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이 프로토콜은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 차단 분석을 설명합니다. 2단계 고정 전략과 맞춤형 완충 시스템을 사용하여 반응 단위를 정확하게 측정하고 화합물 또는 생물학적 제제에 대한 차단율 평가를 용이하게 합니다. 또한 PD-1/PD-L1 억제제의 고처리량 식별을 지원합니다.
PD-1/PD-L1 상호작용의 중단은 암 면역요법에 대한 유망한 전략입니다. 신뢰할 수 있는 스크리닝 플랫폼은 PD-1/PD-L1 억제제의 효능을 평가하는 데 필수적입니다. SPR(Surface Plasmon Resonance) 기술(1세대 PD-1/PD-L1 억제제 SPR 스크리닝 플랫폼)을 활용하여 이전에 확립된 인간 PD-1/PD-L1 차단 분석은 HTRF(Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) 및 세포 기반 분석을 통해 얻은 것과 유사한 결과를 보여주었으며 대규모 스크리닝 가능성이 있습니다. 본 연구에서는 이 분석법의 최적화된 버전(2세대 PD-1/PD-L1 억제제 SPR 스크리닝 플랫폼)을 제시하며, 아민과 바이오 스트렙타비딘 결합을 결합하여 칩의 PD-1 방향 제어를 강화하고 PD-1 단백질 소비를 줄이는 이중 단계 결합 프로세스를 특징으로 합니다. 업데이트된 플랫폼은 PD-1/PD-L1 억제제 BMS-1166을 사용하여 성공적으로 검증되었으며, 이전의 SPR 기반 방법 및 ELISA와 같은 기타 확립된 기술과 유사한 차단 효과를 보여주었습니다. 이러한 결과는 접근 방식의 신뢰성을 확인합니다. 이 최적화된 SPR 스크리닝 플랫폼은 새로운 PD-1/PD-L1 억제제를 식별하고, 암 면역요법 연구를 진전시키며, 면역관문억제제 스크리닝에서 SPR의 잠재력을 강조하기 위한 고처리량의 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.
면역 관문 차단 요법, 특히 PD-1(Programmed Cell Death-1) 및 PD-L1(Programmed Cell Death-Ligand 1)을 표적으로 하는 요법은 암 면역 요법의 최전선에 서 있습니다. 항PD-1/PD-L1 치료제는 혈액암, 피부암, 폐암, 간암, 방광암, 신장암 등 다양한 유형의 암에 사용할 수 있도록 승인을 받았다1. PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 막관통 당단백질로, N-말단에서 단일 면역글로불린 변수(IgV)와 유사한 도메인, 원형질막에서 IgV 도메인을 분리하는 약 20개의 아미노산 줄기, 막관통 도메인, 티로신 기반 신호 모티프를 포함하는 세포질 꼬리를 특징으로 합니다2. PD-1의 리간드 중 하나로 확인된 PD-L1은 막관통 영역, 두 개의 세포외 도메인(면역글로불린 상수(IgC) 및 IgV)과 세포 내 신호 전달 경로3을 유발하는 상대적으로 짧은 세포질 도메인을 특징으로 하는 I형 막관통 단백질입니다. PD-1/PD-L1 억제 경로는 T 세포 활성화와 자가면역을 조절하는 중요한 면역 관문 역할을 합니다4. PD-1은 T세포에서 발현되어 PD-L1과 상호작용하고, T세포 수용체 신호를 억제하며, 항원제시세포와 T세포에서 CD28 및 CD80 분자의 자극을 차단합니다5. 암 조직은 탈출 단계에서 PD-L1을 과발현하여 이러한 생리학적 메커니즘을 이용하여 종양의 성장과 진행을 촉진하는 면역억제 환경을 조성합니다6. PD-1 및 PD-L1 억제제는 이러한 상호작용을 방해하여 면역체계가 종양 유발 억제를 회피하고 T세포 매개 종양-세포 사멸 과정을 다시 시작할 수 있도록 합니다7.
면역관문차단 요법의 탁월한 역할을 바탕으로 PD-1/PD-L1 억제제의 개발은 암 면역 요법의 중요한 발전을 이루었습니다. 미국 식품의약국(FDA)은 PD-1/PD-L1 경로를 특이적으로 표적으로 하는 9가지 면역관문억제제를 승인했습니다. 여기에는 6가지 PD-1 억제제(펨브롤리주맙, 도스타리맙, 니볼루맙, 켐플리맙, 오리팔리맙, 티스렐리주맙)와 3가지 PD-L1 억제제(아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙 8,9)가 포함됩니다. 이러한 치료법은 흑색종, 폐암, 요로상피암, 자궁경부암, 위암 또는 위식도암 및 기타 고형 종양과 같은 다양한 암을 치료하는 데 효과적으로 활용되어 왔다10. 단클론 항체 기반 치료법은 그 효능에도 불구하고 낮은 반응률, 높은 비용, 반감기 연장, 심각한 면역 관련 부작용, 정맥 주사 또는 피하 전달 제한 등 상당한 한계에 직면해 있습니다 11,12,13. 이에 따라 PD-1/PD-L1 축을 표적으로 하는 저분자 억제제 개발에 대한 연구가 점점 더 집중되고 있습니다. 이러한 소분자는 세포 침투 개선, 다양한 생물학적 표적의 조절, 경구 생체이용률 향상, 비용 절감 등의 뚜렷한 이점을 제공하며, 부작용이 적으면서 유사한 치료 결과를 달성하는 것을 목표로 합니다14. 그러나 PD-1/PD-L1 상호작용을 표적으로 하는 저분자 억제제의 개발은 초기 단계에 있으며, 이는 주로 신뢰할 수 있는 고처리량 스크리닝 플랫폼이 없기 때문입니다. 이러한 플랫폼은 방대한 소분자 라이브러리를 신속하게 평가하고 추가 검증 및 최적화를 위해 선도 화합물을 식별하는 데 필수적입니다. 이러한 문제를 극복하는 것은 암 면역 요법을 발전시키는 데 매우 중요합니다.
SPR (Surface Plasmon Resonance) 기술은 항체 항원, 효소, 핵산 및 약물을 포함한 다양한 생체 분자를 검출하는 데 광범위하게 사용되며 특히 저분자 약물 스크리닝에 효과적입니다15 , 16 . 다른 생물물리학 기법과 달리 SPR은 무표지 검출, 실시간 동역학 데이터 및 광범위한 검출 범위를 제공합니다. 대조적으로, 등온 적정 열량측정법은 실시간 역학 통찰력이 부족하고 더 많은 시료 부피가 필요하여 처리량을 제한합니다. Microscale Thermophoresis는 완충 간섭이 발생하기 쉽고 역학 데이터를 제공할 수 없는 반면, Biolayer Interferometry는 분자 크기 및 특성에 따라 응용 분야별 제한이 있습니다. Homogeneous Time-Resolved Fluorescence는 라벨링이 필요하며 형광 간섭에 취약합니다. 우리는 HTRF가 PD-1/PD-L1 억제제를 탐구하는 데 적합한 또 다른 기술이라는 것을 인정합니다. SPR과 비교했을 때 HTRF의 내재적 한계 중 하나는 분자 내 여기 과정(예: 전자 전달, FRET 및 표백)과의 외부 상호 작용으로 인한 형광 소멸, 작은 창 범위로 인해 약물 스크리닝 과정에서 감도가 너무 낮다는 점, 형광 라이브러리 화합물 또는 생물학적 단백질의 간섭입니다17. 이러한 특징은 SPR을 신약 개발을 위한 우수한 도구로 자리매김하고 있습니다. 이전 연구에서는 SPR이 PD-1/PD-L1에 대한 소분자의 차단 효과를 측정할 수 있음을 입증했으며, 이는 신약 개발 과정에서 높은 라벨링 기술 요구 사항, 여러 단계, 낮은 특이성 및 높은 비용이 필요한 다른 기술에 비해 유리합니다18.
이 연구는 칩의 PD-1 배향을 강화하고 단백질 사용을 최소화하기 위해 아민과 바이오 스트렙타비딘 결합을 모두 활용하는 이중 단계 결합 프로세스를 통합하는 최적화된 SPR 기반 플랫폼을 소개합니다. 이 업데이트된 접근법은 PD-1/PD-L1 억제제 BMS-1166을 양성 대조군 바인더로 사용하여 성공적으로 검증되었으며, 이전 SPR 방법 및 ELISA19,20과 같은 다른 확립된 기술 모두에 필적하는 차단 효과를 입증했습니다. 이는 당사 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 확인할 뿐만 아니라 PD-1/PD-L1 억제제의 고처리량 스크리닝을 촉진하는 데 있어 수정된 플랫폼의 효과를 보여줍니다. 바이오 스트렙타비딘 포획 단계를 통합하면 무작위 단백질 배향이 아닌 현장 지향을 제공하여 PD-1 농도를 낮추고(40μg/mL 대 10μg/mL) 최종 사용자가 streptavidin(SA)을 상용화된 사전 고정 SA 칩에 대한 저렴한 대안인 CM5 칩에 고정화할 수 있도록 하여 비용을 절감할 수 있습니다. 따라서 화합물/펩타이드 라이브러리의 대규모, 비용 효율적인 스크리닝에 유리합니다. 암에 대한 PD-1/PD-L1 억제제의 임상적 잠재력을 평가하기 위해서는 인실리코(in silico), 체외(in vitro) 및 생체 내 분석(in vivo assay)을 포함한 추가적인 특성 분석 방법이 필수적이지만, 당사의 향상된 SPR 기반 스크리닝 플랫폼은 PD-1/PD-L1 억제제의 대규모 스크리닝을 위한 효율적인 도구로 두드러집니다.
시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. CM5 칩에서 스트렙타비딘(SA) 단백질의 고정화
2. SA 칩에서 PD-1 단백질의 고정화
3. PD-1 및 PD-L1 재생 정찰
4. PD-1/PD-L1 상호 작용의 검증
참고: 검증을 위해 이전에 발표된 보고서18 다음에 약간의 조정이 이루어졌습니다.
5. 저분자 억제제를 사용한 PD-1/PD-L1 봉쇄 분석: BMS-1166
참고: 봉쇄 분석의 경우, 이전에 발표된 보고서18 에 약간의 조정이 가해졌습니다.
CM5 칩에서 SA의 고정화
SPR 기기 및 관련 분석 소프트웨어의 출력을 통해 데이터를 분석했으며, 이는 플로우 셀 1 및 플로우 셀 2에서 SA 단백질의 목표 RU(2000RU)가 성공적으로 달성되었음을 나타냅니다. 플로우 셀 1과 2는 플로우 셀 1에서 1902.3RU(그림 1A), 플로우 셀 2에서 1900.7RU의 최종 반응으로 CM5 칩 표면에서 SA(40μg/mL)로 고정되었습니다(그림 1B).
SA 칩에서 PD-1의 고정화
SPR 기기 및 관련 소프트웨어의 출력을 기반으로 한 데이터 분석은 플로우 셀 1의 blank cell에 대해 낮은 반응 단위(RU)와 flow cell 2에서 PD-1 리간드에 대한 목표 RU(4000RU)의 성공적인 달성을 나타냈습니다. 플로우 셀 1은 블랭크로 고정되어 -161.0RU의 최종 반응을 보였으며(그림 2A), 플로우 셀 2는 SA 칩에 코팅된 비오틴화된 PD-1 단백질(10μg/mL)로 고정되어 최종 반응은 3698.5RU였습니다(그림 2B).
PD-1 및 PD-L1에 대한 재생 정찰.
재생 스카우팅은 PD-1을 플로우 셀 2에 고정하고 PD-L1을 다양한 글리신 pH 수준(1.5, 2, 2.5 및 3)에서 용액(0.1μM)에 담아 안정적인 베이스라인 및 샘플 반응을 도출하는 재생 용액을 측정하기 위해 수행했습니다. SPR 기기 및 분석 소프트웨어의 출력을 통해 데이터를 분석한 결과, 베이스라인 및 샘플 반응 모두에 대한 반응의 변화가 최소화되어 최적의 재생 조건으로 글리신(pH 2.0)이 생성되었으며, 이는 PD-1 단백질 손실이 최소화되고 칩 표면에서 PD-L1 단백질이 성공적으로 제거되었음을 나타냅니다. 글리신 pH 2.0에서 기준선 반응은 비교적 일정하게 유지되었고 분석물 반응은 안정적이었으며 실험 시작 시 반응에 가까웠으며, 이는 테스트된 4가지 글리신 pH 조건 중 가장 최적의 재생 완충액을 나타냅니다. 높은 pH는 충분하지 않고 낮은 pH는 너무 가혹합니다. pH 2.0이 가장 적합한 재생 조건으로 확인되었습니다(그림 3).
PD-1/PD-L1 상호 작용 검증
데이터는 해당 평가 소프트웨어를 사용하여 분석되었습니다. Kinetics/Affinity 섹션에서 "surface-bound"를 선택하고, 곡선 2-1을 선택하고, kinetics 모델을 1:1 바인딩으로 설정하고, RI 매개변수를 상수 적합으로 조정하여 association rate(ka), dissociation rate(kd) 및 equilibrium dissociation constant(KD)를 결정합니다. 다양한 농도에서 PD-L1과 PD-1의 결합 상호작용을 정량화하여 측정 가능한 반응을 생성했습니다(그림 4). 분석된 결합 매개변수에는 3.611 × 104(1/Ms)의 연관률(ka), 0.0236(1/s)의 해리율(kd) 및 6.536 × 10-7M의 평형 해리 상수(KD)가 포함되었습니다.
확립된 소분자 억제제를 사용한 PD-1/PD-L1 봉쇄 분석: BMS-1166
데이터는 해당 자료를 사용하여 분석하였다. Kinetics/Affinity(역학/친화도)에서 surface-bound(표면 경계)를 선택하고 곡선 2-1을 선택한 다음 결과 및 응답 단위의 시각화된 곡선을 얻습니다. PD-1/PD-L1 결합 상호작용의 차단 효과는 HBS EP+ 완충액에서 0.11μM PD-L1 단백질과 함께 BMS-1166(0-3.125μM)에서 관찰되었습니다(그림 5). 가장 높은 반응 단위는 PD-L1 단독으로 식별되는 반면, BMS-1166 농도가 증가하면 결합 반응 단위가 비례적으로 감소합니다.
그림 1: CM5 칩에서 SA의 고정화. CM5 칩 플로우 셀 1(A) 및 플로우 셀 2(B)에서 스트렙타비딘 단백질의 고정 곡선이 표시되어 있습니다. 먼저, SA 단백질의 5개의 사전 농도가 플로우 셀 1과 2를 통해 흐른 다음 NaOH 세척 및 안정적인 기준선 설정이 수행되었습니다. 다음으로, EDC와 NHS를 첨가 한 다음 에탄올 아민 염산염 세척을 수행했습니다. 다음으로, 목표 수준(2000RU)에 도달하기 위해 PD-1의 5개 펄스를 수행한 다음, 에탄올아민 염산염 세척을 수행하여 정전기로 결합된 리간드를 제거하고 반응성이 없는 NHS-에스테르를 비활성화했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: SA 칩에서 PD-1의 고정화. (A) SA로만 코팅된 blank 플로우 셀 1 및 (B) 플로우 셀 2의 SA 칩에 있는 PD-1 단백질의 고정 곡선이 표시되어 있습니다. 블랭크(플로우 셀 1)의 경우 1M의 NaCl과 50mM의 NaOH를 3회 주입한 후 50% 이소프로판올/1M의 NaCl/50mM의 NaOH로 세척했습니다. PD-1 단백질(플로우 셀 2)의 경우 1M의 NaCl과 50mM의 NaOH를 3회 주입한 다음 PD-1 단백질의 5개 펄스를 주입하여 4000RU의 목표 수준에 도달하고 50% 이소프로판올/1M의 NaCl/50mM의 NaOH를 최종 세척했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PD-1 및 PD-L1에 대한 재생 정찰. 시료 검사 전에 최적의 재생 용액을 결정하기 위해 pH 1.5, 2, 2.5 및 3에서 글리신을 사용한 4가지 재생 조건에 대해 기준선 및 샘플 반응을 얻었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: PD-1/PD-L1 상호 작용 검증. 스트렙타비딘 코팅된 칩 표면에서 PD-1에 다양한 농도의 PD-L1(0.037μM, 0.111μM 및 0.333μM)의 결합 동역학. PD-L1은 PD-1과 뚜렷한 연관성(0-60초) 및 해리 단계(61-120초)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 용액에 PD-L1(0.11μM) 및 BMS-1166(0-3.125μM)이 포함된 SA 고정 CM5 칩에 코팅된 PD-1의 SPR 분석. (A) PD-1/PD-L1과 BMS-1166 사이의 결합 반응에 대한 대표적인 실시간 SPR 응답. (B) PD-1/PD-L1 상호 작용 결합 역학에 대한 백분율 차단 효과 BMS-1166. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: PD-1 단백질 고정화 전략 비교. 아민 커플 링 (A) vs. 이중 단계 Streptavidin-비오틴 커플링(B). 아민 결합은 접근 가능한 결합 부위의 제한된 가용성, 결합에 대한 입체 장애, 고정 중 PD-1 결합 부위의 잠재적 변형 등의 문제를 제시합니다. 대조적으로, 이중 단계 Streptavidin-biotin 접근법은 고정된 PD-1의 자유 결합 부위의 가용성을 향상시켜 용액 내 PD-L1과의 향상된 상호 작용을 촉진합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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이 프로토콜은 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 PD-1/PD-L1 억제제에 대한 차단 분석을 설명합니다. 2단계 고정 전략과 맞춤형 완충 시스템을 사용하여 반응 단위를 정확하게 측정하고 화합물 또는 생물학적 제제에 대한 차단율 평가를 용이하게 합니다. 또한 PD-1/PD-L1 억제제의 고처리량 식별을 지원합니다.
저자들은 미국 국립보건원(NIH) 산하 기관인 국립연구자원센터(National Center for Research Resources, NCRR)의 그랜트 P20GM103430(Grant )의 지원을 받는 로드아일랜드대학교(University of Rhode Island)의 RI-INBRE 핵심 시설을 인정한다. 이 연구는 로드 아일랜드 대학교 약학 대학의 파일럿 그랜트 상, 로드 아일랜드 생명 과학 허브(RILSH)의 소규모 그랜트 상, 로드 아일랜드 재단 보조금의 지원을 받았으며, 모두 Chang Liu 박사에게 수여되었습니다.
| 50 mM NaOH | Cytiva 생명 과학 | 100358 | |
| 50 mM NaOH | Fisher Scientific | 905376 | |
| 96웰 폴리스티렌 마이크로플레이트 | Cytiva Life Sciences | BR100503 | |
| 아민 커플링 키트 | Cytiva Life Sciences | 35120 | |
| Biacore T200 SPR 시스템 및 평가 소프트웨어 3.2 | Cytiva 생명과학 | 28975001 | |
| 비오티닐화 인간 PD-1 Fc, Avitag 단백질 | Acro Biosystems | PD1-H82F1 | |
| BMS1166 | MedChemExpress | HY-102011 | |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DNase Free Water | Fisher Scientific | 188506 | |
| 글리신 1.5 | Cytiva 생명 과학 | BR100354 | |
| 글리신 2.0 | 사이티바 생명과학 | BR100355 | |
| 글리신 2.5 | 사이티바 생명과학 | BR100356 | |
| 글리신 3.0 | 사이티바 생명과학 | BR100357 | |
| HBS-EP+ 완충액 | 사이티바 생명과학 | BR100669 | |
| 인간 PD-L1 Fc 태그 단백질 | 아크로 바이오시스템 | 즈PD-1-H5258 | |
| 이소프로판올 | Fisher Scientific | BP2618-1 | |
| 마이크로플레이트 호일, 96-Well | Cytiva 생명 과학 | 28975816 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| 플라스틱 바이알 7mm | Cytiva 생명 과학 | BR100212 | |
| 고무 캡, 유형 3 | Cytiva 생명 과학 | BR100502 | |
| 시리즈 S 센서 칩 CM5 | Cytiva 생명 과학 | 29149603 | |
| 아세트산나트륨 4.5 | Cytiva 생명 과학 | 100350 | |
| 아세트산나트륨 5.0 | Cytiva 생명과학 | 100351 | |
| 스트렙타비딘 | 시그마-알드리치 | S4762 |
