방법 논문

세포 대사 연구를 위한 멀티모달 광학 이미징 플랫폼

DOI:

10.3791/67906

⸱

2025년 6월 6일

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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label-free 광학 이미징 방식을 결합한 멀티모달 플랫폼을 활용하여 세포 역학 및 신진대사를 시각화하고 정량화하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 다광자 형광, 2차 고조파 생성 및 유도 라만 산란 현미경을 통한 이미징을 통해 세포 및 분자 환경에 대한 전체적인 개요를 생성할 수 있습니다.

초록

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광학 이미징 기술은 높은 공간 해상도에서 생물학적 표본에서 형태학적 및 기능적 정보를 모두 얻을 수 있는 능력으로 인해 생물 의학 연구에서 매우 중요합니다. 이러한 광학 프로세스는 광자와 세포, 조직 또는 기관 내의 분자 사이의 산란, 흡수, 방출 및 조화 생성과 같은 다양한 빛-분자 상호 작용을 이용합니다. 기존의 생체 의학 이미징은 역사적으로 단일 양식을 적용하는 데 중점을 두었지만, 최근 연구에 따르면 이러한 다양한 기술은 상호 보완적인 통찰력을 제공하고 결합된 출력은 노화 과정의 분자 변화 및 질병 발달 및 세포 생물학의 기초에 대한 보다 포괄적인 이해를 제공합니다.

지난 수십 년 동안 label-free 광학 이미징 방법이 발전하여 세포 및 세포 내 환경을 자세히 탐색할 수 있게 되었습니다. 예를 들어, 다광자 형광(MPF)은 표적 단백질 이미징을 용이하게 할 뿐만 아니라 자가형광 코엔자임을 통해 대사 활동을 정량화하여 높은 침투 깊이와 공간 해상도를 달성합니다. SHG(Second Harmonic Generation)는 세포 외 기질의 콜라겐과 같은 구조를 이미지화하는 데 사용되며, SRS(Stimulated Raman Scattering)는 세포 내 해상도로 화학 결합 및 분자 구성을 현장에서 매핑합니다.

당사는 MPF, SHG 및 SRS 양식을 결합한 다중 모드 이미징 플랫폼을 개발했습니다. 이러한 양식을 단일 플랫폼에 통합하면 세포, 조직, 기관 또는 신체 내에서 동일한 국소화로부터 다면적인 정보를 획득할 수 있으므로 세포 대사, 세포 외 기질 구조 및 분자 구성 간의 복잡한 관계를 보다 자세히 탐색할 수 있습니다. 이 멀티모달 시스템은 세포 내 해상도, 심층 조직 침투, 현장 라이브 셀/조직 이미징뿐만 아니라 위치 조정, 장치 전환 또는 분석 후 정렬이 필요 없는 무표지 검출 및 즉각적인 공동 정합을 제공합니다. 여기에서는 이 멀티모달 플랫폼을 사용한 무표지 이미징을 위한 프로토콜을 제시하고 노화 및 질병 연구를 위한 세포 대사 및 세포 및 조직의 분자 이질성을 특성화하는 데 이 프로토콜의 적용을 시연합니다.

서론

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광학 생체 의학 이미징은 생물학적 구조와 기능에 대한 이해를 발전시키는 데 중추적인 역할을 했습니다. 이미지는 여기광을 조절하고 빛과 조직 간의 상호 작용에서 신호를 감지하여 생성됩니다. 1590년경 Hans와 Zacharias Janssen이 개발한 최초의 복합 현미경은 튜브에 두 개의 볼록 렌즈를 사용하여 최대 30x1의 배율을 제공했습니다. 수세기에 걸친 발전에 힘입어 현대 광학 현미경은 이제 1-3nm 2,3의 미세한 해상도를 달성할 수 있습니다. 고급 이미징 시스템은 고해상도를 제공할 뿐만 아니라 이제 더 깊은 조직 침투, 더 높은 효율성 및 최소한의 샘플 손상을 제공하여 라이브 셀 및 조직 이미징에 특히 적합합니다. label-free 이미징은 세포 내 프로세스를 방해하거나 시료 무결성을 손상시키지 않고 정보를 캡처하기 때문에 특히 유리합니다.

다광자 형광(MPF) 현미경, 특히 이광자 형광 현미경은 무표지 이미징에 광범위하게 사용되어 왔습니다. 선형 단일 광자 흡수 및 방출에 의존하는 기존의 형광 현미경과 달리 MPF 여기는 여러 광자의 동시 흡수를 포함하며, 결합 에너지는 단일 형광단 분자 4,5를 여기시킵니다. 일반적으로 적외선 스펙트럼에 있는 이러한 광자는 단일 광자 여기에 필요한 에너지의 절반 이하를 소유합니다. 이 비선형 공정에서 초점에서 더 긴 파장과 국부적인 여기(excitation)는 산란을 낮추고 조직 침투를 더 깊게 하며 광독성을 감소시킵니다.

감소된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NADH) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드(FAD)와 같은 내인성 대사 기질에서 자가형광 신호를 검출하여 무표지 MPF 현미경으로 세포 대사 정보를 캡처할 수 있습니다. 이러한 코엔자임은 뚜렷한 excitation 및 emission 스펙트럼을 나타내며, 산화 환원 비율(NADH/FAD)로 알려진 형광 강도 비율은 세포의 산화 상태를 반영합니다. Britton Chance가 1979년 레독스 비율의 개념을 처음 도입한 이래로 NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H) 및 FAD/(FAD + NAD(P)H)를 포함한 추가 비율이 제안되었습니다 6,7,8,9. MPF 이미징을 통해 이러한 광학 산화 환원 비율을 정량화하면 대사 역학에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, MPF 이미징은 변경된 신진대사를 기반으로 암세포와 정상 세포를 구별할 수 있으며, 이는 암 진단에 대한 잠재력을 입증합니다 10,11,12. 그러나 MPF 기반 자가형광 검출에는 한계가 있습니다. 케라틴과 같은 다른 고유 형광단은 형광 강도에 기여하여 스펙트럼 누화와 부정확한 신호 해석을 유발할 수 있습니다13. 또한, 산화 환원 비율은 전체 세포 산화 환원 변화만 반영하며, 둘 다 450nm에서 유사한 스펙트럼 피크를 나타내기 때문에 다른 소스(예: 세포질 또는 미토콘드리아)의 NADH 또는 NADH와 NAD(P)H를 구별하지 않습니다14.

1980 년대에 생물 의학 분야에서 처음으로 입증 된 비선형 광학 프로세스 인 SHG (Second Harmonic Generation)는 세포 구조의 무표지 이미징에 널리 활용되었습니다15 , 16 . MPF와 유사하게 SHG는 초고속 펄스 레이저에서 동일한 에너지의 두 광자를 동시에 흡수하는 것을 포함합니다. 이 광자는 재결합되어 입사광 주파수의 두 배인 새로운 광자를 방출하여 2차 고조파 신호를 감지합니다. 이러한 비선형 광학 상호 작용은 제2 고조파 신호17,18을 생성하기 위한 편광을 유도하기 위해 0이 아닌 2차 민감도를 나타내는 비중심대칭 재료에서만 발생합니다. 이로 인해 SHG는 외인성 형광 염료 15,17,19,20를 필요로 하지 않고 콜라겐, 미오신 및 튜불린과 같은 필라멘트 단백질 및 섬유소 구조를 이미징하는 데 특히 효과적입니다. 섬유증과 콜라겐의 풍부함, 뻣뻣함, 정렬 및 구조의 이상은 염증 및 암과 같은 많은 조건에서 널리 퍼져 있기 때문에 SHG는 특정 질병 상태에 대한 효율적이고 비침습적인 검출을 위한 유망한 도구입니다 21,22,23. 유방암, 난소암 및 피부암에 대한 연구를 포함한 종양학 연구에서 SHG 이미징의 광범위한 적용은 기초 연구와 잠재적인 임상 응용 모두에서 중요한 역할을 강조했습니다 24,25,26,27.

서로 다른 분자는 뚜렷한 진동 에너지 수준을 나타내며, 이는 입사광에 의해 여기될 때 다양한 정도의 비탄성 산란을 유발하며, 이는 1928년 C. V. Raman에 의해 처음 특징지어지는 현상입니다28. 이후 라만 효과는 외인성 표지 없이 분자 및 조직 구성을 검출하기 위해 광학 현미경 검사에서 광범위하게 활용되었습니다. SRS(Stimulated Raman Scattering)와 CARS(Coherent anti-Stokes Raman Scattering)는 모두 분자 진동을 응집되게 여기하고 빛의 비선형 상호 작용을 활용하여 기존의 자발적 라만 분광법에 비해 더 강력한 신호를 생성합니다. SRS 현상은 1962 년에 처음보고되었습니다29. 2008년에 이 메커니즘은 3차원 다광자 이미징에 통합되어 분자 진동 전이로 인한 펌프 및 스톡스 빔의 강도 변화를 기반으로 화학 물질을 선택적으로 검출할 수 있게 되었습니다30. 이 방법은 비공진 배경 간섭을 최소화하여 CARS를 능가하는 깨끗한 강도 신호를 생성합니다. SRS 이미징은 다중화 및 초분광 이미징을 제공하는 데 탁월하여 여러 화학 결합을 동시에 검출할 수 있고 상당한 침투 깊이를 가진 표본의 분자 구성을 고해상도로 시각화할 수 있습니다. 비교적 새로운 기술이지만 SRS 이미징은 임상 진단 및 대사 연구, 생체 내 및 체외 모두에서 효과적인 것으로 입증되었습니다 30,31,32,33,34,35,36. 예를 들어, SRS는 지질 대 단백질 비율을 정량화하여 뇌종양 침윤 조직을 피질 및 백질에서 구별할 수 있으며, 표지가 없는 비침습적 방식으로 종양 가장자리를 묘사할 수 있습니다37,38. 또한, 노화 관련 및 암 관련 질병의 특징으로 간주되는 대사 변화는 중수(D2O)로 처리된 샘플에서 탄소-중수소 결합을 검출하여 얻은 SRS를 사용하여 정량적으로 평가할 수 있으며, 단백질 합성, 지방 형성 및 기타 고분자 대사 과정의 정량적 측정이 가능합니다 31,33,34,35,36. 높은 시간 및 공간 해상도로 대사 산물을 추적할 수 있는 기능은 SRS를 질병 조사 및 진단을 위한 유망한 도구로 자리매김하고 있으며 더 광범위한 임상 응용 분야에 대한 잠재력을 가지고 있습니다.

멀티모달 이미징은 생물의학 연구에서 강력한 접근 방식으로 부상했으며, 두 개 이상의 이미징 방식을 통합하여 동일한 표본 내의 복잡한 생물학적 시스템에 대한 보다 포괄적인 이해를 얻을 수 있습니다. 2018년에는 이광자 형광(2PF), 삼광자 형광(3PF), SHG 및 3차 고조파 생성(THG)39을 통합한 무표지 자가형광 다중고조파(SLAM) 현미경 기법이 도입되었습니다. 이 접근 방식은 세포 상호 작용, 동적 프로세스 및 종양 미세환경 내의 개별 구성 요소를 동시에 시각화할 수 있도록 합니다. SLAM 현미경은 섭동을 최소화하고 샘플에 대한 레이저 출력 요구 사항을 줄여 심층 조직 프로파일링을 가능하게 하고 생체 내 모니터링을 위한 보다 안전한 방법을 제공합니다40. 고유 형광 분광법(intrinsic fluorescence spectroscopy), 확산 반사 분광법(diffuse reflectance spectroscopy) 및 라만 분광법(Raman spectroscopy)을 결합한 또 다른 다중 모드 방식은 수술 절차 중 제자리암 검출을 위해 개발되었다41. 또한 CARS, SHG 및 이광자 형광(TPF)을 통합하는 최근 설계된 다중 모드 비선형 내시경 시스템은 서브미크론 및 서브 세포 공간 해상도42에서 생물학적 샘플을 이미지화할 수 있는 기능을 입증했습니다. 결합된 2PF 및 SRS 현미경은 조직, 세포 및 소기관의 고해상도 생체 내 이미징에 유사하게 활용되었습니다 42,43,44,45. 이러한 새로운 다중 모드 이미징 기술은 개별 양식의 강점을 활용하여 해상도, 침투 깊이 및 이미지 획득 효율성을 개선하여 임상 및 수술 응용 분야에서 상당한 잠재력을 보여줍니다.

이 다중 모드 접근 방식은 개별 기술과 관련된 제한 사항을 완화하면서 더 넓은 범위의 측정을 제공하기 때문에 단일 모드 이미징보다 점점 더 선호되고 있습니다. 앞서 논의한 바와 같이, MPF는 대사 변화를 반영하기 위해 내인성 형광을 측정하고, SHG는 생물학적 샘플에서 콜라겐과 같은 비중심 대칭 구조를 이미지화할 수 있으며, SRS는 진동 모드를 기반으로 독특한 라만 신호를 생성하는 화학 결합의 높은 밀도로 인해 단백질과 지질을 주로 검출합니다. 일관성 있는 특성과 비선형 광학 특성의 공유 원리를 감안할 때, 이러한 이미징 방식은 초단파 펄스 레이저를 사용하는 단일 현미경 설정에 통합될 수 있으며, 이를 통해 국소 영역에서 다양한 바이오마커를 획득하여 생물학적 과정에 대한 보다 완전한 관점을 제공할 수 있습니다44,45. 이 백서에서는 생물 의학 연구 응용 분야를 위해 MPF, SHG 및 SRS를 통합하는 다중 모드 이미징 플랫폼을 구현하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다.

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프로토콜

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1. Label-free 멀티모달 이미징 실험

참고: 이 프로토콜은 label-free 멀티모달 이미징의 설정 및 획득 절차에 중점을 둡니다.

  1. 멀티모달 현미경 설정(그림 1A) 및 시스템 보정
    1. 레이저를 예열하고 약 15-20분 정도 기다립니다.
    2. 제어 장치와 모니터의 전원을 다음 순서로 켭니다: Control box | 터치 패널 컨트롤러 | 메인 레이저 리모컨용 AC 어댑터, 보조 레이저 리모컨용 AC 어댑터.
    3. Si 포토다이오드 검출기와 락인앰플리파이어의 전원을 켭니다.
    4. 펌프 레이저 빔과 스톡스 빔을 구성합니다. 780 nm - 990 nm, 5 - 6 ps 펄스 폭 및 80 MHz 반복률로 조정 가능한 펌프 빔으로 레이저 시스템을 설정합니다. Stokes 레이저 빔은 1,031nm의 고정 파장과 6ps 펄스 및 80MHz 반복률을 갖습니다. 펌프와 Stokes 빔이 모두 정렬 플레이트에서 볼 수 있도록 저전력(최소 20mW)인지 확인합니다.
    5. 광학 경로(레이저 상자 바로 뒤)에 하나의 정렬 플레이트를 배치하여 펌프와 스톡스 빔의 공간적 중복을 확인하고 정렬 플레이트의 중심에서 두 지점이 겹칠 때까지 미러를 조정합니다.
      참고: 펌프와 스톡스 빔이 대략적으로 겹치지만 두 레이저 빔의 공간적 겹침을 미세 조정하면 최적의 SRS 신호를 얻을 수 있습니다.
    6. 공간 중첩 후 먼저 OPO 제어 소프트웨어를 클릭하여 PSD(Position Sensitive Detector)로 미세 조정합니다. 육각 키를 사용하여 광학 미러 1(OM1)을 조심스럽게 조정하고 중심에서 최소한의 편차를 목표로 PSD 디스플레이에서 XY 위치 변경을 관찰합니다. 그런 다음 보다 정밀하게 조정하려면 위치 표시기가 PSD 디스플레이의 중앙에 올 때까지 광학 미러 2(OM2)의 육각 키를 사용합니다.
      알림: OM1 및 OM2는 레이저 정렬을 조정하기 위해 OPO 헤드에 있는 두 개의 미러입니다.
    7. 마지막으로, 두 개의 콘덴서 센터링 나사를 돌려 콘덴서를 중앙에 배치하여 조리개 다이어프램 이미지를 시야의 중앙으로 이동합니다.
      알림: 필드 아이리스 다이어프램은 대물렌즈로 들어오는 광선의 직경을 제한하여 외부 빛을 배제하여 이미지 대비를 개선할 수 있습니다.
  2. Label-free 멀티모달 이미징 획득 단계
    1. 높은 수치의 조리개(1.4NA) 오일 콘덴서에 오일을 바르고 현미경 슬라이드를 오일이 있는 콘덴서에 장착합니다. 마지막으로, 25x 물 대물렌즈의 현미경 슬라이드에 큰 물방울을 놓습니다. 현미경이 단단히 장착되고 움직일 수 없는지 확인한 다음 z s를 조정합니다.tage 생물학적 샘플의 명시야 이미지가 25x 물 대물렌즈 아래에서 볼 수 있을 때까지 초점을 조정합니다.
    2. MPF의 이미지 품질과 정확한 분석에 영향을 미치는 광표백을 방지하기 위해 MPF, SHG 및 SRS의 올바른 순서로 이미징 프로세스를 시작하십시오. MPF와 SHG 사이를 빠르게 전환하려면 펌프 빔에서 고정 스톡스 빔으로 전환하십시오.
      참고: 펌프 레이저를 800nm(NADH 및 FAD 자가형광)에서 791.3nm(CH3 라만 시프트)로 조정하는 데 1-2분이 걸릴 수 있습니다.
    3. 이미지 해상도(512 x 512 픽셀)와 각 모달리티에 적합한 체류 시간을 선택합니다. 평균 프레임이 3 이상인 MPF 및 SHG에 대해 8μs/픽셀을 사용합니다. SRS 모달리티에 대해 평균 프레임 2와 함께 40μs/픽셀을 사용합니다.
      참고: 평균 프레임은 저장하기 전에 평균화할 이미지 수를 의미합니다.
    4. MPF로 자가형광을 획득하려면 Stokes 레이저 빔을 끄고 펌프 레이저를 800nm로 조정하여 NADH 및 flavin을 자극합니다. FVOPT 필터 큐브를 NADH 및 flavin에 대해 각각 460 ± 10nm 및 515 ± 10nm의 광 경로에 설치합니다. 따라서 샘플의 전력은 약 15mW입니다.
    5. SHG를 사용하여 콜라겐 섬유 신호를 획득합니다. 펌프 레이저 빔을 끄고 스톡스 레이저 빔만 사용하고 전력을 500mW로 설정합니다. 515nm 필터와 관련된 채널만 획득합니다.
    6. SRS를 사용하여 단백질과 지질의 공간 분포를 구합니다. 두 레이저 빔을 모두 켜진 상태로 유지하고 각 분자의 특정 진동 모드와 일치하도록 레이저 빔 주파수를 조정합니다.
      참고: 일반적으로 CH3에는 791.3nm, CH2에는 797nm, 불포화 지질에는 787nm, 포화 지질에는 794.6nm가 사용됩니다. 따라서 샘플의 전력은 약 40mW입니다.
    7. SRS 초분광 이미지 데이터 세트를 획득하려면 OPO 제어 소프트웨어를 열어 스윕을 선택하고, 파장 범위를 780nm에서 806.5nm로 설정하고, 60 이상의 스택 번호를 선택합니다. 그런 다음 초분광 이미지 스택을 캡처합니다.
      참고: 결과 데이터 세트에는 60개의 이미지가 포함되어 있으며, 각 이미지는 특정 라만 이동(2,700cm-1에서 3,150cm-1까지)에서의 공간 분포를 나타냅니다. 초분광 획득 시간은 이미지의 시야(FOV) 및 스캔 시간에 따라 다르지만 512 x 512 이미지의 경우 약 5분에서 8분 사이입니다. 더 큰 이미지의 경우 2시간 후에 발생할 수 있는 광손상을 방지하기 위해 레이저 아래의 지속 시간을 최소화하도록 주의해야 합니다(샘플의 두께 및 FOV 크기에 따라 다름).
    8. 동일한 관심 영역(ROI)의 모든 이미지를 동일한 폴더에 저장합니다. 이미지 형식은 Olympus .oir 파일입니다.

2. 이미지 분석

  1. 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 저장된 모든 원시 이미지를 열고 색상을 할당하고 이미지 표시에 대한 배율 막대를 추가합니다. 또한 광학 산화 환원 비율 및 지질 불포화 분석을 위한 NADH 및 포화 지방산(SFA, 2,880cm-1) 이미지의 이진 마스크를 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
    참고: 마스크 강도가 0과 1만 있는지 확인하십시오.
  2. 집에서 빌드한 Python 스크립트를 사용하여 다운스트림 분석을 수행합니다(코드는 https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis 에서 사용 가능).
    참고: 이 스크립트는 대조군 샘플과 암 샘플 모두에서 여러 관심 영역(ROI)을 처리하도록 설계되었습니다. 스크립트의 main 기능에는 control 및 cancer image 폴더의 파일 경로라는 두 가지 입력만 필요합니다.
    1. 폴더를 반복하여 기본 이름이 같은 이미지(예: "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif")를 찾습니다.
    2. 일치하는 각 이미지 세트에 대해 스크립트가 비율계량 분석을 수행하고 이러한 계산을 기반으로 새로운 비율계량 이미지를 생성하도록 합니다.
      광학 산화 환원 비율은 flavin/(NADH + flavin)으로 계산됩니다.
      지질 불포화도는 USFAs / (SFAs + USFAs)로 계산되며, 여기서 USFAs는 불포화 지방산을 나타냅니다.
    3. 그런 다음 이미지의 모든 비율계량 값은 쉽게 조작할 수 있도록 pandas DataFrame에 저장됩니다. 일원 ANOVA를 수행하고 matplotlib를 styple "ggplot" 또는 seaborn과 함께 사용하여 정량화를 위한 barplot 또는 boxplot을 수행합니다.
    4. 2,930cm-1(CH3) 및 2,850cm-1(CH2) 이미지를 사용하여 빼낸(CH3 - CH2) 이미지를 생성합니다. 그런 다음 RGB 색 공간의 CH2 이미지 CH3 - CH2 이미지를 H&E 염색을 모방한 사용자 정의 LUT와 혼합하여 디지털 조직학 이미지46을 생성합니다.
  3. 초분광 SRS 이미지를 획득한 후 집에서 빌드한 Python 스크립트를 사용하여 k-means 클러스터링을 수행하고 스펙트럼 유사성을 기반으로 이미지를 분할합니다(코드는 https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis 에서 사용 가능).
    1. tifffile 패키지를 사용하여 .tiff 이미지 스택을 불러옵니다. SRS 초분광 이미지 스택(x, y, 스펙트럼)을 2D 배열(픽셀, 스펙트럼)로 재구성합니다.
    2. scikit-learn 패키지를 사용하여 정의된 클러스터 수로 이 2D 배열에 k-means 알고리즘을 배포합니다.
    3. 결과로 생성된 클러스터 레이블을 원래 이미지 차원으로 다시 형태 변경하여 분할 맵을 만듭니다.
    4. 각 클러스터에 고유한 색상을 할당하여 조직 내의 다양한 생화학적 조성을 나타내는 거짓 색상 이미지를 생성합니다.
    5. matplotlib를 사용하여 평균값(실선)과 표준편차(그림자 영역)를 사용하여 각 군집의 스펙트럼을 플로팅합니다
    6. MATLAB을 사용하여 PRM-SRS(PENALIZED REFERENCE MATCHING SRS) 프로토콜의 프로토콜에 따라 SRS 초분광 이미지 데이터셋47을 사용하여 공간 레이블이 없는 지질 아형을 검출합니다.
    7. 이미지를 구성하고 300dpi .tif 형식으로 저장합니다.

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결과

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그림 2의 이미지는 단백질, 총 지질, 불포화 지질 및 포화 지질에 대한 4개의 SRS 채널뿐만 아니라 FAD 및 NADH의 자가형광을 획득하기 위한 프로토콜을 따름으로써 얻은 결과를 나타냅니다. 여기에서 우리는 또한 RGB 색상 혼합을 통해 프로토콜에 설명된 대로 의사 조직학적 이미지를 생성합니다. MPF 및 SRS 채널을 획득하면 나중에 비율 계량 분석에 사용할 이미지 파일이 제공됩니다. 이 분석의 예는 인간의 폐 조직에 대한 그림 3에서 볼 수 있습니다. 프로토콜에서 이미지 획득에 이어 Python 또는 ImageJ를 활용한 이미지 분석 방법론은 개별 채널의 비율을 활용하여 정량적 대사 정보를 제공합니다. 그림 3의 지질 불포화 및 광학 산화 환원 비율 이미지에서 볼 수 있듯이, 비율계량 분석은 상대적인 대사 활성 및 분자 조성의 분포에 대한 컬러 맵을 제공합니다....

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토론

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이 멀티모달 시스템은 광범위한 생물학적 기원과 병리학적 조건에 걸쳐 샘플의 분자 환경을 전체적으로 시각화하기 위한 강력한 이미징 플랫폼입니다. 다양한 label-free 방식을 활용하는 이점은 보완적인 정보를 획득하고 단일 label-free 이미징 기술로는 어렵거나 불가능할 수 있는 특정 분석물을 표적으로 삼을 수 있다는 것입니다. 특히, 본 논문에서 언급한 세 가지 비선형 이미징 기술(SRS, MPF, SHG)은 거대분자 구성, 광학 산화 환원 비율을 통한 에너지 역학, 세포 외 기질 구성 및 형태를 포함한 구조 정보의 정량화를 가능하게 합니다 6,48,49. 또한 각 단일 이미징 방식을 개별적으로 활용하는 것과 비교하여 하나의 결합된 현미경 시스템으로 이미징하면 즉각적인 이미지 등록과 샘플 보관 시...

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공개 사항

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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인간 폐 조직 절편을 제공해 주신 Gloria Pryhuber 박사와 HuBMAP 팀원들에게 감사드립니다. 인간의 뇌 조직을 제공해 주신 Kun Zhang 박사님께 감사드립니다. 또한 쥐 간 샘플을 제공해 주신 Gen-Sheng Feng 박사님께도 감사드립니다. NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, UCSD Startup funds, Sloan Research Fellow Award 및 CZI DAF2023-328667 Award의 지원에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
460nm 필터 큐브OlympusOCT-ET 460/50M32
대역통과 필터KR ElectronicsKR27248MHz
BNC 50옴 터미네이터미니 회로STRM-50
DC 전원 공급 장치TopWard6302D
이색성 마운트ThorlabsKM100CL
FIJI ImageJ ImageJ
NA가 높은 오일 콘덴서Olympus6-U130
High O.D. 단역 통과 필터Thorlabs950nm
도립 레이저 스캐닝 현미경OlympusFV1200MPE
락인 증폭기취리히 악기
picoEmerald 레이저 시스템응용 물리학 및 전자, Inc.  동기화된 펄스 펌프 빔 (조정 가능한 720– 990  nm 파장, 5– 6  PS 펄스 폭 및 80. MHz 반복률) 및 Stokes(파장 1032  nm, 6  PS 펄스 폭 및 80. MHz 반복률)
SI 포토다이오드 검출기홈 빌트
터치 패널 컨트롤러Olympus
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참고문헌

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