이 프로토콜은 폐쇄성 신병증에서 조직 섬유증의 진행을 연구하기 위해 마우스에서 편측 요관 폐쇄(UUO)를 유도하는 방법을 설명합니다. 여기에는 수술 절차, 수술 후 관리 및 섬유증 평가 방법이 포함됩니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
신장 간질성 섬유증(Kidney Interstitial Fibrosis) 조사를 위한 일측성 요관 폐쇄 모델(Unilateral Ureteral Obstruction Model for Investigating Kidney Interstitial Fibrosis)
이 논문에서
요약
초록
신장 섬유증은 진행성 만성 신장 질환(CKD)의 최종 병리학적 결과입니다. 편측성 요관 폐쇄(UUO) 모델은 신장 간질성 섬유증의 기저에 있는 분자 및 세포 메커니즘을 밝히고 잠재적인 치료 대상을 식별하는 데 널리 사용됩니다. 이 모델은 편측 요관의 외과적 결찰을 통해 생쥐에서 확립되며, 이는 비교적 간단하고 수행하기 쉬운 절차입니다. 그러나 UUO 마우스 모델은 마우스 변형률, 연령, 성별, 마취 유형, 수술 기간, 시술 중 체온, 작업자의 수술 기술, 섭식 조건 및 마우스의 전반적인 건강 상태와 같은 요인의 영향을 받아 상당한 변동성과 불일치를 나타내는 것으로 알려져 있습니다. 수술 기법의 변화, 봉합사 배치, 폐색 기간의 차이는 결과의 변동성에 기여합니다. 또한, 폐색된 신장의 일관성 없는 샘플링은 신장 섬유증 평가의 변동성을 더욱 증가시킵니다. 이 연구는 UUO 마우스 모델을 개발하고 간질성 섬유증을 평가하는 과정을 간략하게 설명하고, 모델의 예측 불가능성에 기여하는 기술적 문제에 대해 논의하고, 잠재적인 솔루션을 제안합니다. 이러한 통찰력은 신장 섬유증을 조사하기 위해 보다 표준화되고 보편적으로 적용 가능한 접근 방식을 확립하는 것을 목표로 합니다.
서론
만성 신장 질환(CKD)은 전 세계 인구의 10% 이상에 영향을 미치고 있으며 유병률은 증가하고 있습니다1. 선천성 해부학적 기형, 신장 결석증, 전립선 비대증, 방광 종양을 포함한 다양한 요로 질환은 요관 폐색으로 이어질 수 있습니다². 결과적으로, 편측성 요관 폐쇄(UUO) 마우스 모델은 신장 간질성 섬유증의 새로운 메커니즘을 식별하고, 질병 진행을 이해하고, 잠재적인 치료 전략을 평가하기 위한 핵심 도구입니다. 근섬유아세포, (myo)섬유아세포 아군집, 세뇨관 세포 대사 및 세포주기 정지, 부분 상피-중간엽 전이 및 기타 관련 과정의 기원을 조사하는 데 널리 사용되었습니다 3,4,5,6,7,8.
UUO 유도 신장 간질성 섬유증 외에도 일반적으로 사용되는 다른 설치류 모델에는 아리스톨로칙산, 엽산 및 아데닌을 사용하는 것과 같은 독소 유도 모델뿐만 아니라 5/6 신절제술 및 허혈-재관류 손상(IRI)과 같은 외과적 유도 모델도 있습니다. UUO 모델은 다른 신장 섬유증 모델에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 예를 들어, 독소에 의한 신장 섬유증은 비교적 긴 모델링 기간(약 1-2개월)을 필요로 하며, 다른 장기에 대한 독성 부작용은 섬유증 메커니즘의 조사를 복잡하게 만들 수 있습니다 9,10,11. 5/6 신장 절제술과 같은 외과적 유도 모델은 심각한 신장 출혈 및 감염을 유발하여 수술 후 사망 위험을 증가시킬 수 있습니다. 또한, 유도된 간질성 섬유증의 정도는 절제된 신장 조직의 부피와 직접적인 상관관계가 있어 각 마우스에서 동일한 정도의 섬유증을 일관되게 재현하는 것이 어렵습니다12.
신장 IRI 모델은 CKD에 대한 급성 신장 손상을 유도하는 주요 방법이며 상당한 임상적 관련성이 있습니다. 섬유증의 중증도는 허혈 시간과 체온을 조정하여 조절할 수 있습니다. 그러나 UUO 모델에 비해 수술이 더 복잡하고 간질성 섬유증을 유발하는 데 더 긴 기간이 필요하다13. 이러한 모델과 비교하여 UUO 모델은 모델링 기간이 짧고, 변동성이 최소화되고, 반복성이 적으며, 수술이 비교적 간단하다는 등 여러 가지 장점이 있습니다. 독소를 포함하지 않는 UUO 마우스 모델은 하나의 요관을 결찰하여 만들어지며 2주 이내에 폐쇄성 신병증을 유발합니다. 그 결과 신증(hydronephrosis), 세뇨관 확장(tubular llatation), 간질성 섬유증(interstitial fibrosis)이 발생하는데, 이는 인간에서 관찰되는 병리학적 과정과 매우 유사하다14. 섬유증의 중증도(경증, 중등도 또는 중증)는 실험 기간을 조정하여 조절할 수 있습니다.
UUO 마우스 모델은 CKD를 조사하기 위해 다른 모욕 유도 모델보다 수행하기가 더 간단하지만 몇 가지 요인이 안정성에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 요인에는 마우스 변형, 연령, 성별, 마취 유형, 수술 기간, 수술 중 체온, 작업자의 수술 기술, 마우스의 수유 상태 및 건강 상태가 포함됩니다15,16.
마취 상태에서 꾸준하고 조직적인 방식으로 절차를 수행하면서 수술 스트레스와 감염을 최소화하는 것은 재현 가능한 UUO 마우스 모델을 만드는 데 필수적입니다. 또한 CKD의 메커니즘 및 잠재적 치료 대상에 대한 연구는 경험이 부족한 작업자에 의해 손상될 수 있으며, 이로 인해 마우스 손실이 증가하고 모델 이질성이 커질 수 있습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 수술 전, 시술 중, 시술 후의 수술 과정의 주요 기술적 측면을 간략하게 설명하고 주의가 필요한 중요한 문제를 강조합니다. 또한 UUO 마우스 모델에 대한 평가 방법론은 연구자에게 일관되고 신뢰할 수 있는 접근 방식을 제공하기 위해 자세히 설명되어 있습니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물 절차는 기관 지침에 따라 수행되며 난징 의과 대학의 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 성별 및 변형률 차이를 없애고 결과의 비교를 보장하기 위해 8-10주 령이고 체중이 22-25g인 수컷 CD1 마우스만 사용됩니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 정보는 재료 표에 나열되어 있습니다.
1. 동물 및 기구 준비
- 수술 전에 모든 수술 기구를 오토클레이브하십시오.
- 마우스의 무게를 측정하고 마취합니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 흡입 마취 장치를 올바르게 연결하고 1-2L/min의 속도로 산소와 혼합된 2% 이소플루란이 있는 유도실에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 지속적인 마취와 함께 마우스 코를 콧방울에 놓습니다. 발가락 꼬집음에 대한 반응 부족을 평가하여 적절한 진정 수준을 확인합니다.
알림: 정기적으로 호흡 수를 확인하고 마우스의 페달 반사를 사용하여 마취 수준을 평가합니다. 이소플루란을 적절하게 조정합니다. - 기도를 열어 두기 위해 머리와 목을 뻗은 상태에서 누운 자세로 전자 열 패드에 마우스를 놓습니다. 접착력이 낮은 테이프로 발을 고정합니다.
- 온도계를 사용하여 주변 온도를 모니터링하고 37-38 °C로 유지하십시오. 직장 프로브를 삽입하고 시술 중에 마우스의 심부 체온을 약 36.5-37 ° C로 유지하십시오.
- 각막 건조증 손상을 방지하기 위해 눈에 안과 연고를 바르십시오.
- 제모 크림으로 수술 부위의 모발을 깎고 베타딘 용액으로 3회 소독합니다.
2. 수술 절차
알림: 체온이 설정점에서 안정되고 발가락 꼬집음 반사가 사라지면 다음 수술 절차를 시작하십시오.
- 수술용 칼날을 사용하여 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 하단 가장자리까지 약 1-1.5cm의 수직 절개를 만들어 복강을 노출시킵니다.
- 멸균 생리식염수를 적신 면봉을 사용하여 장을 복강 오른쪽으로 이동하여 비장 뒤쪽 아래와 척추에 인접한 왼쪽 신장을 노출시킵니다.
- 구부러진 홍채 집게를 사용하여 왼쪽 요관을 둘러싼 지방과 결합 조직을 제거합니다. 부드럽게 격리한 후, 3/0 실크 꼰 봉합사를 사용하여 왼쪽 요관을 신장의 아래쪽 극에 가깝게 접합합니다. 첫 번째 결찰과 방광 사이에 왼쪽 요관의 두 번째 결찰을 수행합니다.
참고: 마우스 간의 변동성을 최소화하려면 결찰 위치가 모든 피험자에서 일관되게 유지되는지 확인하십시오. 왼쪽 집게를 사용하여 봉합사를 오른쪽 집게 끝에 놓고 봉합사를 요관 아래로 다시 밀어 넣습니다17. 결찰에 과도한 지방과 결합 조직을 포함하면 불완전한 신장 폐색으로 이어질 수 있으므로 피하십시오. 마른 면봉으로 요관을 부드럽게 쓰다듬어 이를 달성하십시오. - 장을 복막강으로 조심스럽게 재배치한다. 3/0 실크 브레이드 봉합사를 사용하여 근육과 피부층을 따로 봉합합니다.
참고: 피부와 근육층을 함께 봉합하면 봉합사, 상처 파열 및 복부 내장 손상이 발생할 수 있습니다. - 여러 마우스에 대해 수술하는 경우 다음 마우스로 진행하기 전에 흐르는 물과 75% 에탄올로 수술 기구를 세척합니다.
3. 수술 후 관리 및 모니터링
- 탈수를 방지하기 위해 따뜻한 생리식염수 0.5mL를 복강내에 주사합니다.
- 쥐가 완전한 의식을 회복할 때까지 깨끗한 우리에 다시 넣습니다.
- 부프레노르핀(50μg/kg)을 3일간 피하주사로 투여한다. 매일 쥐를 모니터링하여 몸단장 부족, 식사 감소 및 비정상적인 자세의 징후가 있는지 확인하십시오.
4. 수술 후 평가
- 조직학
- 이소플루란(isoflurane)을 과다 투여한 쥐를 안락사시킵니다(기관에서 승인한 프로토콜에 따름). 안락사 후 폐쇄 및 반대쪽 비폐쇄 신장18 을 적출합니다.
- 조직학적 검사를 위해 신장 절편의 가장 큰 단면적을 사용하십시오.
- 신장 조직을 4% 파라포름알데히드로 고정하고 얻어진 샘플을 4μm 섹션으로 자릅니다.
- 신장 세뇨관 손상 및 신장 섬유증을 검출하기 위해 주기적인 산-쉬프(PAS), 매슨 트리크롬 염색(MTS) 또는 시리우스 레드 염색으로 신장 절편을 염색합니다.
- 200×의 배율로 광학 현미경으로 신장 절편의 무작위 필드 10개를 선택합니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 콜라겐 양성 파란색 영역의 비율을 계산합니다.
- 웨스턴 블롯
- 방사성 면역침전 분석법(RIPA) 완충액을 사용하여 UUO 신장의 동일한 극에서 약 20mg의 신장 조직을 추출합니다18.
- 비신초닌산(bicinchoninic acid) 분석을 사용하여 단백질 농도를 정량화합니다19.
- 전기영동을 위해 동일한 양의 단백질 샘플을 4%-10% Bis-Tris 겔에 로드하고 PVDF(폴리비닐리덴 디플루오라이드) 멤브레인으로 옮깁니다.
- TBST(Tris-Buffered Saline Tween)에서 5% 우유로 PVDF 멤브레인을 차단하고 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체로 배양합니다.
- PVDF 멤브레인을 TBST로 세척하고 실온에서 1시간 동안 2차 항체로 배양합니다.
- 향상된 화학발광(ECL) 방법을 사용하여 단백질 수준을 검출하고 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(GAPDH)를 로딩 제어로 사용하는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 단백질 수준을 분석합니다.
- 신장 기능
- 흡입된 이소플루란으로 마우스를 마취합니다(1.2단계 참조).
- 마취 후 후궤도 방향으로 혈액 샘플을 수집합니다.
- 실온에서 15분 동안 3,000 x g 의 혈액 샘플을 원심분리합니다.
- 자동 건조 화학 분석기를 사용하여 혈청 크레아티닌 및 혈액 요소 질소(BUN)를 측정하여 신장 기능을 모니터링합니다.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
조직학
주기적 산-쉬프(PAS) 염색은 세뇨관 확장, 브러시 테두리 손실, 캐스트 형성 및 세뇨관 상피 팽창을 나타냈습니다. Masson의 트리크롬 및 시리우스 적색 염색은 가짜 그룹에서 관찰된 눈에 띄는 내강을 가진 정상적인 소형 세뇨관과 대조적으로 UUO 후 간질성 섬유화를 보여주었습니다. Masson의 트리크롬 염색에서 파란색 영역과 시리우스 적색 염색에서 빨간색 영역으로 표시되는 신장 간질성 섬유증의 정도는 시간에 따라 증가하는 방식으로 증가했습니다(그림 1A).
웨스턴 블롯
피브로넥틴(FN), 콜라겐 I(Col-1) 및 α평활근 액틴(α-SMA)은 신장 섬유증을 평가하는 데 일반적으로 사용되는 표지자입니다. 가짜 그룹과 비교했을 때, 이러한 섬유화 단백질의 발현 수준은 UUO 이후 현저히 증가했으며 폐색 기간과 양의 상관관계가 있었습니다(
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
신장 간질성 섬유증을 조사하기 위해 널리 사용되는 접근 방식인 UUO 모델을 확립하기 위한 포괄적인 절차가 제공됩니다. 또한 신장 기능 및 조직학적 변화에 대한 평가를 포함한 모델의 식별 및 평가가 입증됩니다. 모델의 이질성에 기여하는 변수와 수정 가능한 기술적 요인에 대해 설명합니다.
UUO에 대한 감수성은 연령, 성별 및 생쥐 균주에 따라 크게 다릅니다. C57BL/6 마우스에 비해 BALB/c 마우스는 UUO20에 덜 민감하거나 내성이 있습니다. 수컷 및 암컷 C57BL/6 마우스를 대상으로 한 연구에서 수컷 마우스는 UUO23에 따라 콜라겐 IV 발현이 증가했을 뿐만 아니라 Masson의 트리크롬 염색 및 점수가 더 높았습니다. 또한, UUO에서 신장 섬유증에 대한 성별 차이의 영향은 형질전환 마우스 모델과 녹아웃 마우스 모델에...
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 작업은 중국 국가과학재단 보조금(82370686/2024YFA1107704), 장쑤성 특별 임명 교수 그랜트, 난징 과학기술 혁신 프로젝트, 장쑤성 병원 고위급 인재 양성 프로그램(1단계)(CZ0121002010037), 장쑤성 자연과학재단(BK20240055) 및 JR에 대한 장쑤성 의료 혁신팀의 지원을 받았습니다. 장쑤성 병원(난징 의과대학 제1부속병원) 임상역량향상프로젝트(JSPH-MA-2023-4), 장쑤성 고등교육기관(중국) 및 중국국립자연과학재단(81970639/82151320)의 우선 학술 프로그램 개발
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 주사기 | Mingankang | / | |
| 4/0 외과 용 봉합사 | Jinhuan Medical | F401 | |
| 75 % 에탄올 | Lircon | 6303060031 | |
| 마취 공기 펌프 | RWD 생명 과학 | R510-29 | |
| 마취 유도 챔버 | RWD 생명 과학 | V102-V | |
| 동물 이발기 | Jinke | / | |
| 베타딘 용액 | 리르콘 | 6303030036 | |
| 부프레노르핀(진통제) | RWD 생명과학 | / | |
| 곡선형 홍채 겸자 | 진케 | / | |
| 전자 히트 패드 | 렙티주 | AHM23 | |
| 미세 직선 겸자 | 진케 | / | |
| 가스 필터 캐니스터 | RWD 생명 과학 | R510-31-6 | |
| 거즈 패드 | 우승자 의료 | 601-026576 | |
| 홍채 가위 | Jinke | / | |
| Isoflurane (마취제) | RWD 생명 과학 | R510-22-10 | |
| 다중 출력 동물 마취기 | RWD 생명 과학 | R550IE | |
| 바늘 홀더 | jinke | / | |
| 안과 연고 | Dechra NDC | 17033-211-38 | |
| 멸균 면봉 | Winner Medical | 601-015213 | |
| 멸균 식염수 | Shimen | H20066533 |
참고문헌
- Bello, A. K., et al. An update on the global disparities in kidney disease burden and care across world countries and regions. Lancet Glob Health. 12 (3), e382-e395 (2024).
- Klahr, S. Obstructive nephropathy. Intern Med. 39 (5), 355-361 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Grande, M. T., et al. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 21 (9), 989-997 (2015).
- Kang, H. M., et al. Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development. Nat Med. 21 (1), 37-46 (2015).
- Lebleu, V. S., et al. Origin and function of myofibroblasts in kidney fibrosis. Nat Med. 19 (8), 1047-1053 (2013).
- Yang, L., Besschetnova, T. Y., Brooks, C. R., Shah, J. V., Bonventre, J. V. Epithelial cell cycle arrest in g2/m mediates kidney fibrosis after injury. Nat Med. 16 (5), 535-543 (2010).
- Kuppe, C., et al. Decoding myofibroblast origins in human kidney fibrosis. Nature. 589 (7841), 281-286 (2021).
- Ren, J., et al. The transcription factor twist1 in the distal nephron but not in macrophages propagates aristolochic acid nephropathy. Kidney Int. 97 (1), 119-129 (2020).
- Perales-Quintana, M. M., et al. Metabolomic and biochemical characterization of a new model of the transition of acute kidney injury to chronic kidney disease induced by folic acid. PeerJ. 7, e7113(2019).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: A comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. Am J Physiol Renal Physiol. 321 (1), F106-F119 (2021).
- Tan, R. Z., et al. An optimized 5/6 nephrectomy mouse model based on unilateral kidney ligation and its application in renal fibrosis research. Ren Fail. 41 (1), 555-566 (2019).
- Fu, Y., Xiang, Y., Wei, Q., Ilatovskaya, D., Dong, Z. Rodent models of aki and AKI-CKD transition: An update in 2024. Am J Physiol Renal Physiol. 326 (4), F563-F583 (2024).
- Kramann, R., Menzel, S. Mouse models of kidney fibrosis. Methods Mol Biol. 2299, 323-338 (2021).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Nørregaard, R., Mutsaers, H. aM., Frøkiær, J., Kwon, T. H. Obstructive nephropathy and molecular pathophysiology of renal interstitial fibrosis. Physiol Rev. 103 (4), 2827-2872 (2023).
- Thornhill, B. A., Chevalier, R. L. Variable partial unilateral ureteral obstruction and its release in the neonatal and adult mouse. Methods Mol Biol. 886, 381-392 (2012).
- Ren, J., et al. Twist1 in infiltrating macrophages attenuates kidney fibrosis via matrix metallopeptidase 13-mediated matrix degradation. J Am Soc Nephrol. 30 (9), 1674-1685 (2019).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Puri, T. S., et al. Chronic kidney disease induced in mice by reversible unilateral ureteral obstruction is dependent on genetic background. Am J Physiol Renal Physiol. 298 (4), F1024-F1032 (2010).
- Falke, L. L., et al. Age-dependent shifts in renal response to injury relate to altered BMP6/CTGF expression and signaling. Am J Physiol Renal Physiol. 311 (5), F926-F934 (2016).
- Song, L., Shi, S., Jiang, W., Liu, X., He, Y. Protective role of propofol on the kidney during early unilateral ureteral obstruction through inhibition of epithelial-mesenchymal transition. Am J Transl Res. 8 (2), 460-472 (2016).
- Saad, K. M., et al. Reno-protective effect of protocatechuic acid is independent of sex-related differences in murine model of UUO-induced kidney injury. Pharmacol Rep. 76 (1), 98-111 (2024).
- Goorani, S., Khan, A. H., Mishra, A., El-Meanawy, A., Imig, J. D. Kidney injury by unilateral ureteral obstruction in mice lacks sex differences. Kidney Blood Press Res. 49 (1), 69-80 (2024).
- La Russa, D., Barberio, L., Marrone, A., Perri, A., Pellegrino, D. Caloric restriction mitigates kidney fibrosis in an aged and obese rat model. Antioxidants (Basel). 12 (9), 1778(2023).
- Wei, Q., Dong, Z. Mouse model of ischemic acute kidney injury: Technical notes and tricks. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1487-F1494 (2012).
- Hammad, F. T. The long-term renal effects of short periods of unilateral ureteral obstruction. Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol. 14 (2), 60-72 (2022).
- Chevalier, R. L., Thornhill, B. A., Wolstenholme, J. T., Kim, A. Unilateral ureteral obstruction in early development alters renal growth: Dependence on the duration of obstruction. J Urol. 161 (1), 309-313 (1999).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
