을 채웁니다.
   6. 전원 스위치를 켜고 UP 버튼을 길게 눌러 s를 올립니다.ample 스테이지를 적절한 위치로 이동합니다.
   7. 칼날을 칼 홀더에 조심스럽게 끼웁니다.
      알림: 부상을 방지하기 위해 칼날을 조심스럽게 다루십시오. 사용한 칼날은 지정된 날카로운 물건 용기에 폐기하십시오.
   8. 길이 3cm, 너비 1cm 정도의 테이프를 자릅니다. 끈적한 면을 트레이에 부착하고 끈적하지 않은 면에 시아노아크릴레이트 접착제를 골고루 코팅합니다.
   9. 집게를 사용하여 폐 조직 조각을 집습니다. 흡수성 종이로 표면을 닦아내고 접착제로 코팅된 테이프 위에 놓습니다. 단단히 접착되도록 부드럽게 누르십시오.
   10. 접착제가 굳으면 트레이를 얼음 수조 트레이에 넣습니다. 조직 블록이 잠길 때까지 미리 냉각된 PBS로 채웁니다.
   11. 진동 주파수를 "10"으로 설정하고 절단 속도를 "2"로 설정합니다. FWD 버튼을 눌러 슬라이싱을 시작합니다. 첫 번째 슬라이스가 완전히 절단된 후 STP 버튼을 눌러 중지한 다음 RVE 버튼을 눌러 블레이드를 집어넣습니다. 첫 번째 슬라이스를 버립니다.
   12. 턴테이블을 수동으로 6회 회전하여 단면 두께를 600μm로 설정합니다. FWD 버튼을 눌러 슬라이싱을 다시 시작하고, 단면이 절단된 후 STP 버튼을 누릅니다. RVE 를 눌러 칼을 집어넣고 핀셋을 사용하여 폐 절편을 회수합니다. 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 PBS에 슬라이스를 놓고 얼음 위에 보관합니다.
   13. 위의 슬라이싱 단계를 반복하여 각각 약 600μm 두께의 추가 PCLS를 얻습니다.
   14. 현재 조직 블록이 거의 소진되면 새 조직 블록으로 교체하고 1.2.4에서 1.2.13까지의 단계를 반복합니다.

2. FAP 항체의 정제

참고: 앞서 설명한 바와 같이 C-말단 His 태그를 포함하는 FAP 특이적 단일 도메인 항체를 생성합니다 ^11,12.

1. 파지 디스플레이를 수행하여 고정된 표적 또는 용액 단계 표적에 대해 조합 라이브러리를 반복적으로 패닝하여 FAP 특이적 항체 단편(scFv)의 고처리량 선택이 가능합니다. 엄격한 세척 및 용출을 통해 결합된 파지를 회수합니다. E. coli 를 재감염시켜 파지를 증폭하고 3-4 사이클에 걸쳐 타겟 바인더를 농축합니다. 파지 ELISA 및 DNA 염기서열분석을 사용하여 친화성이 높은 항체를 식별하여 클론을 검증합니다¹².
2. anti-FAP 단일 사슬 변수 단편을 인코딩하는 DNA 염기서열을 E. coli¹³에서 발현을 위해 His 태그와 융합된 pET-28a(+) 벡터로 복제합니다.
3. 재조합 플라스미드를 E. coli BL21 (DE3) 세포로 형질전환시킵니다. 20°C에서 하룻밤 동안 배양한 쉐이크 플라스크 배양에서 이소프로필-β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 사용하여 단백질 발현을 유도합니다¹⁴.
4. 니켈-니트릴로트리아세트산(Ni-NTA) 비드를 사용하여 상등액에서 FAP 항체를 정제합니다. 다운스트림 애플리케이션을 위해 PBS와 버퍼 교환을 수행합니다.
5. 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 항체 순도를 평가합니다. 예상 분자량에서 단일 우성 띠는 높은 순도를 나타냅니다.

3. FAP 항체 친화도 평가

1. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM)의 인간 배아 신장 293T(HEK 293T) 세포를 배양합니다.
2. 90% confluence에서 293T 세포에 인간 섬유아세포 활성화 단백질(hFAP)을 과발현하는 렌티바이러스를 추가합니다. 안정적인 293T-hFAP 세포주를 생성하기 위해 96시간 동안 배양합니다.
3. 293T 및 293T-hFAP 세포를 모두 0.25% 트립신-EDTA로 분해하고 세포를 수집합니다.
4. PBS로 세포를 세척하고 FAP 항체로 배양한 후 Alexa Fluor 488-conjugated anti-His IgG를 배양합니다.
5. NovoCyte 유세포분석기^15,16을 사용하여 형광 강도를 분석합니다.

4. scFv-FAP-ICG 분자 프로브 라벨링

1. PBS를 사용하여 FAP-scFv의 농도를 2mg/mL로 조정합니다.
2. 인도시아닌 녹색 NHS 에스테르(ICG-NHS)를 첨가하여 5:1(ICG-NHS:FAP-scFv)의 몰비를 달성합니다.
3. 와류와 흔들기로 철저히 섞으십시오.
4. 실온에서 2 시간 동안 어두운 곳에서 반응을 배양합니다.
5. 탈염 컬럼을 사용하여 결합되지 않은 염료를 제거합니다. 최종 복합 생성물을 어두운 곳에서 4°C에서 보관하십시오.

5. PCLS에서 섬유아세포 활성의 정도를 평가하기 위한 scFv-FAP-ICG 분자 프로브

1. PCLS를 절단한 후 웰당 한 섹션을 12웰 플레이트에 넣습니다. 1mL PBS로 각 웰을 두 번 헹구어 잔여 혈액과 이물질을 제거합니다.
2. FBS 없이 PCLS를 1mL DMEM에 담그십시오. 최종 농도 5μg/mL에서 scFv-FAP-ICG를 추가합니다. 실온의 셰이커에서 1시간 동안 부드럽게 흔들어 빛으로부터 보호하여 배양합니다.
3. PBS로 샘플을 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
4. 785nm의 여기 파장 및 810nm의 방출 파장을 설정하여 in vivo 동물 이미징 시스템을 사용하여 PCLS의 ICG 형광 이미지를 획득합니다.
5. 형광 강도를 기준으로 PCLS의 섬유증 활성을 평가합니다. 호환 가능한 소프트웨어를 사용하여 형광 광도를 photons/s/cm²/sr로 표현하는 관심 영역(ROI)을 정의합니다.
   1. ROI 선택 버튼을 클릭하면 소프트웨어가 의사 색상 영역의 윤곽을 자동으로 설정할 수 있습니다. ROI 배치가 정확하지 않으면 수동으로 조정하십시오. Calculate(계산)를 클릭하여 영역 내의 신호 강도를 확인합니다. 여러 하위 영역을 선택한 경우 모든 하위 영역의 값을 합산합니다.

Results

인간 폐 조직의 PCLS를 위한 준비 절차는 그림 1에 나와 있습니다. 인간의 폐 조직을 아가로스에 삽입한 후 면도날을 사용하여 약 1cm³ 크기의 조직 블록으로 트리밍했습니다. 트리밍되고 편평한 조직을 마이크로톰을 사용하여 600μm 두께로 절편화하기 위해 플랫폼에 부착했습니다(그림 1A, B). PCLS는 12-웰 플레이트에서 배양하였다(도 1C).

섬유아세포 활성화 단백질(FAP)을 표적으로 하는 단쇄 항체인 scFv-FAP의 준비 및 친화도 특성화는 그림 2에 나와 있습니다. scFv-FAP는 293F 발현 시스템을 사용하여 정제하였다. 정제된 단백질의 분자량 및 순도는 SDS-PAGE 겔의 Coomassie brilliant blue sta...

Discussion

위와 같은 연구 방법을 통해 건강한 기증자와 IPF 환자의 PCLS를 준비하였다. 동시에 포유류 세포를 사용하여 FAP의 단쇄 가변 단편을 발현하고 그 순도와 특이성을 검증했습니다. FAP를 표적으로 하고 ICG로 표지된 분자 프로브를 사용하여 섬유아세포 활성화 정도를 반영하는 FAP 발현 수준을 검출했습니다. 이 접근법은 폐섬유증 치료를 위한 고급 평가 방법을 제공합니다.

PCLS는 조직의 생존력을 유지하면서 자연적인 세포 구성, 세포 간 상호 작용 및 세포-기질 관계를 보존합니다 ^5,6,7. 또한, 연속적인 절편의 균일한 두께와 유사한 모양은 실험 결과의 재현성을 향상시킨다⁸. 그러나 PCLS 준비는 특히 아...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% 트립신-EDTA	Gibco	15050-057
2&배; 색상 SYBR 그린 qPCR 마스터 믹스 (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
20 ml 주사기	Winner	V532159
293T 세포	Beyotime	C6008
502 접착제	Zhuolide	D-40
아가로스, 낮은 겔화 온도	Sigma Aldrich	A9414-25G
항콜라겐 I 항체	abcam	ab138492
항-피브로넥틴 항체	abcam	ab2413
항히스 태그 mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
블레이드	질레트	7in83a7Q
컬러 역전사 키트(gDNA 제거제 포함)	EZBioscience	A0010CGQ
쿠마시 블루 슈퍼 패스트 염색 용액	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
삼각 플라스크	쓰촨 Shunbo	GG-17
FAP 토끼 mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
집게	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
마이크로저울	Secura	Secura225D-1CN
마이크로파	Mideo	PM2002
다중 모드 생체 내 동물 이미징 시스템	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte 유세포 분석기	ACEA  Biosciences	Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
범용 RNA 정제	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratome	DOSAKA	DTK-1000N
β-actin Rabbit pAb	Yeasen	30102ES
프라이머
&-액틴 프라이머-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
&베타;-액틴 프라이머-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP 프라이머-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP 프라이머-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
콜라겐-I 프라이머-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
콜라겐-I 프라이머-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
피브로넥틴 프라이머-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAG
피브로넥틴 프라이머-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA