본 연구는 생쥐에서 치주염을 유발하기 위한 변형된 6-0 나일론 결찰 방법을 설명하며, 이는 재현성이 높으며 연구자들이 치주 질환의 발병에서 병리학적 결과에 이르기까지 치주염을 연구할 수 있는 대안을 제시합니다.
본 연구는 생쥐에서 치주염을 유발하기 위한 변형된 6-0 나일론 결찰 방법을 설명하며, 이는 재현성이 높으며 연구자들이 치주 질환의 발병에서 병리학적 결과에 이르기까지 치주염을 연구할 수 있는 대안을 제시합니다.
치주 질환(PD)은 치아의 지지 조직에 영향을 미치는 염증성 질환으로 전 세계적으로 가장 널리 퍼진 질병 중 하나입니다. 이 병의 심각한 형태인 치주염은 연조직, 치아 및 뼈를 파괴합니다. 치주염의 동물 모델은 영장류, 개, 소형 돼지 및 생쥐를 사용하여 개발되었습니다. 이 중 ligature-induced mouse model은 인간 치주염의 주요 측면을 효과적으로 복제하는 동시에 빠른 질병 진행, 재현성, 예측 가능성 및 저렴한 비용과 같은 이점을 제공합니다. 결찰자를 사용하는 마우스 모델은 치주 조직의 미생물학 및 면역학적 미세환경에 대한 귀중한 통찰력을 제공하여 면역 반응에서 생물막의 중요한 역할과 전신 질환과의 연관성을 강조했습니다. 이 연구는 마우스에서 치주염을 유발하기 위한 변형된 나일론 결찰 방법을 제시합니다. 수정에는 실크 봉합사 대신 나일론 봉합사를 사용하고 접점을 통과하지 않고 치간 접촉 부위 아래에 배치하는 것이 포함됩니다. 이 접근법은 치주염을 효과적으로 유발하는 동시에 기술을 단순화합니다. 봉합사 배치에 대한 자세한 방법론이 그래픽으로 설명되어 있으며 조직학적 및 조직학적 분석을 통해 치주염의 진행을 보여줍니다.
치주 질환(PD)은 치아를 지지하는 조직의 염증성 질환으로 세계에서 가장 흔한 질환중 하나입니다 1; 파킨슨병 발병률은 전 세계적으로 20%-50%인 것으로 보고되었습니다2. PD는 진행 정도가 다릅니다. 치은염(gingivitis)이라고 하는 가벼운 형태는 연조직에만 영향을 미치며, 치주염(periodontitis, PT)이라고 하는 심각한 형태는 뼈와 같은 단단한 조직에 영향을 미칩니다3. PT는 염증성 질환이기 때문에 당뇨병5, 심혈관 질환6, 임신 부작용7 또는 자간전증8과 같은 호르몬 상호작용, 염증성 질환9, 심지어 안구 변화10 또는 치매11와 같은 질병 진행을 변화시킬 수 있는 여러 위험 요인4에 의해 변형될 수 있는 복잡한 면역 반응으로 간주되어야 한다.
그러므로, PT의 발병 또는 유병률과 관련된 병인을 이해하거나, 새롭거나 더 효과적인 치료 전략을 시험하거나, 전신 질환과 PT 또는 치주 미생물군 사이의 상관관계를 확인하기 위해서는 동물 모델이 필요하다12.
효과적인 연구 방법을 선택하는 것은 PT의 발달을 이해하고 연구 질문에 적절하게 답변하는 데 중요합니다13. 수년에 걸쳐 PT 연구를 위해 다양한 동물 모델이 개발되었습니다. 그러나 영장류, 개, 토끼, 미니어처 돼지와 같은 모델은 비용이 많이 들고 사용하기가 복잡하다 14,15,16. PT의 쥐 모델, 특히 ligation-induced PT 모델은 빠른 개발, 재현성, 예측 가능성 및 저비용 등 많은 장점을 가지고 있습니다 17,18,19.
PT를 유도하기 위해 경구용 세균 접종, 지질다당류 주사 및 결찰 유도 10,20과 같은 여러 방법이 사용되지만 각각 장점과 단점이 있습니다17, 나일론 결찰에 의해 유도된 PT의 쥐 모델은 인간의 발달 메커니즘과 유사했습니다 20,21,22,23. PT는 상주 미생물총(microbiota)의 보유를 통해 발생하여 염증을 유발하고 조직 손실을 유발합니다. 또한, 마우스는 PT 연구를 위해 관심 있는 다른 세포 집단 또는 분자를 연구하기 위해 유전적으로 변형될 수 있습니다.
치과 결찰은 교정 와이어, 실크 봉합사(24,25) 또는 나일론 봉합사(26)와 같은 다양한 재료를 사용하여 수행할 수 있습니다. 생쥐에서 결찰에 의해 PT를 유도하는 가장 일반적인 재료는 실크입니다. 이 방법론은 Marchesan et al.18, Abe et al.27 및 Chadwick et al.22과 같은 다른 저자에 의해 설명되었으며, 각각 고유한 수정 사항이 있으며, 이러한 모든 방법은 여러 연구자에 의해 성공적으로 사용되었습니다28. 그러나 생쥐의 위쪽 어금니 주위에 실크 봉합사를 배치하는 것은 복잡할 수 있습니다. Marchesan et al.은 "ligature holder"의 사용을 제안했습니다. Abe et al. 및 Chadwick et al.은 접촉점을 통해 봉합사를 배치했지만 Chadwick et al.은 어금니 M1 및 M2 주위에 봉합사를 배치했습니다.
다양한 두께의 나일론 봉합사는 다양한 동물 모델에서 PT 개발에 사용되었습니다 29,30,31. Lima et al.31은 5-0 나일론 봉합사를 사용했습니다. 이전 연구에서는 6-0 나일론 봉합사를 사용했으며, 결과는 비슷했다28.
멀티필라멘트 봉합사와 비교하여, 나일론 봉합사는 비흡수성 모노필라멘트 합성물이며 염증성 조직 반응이 더 낮다32; 또한, 나일론 봉합사는 미생물 축적 33,34을 허용하며, 나일론 봉합사 12,14,17,19,24,27,35,37 의 통성 혐기성 박테리아와 함께 Fusobacterium nucleatum과 Porphyromona intermedia35,36의 접착에 대한 증거가 있습니다 (표 1).
이러한 특성으로 인해 염증 반응이 물질 축적보다는 박테리아 축적에 주로 집중될 수 있습니다. 또한 나일론은 실크보다 인장 강도와 같은 기계적 특성이 우수합니다38.
따라서, 본 연구에서, 치간 접촉 영역 아래에 M2 주위에 배치된 6-0 나일론 봉합사는 마우스에서 진행성 치주염의 발병을 유도했습니다. 이 접근 방식을 사용하면 일반 핀셋으로 합자를 배치할 수 있으며 결과는 일관됩니다. 30일 후, PT의 발달은 조직 측정 및 조직학적 분석을 통해 확인할 수 있습니다.
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실험 동물과 관련된 모든 절차는 멕시코의 공식 표준 NOM-062-ZOO-1999에 따라 '실험 동물에 대한 생물 의학 연구를 위한 윤리적 프레임워크'를 엄격히 준수하여 수행되었습니다. 이 연구는 CE/FESI/072024/1765 프로토콜에 따라 FES-Iztacala(Facultad de Estudios Superiores Izzacala)의 윤리 위원회에 의해 승인되었습니다. 생쥐는 FES-Iztacala 동물 시설의 병원체가 없는 환경에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 동물 방에 수용되었습니다. 이 프로토콜은 이전에 Abe et al.27에 의해 설명된 방법을 수정한 것입니다. 생후 6주에서 8주 된 암컷 BALB/c 마우스(체중 16g)를 대조군(CTL)과 치주염(PT) 그룹으로 나누었습니다. 치주염은 지속적인 박테리아 부착을 촉진하고 심각한 만성 질환 진행을 유발하기 위해 0일차에 6-0 나일론 봉합사를 배치하여 유발되었습니다. 30일 후, 조직 분석을 통해 조직 손상 및 부착 손실(AL)을 평가하기 위해 모든 마우스를 안락사시켰습니다(기관 승인 프로토콜에 따라). 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 마취 준비
2. 동물 포지셔닝
3. 합자 배치
4. 동물 회복
5. 합자 확인
6. 조직학
7. 데이터 분석
8. 통계 분석
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이 방법론을 통해 유도된 마우스는 2주째부터 치주염(PT)이 발생할 수 있습니다. 생쥐는 결찰의 존재를 확인하기 위해 매주 모니터링되었습니다. 안락사는 30일째에 시행되었다. 모든 그룹의 임상적 특성을 평가했다. 대조군은 시간이 지남에 따라 색깔과 가장자리 치은의 구조와 같은 정상적인 특성을 유지했습니다. CTL 그룹과 비교했을 때, PT 그룹 조직은 염증, 출혈 및 치주낭 형성을 보였으며, 이는 유도된 마우스의 치은 가장자리에서 관찰되었습니다(그림 5).
이 질병의 진행은 두 그룹 모두에서 M2의 치주 조직의 AL에 대한 조직학적 및 조직학적 분석을 수행하여 확인되었습니다. CTL 그룹은 건강한 조직과 유사한 조직학적 특성을 나타냈습니다: 가장자리 및 열구 치은의 상피, 치은 섬유(그림 6A, CTL 파란색 화살표), 접합 상피 및 폐포 능선(
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미생물 및 면역 반응과 같은 다양한 측면을 평가하기 위해 여러 동물 치주염 동물 모델이 사용되었으며, 인간 질병과 몇 가지 유사점이 있다43. 이러한 발견은 생물막의 역할, 면역 반응 및 전신 상태와의 상호 작용과 같은 치주 질환의 틀에 대한 증거를 제공합니다44,45.
치주염의 동물 모델은 서로 다른 복잡성과 유사점을 가지고 있습니다. 예를 들어, 인간이 아닌 영장류, 개 또는 미니어처 돼지는 인간의 치주 질환과 가장 유사하지만, 이를 다루고 유지하기 위한 비용과 필요성으로 인해 이러한 모델은 실용적이지 않다. 또한 치주염의 마우스 모델은 비용이 저렴하고 다루기가 쉽습니다. 더욱이, 마우스는 특정 관심 분자 또는 세포를 생성하도록...
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저자는 이 논문의 출판과 관련하여 이해 상충이 없음을 선언합니다.
이 작업은 멕시코주 과학기술위원회(COMECYT) 보조금 번호[FICDTEM-2021-072]와 연구 프로젝트 및 기술 혁신 지원 프로그램(PAPIIT)-UNAM(보조금 번호[IN-217021]의 일부 자금 지원을 받았습니다. 이 비디오를 제작하기 위해 제공된 시설에 대해 Endoperiodontología, FES Iztacala, UNAM의 전문 프로그램과 이 비디오 제작을 지원한 Rosalba Yañez Ortiz, DDS에 감사드립니다. 일부 피규어는 Biorender 프로그램(계약 번호 ME282NWCI1)으로 제작되었습니다.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.9% NaCl 용액 | PiSA | 린스 상악골 | |
| 6-0 나일론 봉합사 | Atramat, Internacional Farmacé utica | PE1946-N | 합자 배치 |
| 디지털 카메라용 Amscope 3.7 프로그램 | Amscope | x64, 4.11.21973.20230107 | 데이터 수집 |
| EDTA 솔루션 | 시그마– 알드리치 | E5134 | 석회질 제거 |
| 미세 가위 | 일반 | 6-0 나일론 봉합사 | |
| 세 조직 겸자 | 일반 | 6-0 나일론 봉합사 | |
| 즈 패드 | 일반 | 온을 유지하기 위해 | |
| 그래프패드 프리즘 | 그래프패드 프리즘 | 버전 8.3.0 | 데이터 분석 |
| 하이프로멜로스 | 제네릭 | 눈 윤활제 | |
| 사 가능한 물 | 피사 | 마취액 | |
| 희석 케타민 | 마취, 피사 | ||
| 마이크로 원심분리기 튜브 | Cellpro | 801501 | 회질 제거 중 조직을 포함하기 위해 |
| 미세 기공 | 3M | 1533 | 마우스 현 |
| 미경 디지털 카메라 | Amscope 를 | MU1603 | 조직학 |
| 마이크로튜브 | Axygen | MCT-150-C | 저장 마취제 희석 |
| 광학 현미경 | UNICO | Serie G380 | 조직학 |
| Orhodontic 탄성 | TP Orthodintics, Inc | 파란색 | 둥이를 열어 두려면 |
| 파라포름알데히드 용액 | 시그마– Aldrich | 158127 | 조직 고정 |
| 파라플라스트 | 라이카 | 39601006 | 조직학 |
| 수술용 현미경 | Carl Zeiss GmbH 베를린 | 6-0 나일론 봉합사 | |
| 초미세 인슐린 주사기 6mm U-100, 0.3 mL | BD | 326385 | 취액 주입 |
| 범용 고무 밴드 | 일반 | 둥이를 열어 두려면 | |
| 작업대 | 일반 | 생쥐를 지지하는 나무 받침대 | |
| 자일라진 | 포르신, 피사 | 마취전 |
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