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방법 논문

Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System을 사용한 자동화된 High-throughput Microbial Monoclonal Cultivation and Picking

1.9K 조회수

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DOI:

10.3791/67925

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2025년 3월 14일

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1Department of Chemical Engineering, Institute of Biochemical Engineering, Tsinghua University, 2Key Laboratory of Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Tsinghua University, 3Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd., 4Biobreeding Center, Wuxi Research Institute of Applied Technologies, Tsinghua University, 5Center for Synthetic and Systems Biology, Tsinghua University, 6Institute of Biomedical Health Technology and Engineering, Shenzhen Bay laboratory, 7Institute of Biopharmaceutical and Health Engineering, Shenzhen International Graduate School, Tsinghua University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 MISS 세포(Single-cell Microliter-droplet Culture Omics System)를 사용하여 미생물 단클론 분리, 배양 및 피킹을 수행하는 방법을 설명합니다. MISS cell은 액적 미세유체 기술을 기반으로 하는 통합 워크플로우를 달성하며, 이는 우수한 액적 단분산성, 높은 병렬 배양 및 고처리량 바이오매스 검출을 제공합니다.

초록

순수한 박테리아 배양은 미생물 배양체학 연구에 필수적입니다. 고체 플레이트, 웰 플레이트 및 마이크로 반응기를 기반으로 하는 기존 방법은 번거로운 절차와 낮은 처리량으로 인해 방해를 받아 미생물 배양체학 연구의 빠른 진행을 방해합니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 당사는 미생물 단클론 분리, 배양 및 스크리닝을 위해 액적 미세유체 기술을 활용하는 자동화된 고처리량 플랫폼인 단일 세포 마이크로리터 액적 배양 오믹스 시스템(MISS cell)을 성공적으로 개발했습니다. 이 시스템은 많은 수의 단세포 방울을 생성하고 짧은 시간에 단클론 콜로니를 배양, 스크리닝 및 수집할 수 있어 미생물 분리에서 채취에 이르는 통합 프로세스를 촉진할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 인간 장내 미생물군의 분리 및 배양을 예로 들어 그 응용을 시연하고 고체판 배양 방법을 사용하여 미생물 분리 효율, 단클론 배양 성능 및 스크리닝 처리량을 비교했습니다. 실험 워크플로우는 간단했고 시약 소비량은 매우 낮았습니다. 고체판 배양 방법과 비교하여 MISS 세포는 더 다양한 장내 미생물군 종을 배양할 수 있어 미생물 배양체학 연구에 상당한 잠재력과 가치를 제공할 수 있습니다.

서론

미생물 배양체학은 식품 산업의 유익한 미생물, 환경 미생물의 다양성, 새로운 항균 화합물 스크리닝 및 질병과 관련된 인간 마이크로바이옴 연구에 광범위하게 응용됩니다 1,2,3,4. 주로 고체 플레이트, 웰 플레이트 또는 마이크로 반응기를 기반으로 단클론 콜로니를 획득하고 선별하는 기존 방법은 작동이 쉽지만 여러 단계로 인해 처리량이 낮다는 단점이 있습니다. 이러한 한계는 미생물 돌연변이 유발 스크리닝, 미생물 배양체학 연구 및 고생산 콜로니 선택과 같은 응용 분야에 방해가 되며, 이 모든 것은 광범위한 단클론 스크리닝을 필요로 합니다.

최근에는 미생물 시료의 처리 속도를 크게 향상시키는 동시에 노동력을 줄이고 수동 처리로 인한 오류를 최소화하기 위해 다양한 단일 세포 검출 및 분주 장치가 설계되었습니다5. 그러나 이러한 기기는 일반적으로 기존 방법 내에서 특정 단계만 처리하므로 광범위한 장비 통합이 필요하고 상당한 공간을 차지하며 높은 비용이 발생하는 경우가 많습니다. 따라서 위에서 언급한 단점을 보완하기 위해 저렴하고 보편적으로 적용 가능한 미생물 배양 및 스크리닝 플랫폼을 개발해야 할 긴급한 필요성이 있었습니다.

이전 연구에서는 단일 세포 마이크로리터 액적 배양 오믹스 시스템(MISS cell, 이하 "오믹스 시스템"이라고 함)으로 알려진 자동화된 고처리량 스크리닝 플랫폼을 성공적으로 개발했습니다6. 이 플랫폼은 액적 미세유체 기술을 활용하며, 이는 미생물 분리, 배양 및 피킹 7,8,9,10에서 자동화 및 통합을 달성할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다. Omics 시스템은 샘플링 모듈, 미세유체 칩, 액적 검출 및 수집 시스템을 포함한 여러 핵심 모듈로 구성되어 미생물학 연구에서 효율적인 단일 세포 분리, 배양, 단클론 스크리닝 및 수집을 가능하게 합니다. 당사는 이미 Omics 시스템을 활용하여 Corynebacterium glutamicum6의 고처리량 돌연변이 유발 스크리닝을 달성했습니다.

Omics 시스템의 자동화 및 고처리량 스크리닝 기능으로 인해 이를 미생물 배양체학에 적용하면 많은 양의 미생물 데이터를 빠르게 얻을 수 있을 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜에서는 미생물 단세포 분리, 배양, 단클론 검출 및 스크리닝 과정을 입증하기 위해 인간 장내 미생물총(human gut microbiota)의 분리 및 배양을 예로 들어 MISS 세포의 상세한 운영 절차를 소개했습니다. Omics 시스템의 작동은 간단하며, 연구원들은 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 순차적 설치, 매개변수 설정 및 시료 준비를 위해 소프트웨어 지침을 따르기만 하면 됩니다.

소프트웨어 작동 인터페이스에서 Omics 시스템은 격리, 배양 및 스크리닝의 세 가지 주요 기능으로 나뉩니다. 연구원은 실험에 따라 다른 단계를 선택할 수 있습니다. 또한 액적 스크리닝 단계에서 연구원은 형광 신호 또는 광학 밀도의 두 가지 검출 모드 중에서 선택할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 액적 스크리닝 프로세스의 실시간 시각화를 제공합니다. 마지막으로, 연구원들은 특정 실험 요구 사항에 따라 배양 조건, 검출된 파장 및 수집 웰 수와 같은 매개변수를 구성할 수 있는 유연성을 갖게 되며, 다른 작업을 수행하기 위해 언제든지 기기를 일시 중지할 수 있습니다. MISS cell은 미생물 친화적이고 처리량이 많은 단클론 스크리닝 플랫폼으로, 조작이 간단하고 시약 소비가 최소화되어 있습니다.

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프로토콜

모든 연구 절차는 모든 관련 윤리 규정을 준수합니다. 절차는 칭화대학교 과학기술윤리위원회(Science and Technology Ethics Committee)의 승인을 받았습니다. 인간의 장내 미생물군을 연구하기 위해, 대변 샘플은 심각한 의학적 상태가 없는 건강한 성인으로부터 채취되었으며, 성인은 서면 동의서를 제공했습니다.

1. 기기 설치

  1. Omics 시스템 기기를 깨끗하거나 멸균된 환경(예: 멸균실 또는 무산소 벤치)에 놓습니다. 기기는 정밀 장치이며 시설에 배치할 때 다음 사항을 고려하십시오.
    1. 기기를 정상 압력과 온도로 유지하십시오.
    2. 기기를 강한 전기장, 자기장 및 방열원에서 멀리 두십시오.
    3. 기기 배치 영역이 2,500mm(D) x 1,500mm(W) x 2,000mm(H)의 치수를 초과하는지 확인합니다.
    4. 기기의 환경 습도를 60% 미만으로 유지하십시오.

2. 준비 사항

  1. Omics 시스템, 컴퓨터 및 Omics 시스템 운영 소프트웨어의 전원을 순차적으로 켭니다.
  2. MISS 세포 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩 설치:
    1. 액적 발생 및 배양실(그림 1A)의 도어를 열고 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 보호 덮개를 수직으로 제거합니다. 일회용 주사기를 사용하여 액적 배양 챔버 내부의 가습기에 멸균 증류수 10mL를 추가하고(그림 1C) 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩용 보호 덮개를 다시 설치합니다.
    2. 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 멸균 포장을 열고 배양실 바로 위에 수직으로 놓습니다(그림 1C).
    3. 소프트웨어 인터페이스에서 Installation(설치 )을 클릭합니다(그림 2A). 이때 'Confirm the replacement of micro-tubing and droplet generation microfluidic chip?' 프롬프트와 함께 팝업 창이 나타납니다. 예를 클릭하여 설치를 시작합니다.
    4. 기포 제거제를 꺼내 액적 발생 및 배양실의 기포 제거제 배치에 거꾸로 고정합니다. 기포 제거제의 물방울 흡입구 및 배출 튜브를 누르지 않도록 주의하십시오(그림 1E).
    5. 기포 제거제의 비말 배출 튜브를 그 아래의 클램핑 밸브에 부착하고 비말 감지 및 수집 챔버로 향하는 구멍을 통과하도록 합니다(그림 1B).
    6. 비말 감지 및 수집 챔버의 도어를 열고 비말 배출 튜브에 이미 연결된 감지 튜브를 감지 소켓에 수직으로 삽입하고 감지 튜브가 완전히 삽입되었는지 확인합니다(그림 1D).
      알림: 감지 튜브를 삽입할 때 튜브가 구부러지지 않도록 수직으로 삽입하십시오.
    7. 감지 튜브를 시계 방향으로 고정하는 나사를 조입니다. 검출 튜브가 완전히 삽입되어 고정되었는지 확인한 후 비말 감지 및 채취 챔버의 도어를 닫습니다.
    8. 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩에는 10개의 실리콘 튜브가 있으며 각 튜브에는 숫자(L01-L10)가 표시되어 있습니다. 레이블이 지정된 각 튜브를 해당 번호가 매겨진 CL에 연결합니다.amp 밸브(01-10)(그림 1C).
    9. 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 퀵 커넥터를 Omics 시스템의 해당 포트(C1 - O1, C2 - O2, C4 - O4, CF - OF)에 연결합니다.
      알림: 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 설치가 완료되었습니다. C3는 O3에 연결할 필요가 없습니다.
    10. 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩 설치가 완료되면 액적 튜빙 클램핑 밸브가 열렸다는 팝업 창이 나타납니다. 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩 설치가 완료되면 확인을 클릭합니다. 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 모든 실리콘 튜브가 해당 클램프 밸브에 부착되었는지 확인한 후 확인을 클릭합니다.
  3. 기기 초기화
    1. 초기화를 수행하기 전에 설정 인터페이스(그림 2B)를 클릭하여 관련 매개변수를 구성합니다. 감지 모드(OD 기반 또는 형광 기반 감지; 여기서 OD), 배양 온도(37°C) 및 시간(30일 = 720시간), 교반기 속도(20rpm), OD 검출 파장(600nm), 형광 검출의 여기 및 방출 파장.
      참고: 이 프로토콜에서 인간 장내 미생물총(human gut microbiota)의 분리 및 배양에 사용되는 매개변수는 괄호 안에 표시되어 있습니다. 매개변수를 설정할 때 배양 온도는 5°C에서 50°C 사이여야 합니다. 감지 모드를 선택할 때 방울 감지 모듈의 파이버가 동일하지 않은 경우 광섬유를 교체해야 합니다(2.3.2단계 참조). 파라미터를 구성할 때 오일상 기준 값(기본 스펙트럼)은 소프트웨어에 의해 자동으로 식별되므로 수동 조정이 필요하지 않습니다.
    2. 감지된 광섬유의 교체
      1. 광섬유 홀더에서 감지된 광섬유를 제거하고(시계 반대 방향으로 나사 풀기) 액적 모듈의 광섬유 고정 나사를 풉니다(그림 1D).
      2. 광섬유를 사용하지 않을 경우 모듈에서 광섬유를 제거하고 광섬유 홀더에 삽입한 다음 조입니다. 감지된 광섬유를 감지 포트에 삽입하고 모듈의 광섬유 고정 나사를 조입니다. 광섬유 교체가 완료되었습니다.
    3. 홈 인터페이스로 전환하고 초기화를 클릭하면 Omics 시스템이 주입 펌프, 온도 설정, 폐액 배출 테스트, 스크리닝 모듈 및 액적 감지 모듈을 포함한 구성 요소에 대한 자체 검사를 수행할 수 있습니다.
      1. 초기화하는 동안 폐액 포트에 1mL의 75% 알코올을 주입하고 액체가 정상적으로 배출되는지 관찰하여 액적 감지 모듈에서 폐액 배출 테스트를 수행합니다.
      2. 스크리닝 모듈 테스트의 경우 플레이트 배치에 96웰 플레이트를 놓고 플레이트 이동이 정상인지 관찰합니다.

3. 액적 생성

  1. 인간 장내 미생물군 샘플의 수집 및 처리
    1. 챔버 냄비와 대변 용기를 준비하고, 손을 씻고, 장갑을 착용하여 새로운 대변 샘플을 수집합니다.
      알림: 대변 샘플을 채취할 때 가능한 한 소변 오염을 피하십시오. 미리 소변을 보고 대변을 깨끗하고 건조한 용기에 넣는 것이 좋습니다.
    2. 적당량의 중간 분절 대변을 무균적으로 수집하고 멸균된 cryovials(바이알당 약 3-5g)로 밀봉합니다. 후속 부분 표본 및 라벨링을 위해 바이알을 즉시 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 대변 샘플이 크거나 즉시 채취할 수 없는 경우 최대 2시간 이내에 채취해야 합니다.
    3. 혐기성 벤치에서는 멸균 면봉 또는 대변 샘플링 도구를 사용하여 중간 세그먼트 샘플을 수집합니다.
      알림: 대변의 표층에는 장 점막 세포가 벗겨져 외부 오염이 발생하기 쉽습니다. 공기에 노출된 후 일부 미생물 DNA가 분해되기 시작합니다.
    4. 수집된 대변 샘플을 2mL 멸균 마이크로 원심분리기 튜브 또는 멸균 냉동 튜브로 옮기며, 각 튜브에는 0.5-2.0g의 대변이 들어 있습니다. 샘플당 동결을 위해 2개의 부분 표본을 준비합니다.
    5. 신선한 대변 샘플을 멸균 생리식염수에 재현탁하고, 각 100mg의 대변을 1mL의 용액에 희석합니다. 큰 입자가 보이지 않을 때까지 대변을 철저히 섞으십시오.
    6. 10분 자연 침강 후 200mesh(0.075mm), 400mesh(0.038mm), 800mesh(0.018mm)의 공극 크기의 멸균 메쉬 필터를 통해 상층액을 순차적으로 여과하여 소화되지 않은 음식물과 작은 입자상 물질을 제거합니다. 마지막으로 멸균 원심분리기 튜브에 여과액을 수집합니다.
    7. 여과된 대변 현탁액 10μL를 취하고 혈구계와 도립 형광 현미경을 사용하여 미생물 농도를 측정합니다.
      참고: 다양한 메쉬 크기를 통해 배설물 샘플 상층액을 필터링한 후 일부 더 작은 배설물 입자가 남아 있습니다. 따라서 미생물 농도를 결정할 때 현미경으로 관찰된 활성 입자는 미생물로 간주되며, 이는 미생물 농도의 대략적인 계산만 허용합니다.
    8. 분변 현탁액을 1.5mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고 날짜, 미생물 농도 및 검체 이름을 표시합니다. 일부는 후속 실험을 위해 남겨두고 나머지는 나중에 사용할 수 있도록 4°C에 보관하십시오.
      참고: 샘플 정보(샘플 이름, 수집 시간)를 즉시 기록하여 샘플이 동시에 수집되도록 합니다(포유류 장내 미생물 측두리 리듬 변화 고려). 전체 샘플 수집 및 처리는 혐기성 환경에서 수행되어야 합니다.
  2. 초기 분변 현탁액에 대한 준비
    1. 제조사의 프로토콜에 따라 뇌 심장 육수(BHI) 배지를 준비하고 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 살균합니다.
    2. 3.1.8 단계에서 분변 현탁액을 취하고 BHI 배지로 연속 희석을 수행하여 ~50 cells/mL의 농도를 달성합니다.
      참고: 샘플 병을 채우려면 최소 40mL의 배설물 현탁액을 준비하십시오.
    3. 작은 자기 교반 막대가 바닥에 있는지 확인하고 희석된 배설물 현탁액을 샘플 추가 위치까지 샘플 병에 붓습니다. 캡을 조이고 조입니다. 그런 다음 퀵 커넥터 A를 퀵 커넥터 B에 삽입하여 샘플 로딩 프로세스를 완료합니다(그림 3A).
    4. 샘플 병을 지정된 위치에 놓고 샘플 병에서 퀵 커넥터 A와 B를 분리합니다. 샘플 병의 퀵 커넥터 A를 Omics 시스템의 O3 포트에 연결하고 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩의 C3 커넥터를 퀵 커넥터 B에 연결합니다. 액적 발생 및 배양 챔버의 도어를 닫습니다(그림 3B).
  3. 액적 생성
    1. 소프트웨어의 홈 인터페이스에서 생성할 액적 튜브의 원하는 수를 선택합니다(그림 2A).
      참고: 각 실행은 최대 10개의 액적 튜브를 생성할 수 있으며 각 튜브는 약 5,000개의 액적을 생성합니다.
    2. 소프트웨어의 홈 인터페이스에서 Produce를 클릭하여 단일 세포 액적 생성을 시작합니다.
      알림: 폐액 펌프의 배출 펌프가 작동하는지 확인하십시오. 액적 생성 동안 각 액적의 부피는 2.0μL입니다. 액적 생성에 대한 설명은 토론 섹션을 참조하십시오.
    3. 방울 생성이 완료되었음을 알리는 신호음 알람이 울릴 때까지 기다립니다. CL을 닫습니다.amp C3 커넥터(그림 1E)의 amp s를 제거합니다.amp르 병.

4. 액적 재배

  1. 소프트웨어의 홈 인터페이스에서 액적 생성 중과 동일한 액적 튜빙 번호를 선택하고 배양을 클릭하고 배양 시간과 온도를 확인하고 프로세스를 시작합니다. 재배 진행 상황과 남은 시간을 보여주는 홈 인터페이스의 진행률 표시줄을 모니터링합니다.
  2. 물방울 재배가 완료되었음을 알리는 신호음 알람이 울릴 때까지 기다립니다. 재배 시간을 연장해야 하는 경우 설정 인터페이스에서 직접 시간을 조정하십시오.

5. 비말 스크리닝

  1. Omics 시스템의 UV 버튼을 눌러 자외선(UV)을 켜고(그림 1A) 액적 검출 및 수집 챔버를 30분 동안 조사한 다음 UV 광선을 끕니다.
    알림: UV 광선을 켜기 전에 비말 감지 및 수집 챔버의 도어가 닫혀 있는지 확인하십시오.
  2. 매우 깨끗한 벤치에서 비말을 수집하는 데 사용되는 모든 96웰 플레이트를 열고 뚜껑 없이 서로 겹쳐 쌓고 아래에서 위로 순차적으로 번호를 매깁니다. 상단 웰 플레이트가 뚜껑으로 덮여 있는지 확인하십시오.
    참고: 각 실행은 최대 10개의 96웰 플레이트를 수용할 수 있으며 플레이트 수는 총 액적 수에 따라 다릅니다.
  3. 액적 감지 및 수집 챔버의 도어를 열고 웰 플레이트를 지정된 위치에 배치하고(그림 1D), 상단 웰 플레이트에서 뚜껑을 꺼내고 챔버의 도어를 닫습니다.
  4. Omics 시스템의 UV 조명을 30분 동안 켜서 2차 살균을 수행합니다.
  5. 기포 제거제 설치
    1. 배치 위치에서 기포 제거기를 제거하고 캡의 나사를 풀고 캡에서 나비 모양의 나사를 제거합니다(그림 3C).
    2. 기포 제거제에 기포 제거유 200mL를 붓고 오믹스 시스템의 기포 제거제 캡으로 병을 단단히 조인 다음 기포 제거제 위치에 제거제를 거꾸로 고정합니다. 기포 제거제의 설치가 완료되었습니다.
      알림: 배치에 기포 제거제를 고정할 때 오일이 누출되지 않는지 확인하십시오. 누출이 발생하면 뚜껑을 조이십시오.
  6. 홈 인터페이스에서 분류할 액적 튜빙을 선택하고, Sorting(정렬)을 클릭하고, 수집할 웰 플레이트의 수를 입력한 다음 프로세스를 시작합니다. 액적 스크리닝이 시작된 후 액적 광학 밀도(OD) 또는 형광 값의 실시간 측정값을 보여주는 프로세스 디스플레이 영역을 관찰합니다.
  7. 약 20-30개의 액적을 분석하여 OD 값을 확인합니다. 예를 들어, 대다수가 빈 방울의 OD 값에 해당하는 ~0.2의 OD 값을 갖는 것으로 확인되면 푸아송 분포를 기반으로 낮은 OD 임계값 을 0.5로, 상위 OD 임계값 을 4.0으로 설정합니다. 이 범위 내의 액적은 자동으로 96웰 플레이트에 수집됩니다(그림 4A).
    참고: Beer-Lambert 법칙에 따라 빈 액적의 OD 값은 액적 내 배양 배지 조성에 의해 결정됩니다. 일반적으로 낮은 OD 임계값은 빈 방울과 미생물을 포함하는 방울을 명확하게 구분하기 위해 빈 방울의 OD 값보다 0.2-0.3 단위 높게 설정됩니다.
  8. 비말 선별 및 수집이 완료되었음을 알리는 신호음 알람이 울릴 때까지 기다립니다. 액적 감지 및 수집 챔버의 도어를 열고 웰 플레이트 뚜껑을 상단 웰 플레이트에 놓은 다음 챔버에서 모든 웰 플레이트를 함께 꺼내 후속 시퀀싱 및 백업을 수행합니다.

6. 데이터 내보내기 및 히트맵 표시

  1. Export data(데이터 내보내기)를 클릭하여 수집된 액적 신호 데이터를 저장합니다(그림 4A,B).
  2. 히트 맵을 클릭하고 액적 수집 데이터 파일을 선택하고 소프트웨어에 의해 표시되는 마이크로 플레이트에 수집된 액적의 OD 값을 관찰합니다. 이러한 OD 값을 히트맵으로 시각화하며, 여기서 색상 강도는 웰 전체의 OD 분포에 해당하여 수집된 단클론 OD 값을 명확하고 직관적으로 표현합니다(그림 4A,C).

7. MISS 셀 청소

  1. 실험을 완료한 후 세척이 필요한 액적 튜브를 선택하고 Clean(세척 )을 클릭하여 기기 세척을 시작합니다.

8. 미생물 단클론 백업 및 염기서열분석 시료 준비

  1. 염기서열분석 시료 전처리
    1. 혐기성 벤치에서 수집된 액적 플레이트의 각 웰에 100μL의 BHI 배지를 추가하고 피펫팅으로 잘 혼합한 다음 각 웰에서 10μL를 취하여 모두 하나의 15mL 멸균 튜브로 옮깁니다. Vortex를 사용하여 혼합 미생물 현탁액을 얻습니다.
    2. 혼합된 미생물 현탁액에 인산염 완충 식염수 5mL를 첨가하고 1,000× g 에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고 미생물 펠릿을 액체 질소에 넣어 급속 동결합니다. 염기서열분석 시료 준비가 완료되었습니다.
    3. 16S rDNA의 V3 및 V4 도메인을 표적으로 하는 16S rDNA 앰플리콘 염기서열분석 방법을 사용합니다. 사용된 특정 염기서열분석 프라이머는 다음과 같습니다: 341F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA 및 806R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT.
  2. 미생물 단클론 시료 동결 보존:
    1. 액적 플레이트의 각 웰에서 샘플 10μL를 수집한 후(단계 8.1.1에서) 각 웰에 30μL의 글리세롤을 추가합니다. 미생물 균주 보존을 위해 플레이트를 -80 °C 이하로 놓습니다.

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결과

우세한 미생물 군집을 구성하는 인간의 장내 미생물총(microbiota)은 장에 약 4 ×10 13 미생물을 보유하고 있는 것으로 추정되며, 이는 그 엄청난 수와 복잡한 구성을 보여줍니다11. 본 연구에서는 장내 미생물총(microbiota)을 분리 및 배양하는 것을 목표로 했으며, MISS 세포의 고처리량 성능을 입증하기 위해 고체판 분석법을 대조군으로 사용했습니다.

먼저, 동일한 분변 현탁액을 사용하여 두 방법의 단일 세포 분리 처리량을 비교했습니다. MISS 세포에서는 낮은 미생물 농도를 사용했는데, 여기서 물방울 내 미생물의 분포 확률은 푸아송 분포를 기반으로 계산할 수 있습니다: P(λ,x) = λx e-λ/x!, 여기서 λ 는 물방울 위의 평균 세포 수이며, 이는 미생물 농도와 물방울 부피를 곱하여 계산할...

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토론

이 프로토콜은 자동화된 고처리량 미생물 단클론 분리, 배양, 검출 및 수집을 위한 MISS 세포의 작동을 간략하게 설명합니다. 장내 미생물총(microbiota)의 ~20%-30%만 분리 및 배양할 수 있는 기존 방법과 비교했을 때, 2,12, 오믹스(Omics) 시스템을 사용하여 얻은 단클론 클론의 수는 고체 플레이트에서 얻은 것보다 1.97배 더 높았습니다. 이 비교는 MISS 세포가 단일 세포 분리, 단클론 배양 및 스크리닝에서 이점이 있음을 보여줍니다.

단일 세포 분리를 위해 Omics 시스템은 푸아송 분포에 따라 단일 세포 액적을 얻었으며, 이는 우수한 단클론성을 보장했습니다. 또한 Omics 시스템은 최대 5,000 액적/h의 속도로 액적을 생성하여 고처리량 단일 세포 분리를 가능하게 하는 동시에 작은 액...

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공개 사항

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 광동성 중점 지역의 연구 개발 프로젝트(2024B1111130002), 허베이성 연구 개발 프로젝트(22375503D) 및 산업 미생물학 분자 육종을 위한 안후이 공학 연구소 개설 프로젝트(Grant ELMB-07)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 mm 페트리 접시Merck KGaA, 다름슈타트, 독일P5731-500EA고체 플레이트 준비
용 30 mL 대변 용기Boen Healthcare Co., Ltd611101대변 샘플 수집
용 37 ° C 항온 인큐베이터Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd.LRH-150인큐베이터에서 단단한 판 배양
96-well Clear Flat Bottom 폴리스티렌 TC 처리 된 마이크로 플레이트Corning3599우물 플레이트 움직임 감지 및 액적 수집
용 AgarBecton, Dickinson and Company214010솔리드 플레이트 준비
용 기포 제거 오일Luoyang Tmaxtree Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S-oil물방울 스크리닝 중 기포 제거제의 오일
기포 제거제Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-S물방울 감지 및 수집을 수행하기 전에 물방울 사이의 가스 상태를 제외
혐기성 벤치아르곤 및 질소 공간 장비 사업 부서, Haiyu Town, Changshu CityVGB-4CM 무균 작동 및 혐기성 조건에서 UV 살균용
공급자:AutoclavePuhexi Healthand Medical Equipment Co., Ltd.MLS-830LBHI 매체, EP 튜브 등을 오토클레이브합니다.
뇌 심장 주입 (BHI) 국물칭다오 하이테크 산업 단지 Haibo Biotechnology Co., LtdHB8297-1BHI 매체의 구성 요소
성분 목록 :
증류수
세포 살포기Merck KGaA, 다름슈타트, 독일HS8151고체 플레이트
원심 분리기 튜브, 15 mLBeijing Xinhengyan Technology Co., LtdHB53397미생물 용액 준비용
컴퓨터LenovoE450소프트웨어 설치 및 MISS 세포 제어
CryovialThermo Fisher2.0 mL대변 보존용
증류수Beijing Mreda Technology Co., Ltd.M306444-100ml액적 배양 챔버의 습도를 유지하기 위해 가습기에 첨가
EP 튜브 ThermoFisher2.0 mL대변 샘플 수집용
형광 도립 현미경Olympus Life Science(LS)CKX53미생물 농도 확인 및 계산
글리세롤GENERAL-REAGENTG66258A균주 보존용
혈구계AcmecAYA0810-1ea미생물 농도
계산A442876인산염 완충 식염수(PBS 용액)의 구성 요소성분 목록: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4
> 증류수 KH2PO4MACKLINP815661인산염에 의하여 완충된 염분 (PBS 해결책)의 성분성분 명부: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 증류수 메시 여과기에서 0.24 g KH2PO4
Anping Jiufeng 철망사 제조 Co., Ltd200 메쉬 (0.075 mm), 400 메쉬 (0.038 mm), 800 메쉬 (0.018 mm) 대변 샘플에서 소화되지 않은 음식과 더 작은 입자상 물질을 제거합니다
마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세유체 칩Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISC-B2액적 생성 및 액적 배양용
MISS 셀오일낙양 TMAXTREE 생명 공학 Co., Ltd.미스 세포 BOS-B작은 물방울 microfluidics를 위한 기름 단계
미스 세포 소프트웨어뤄양 TMAXTREE 생명 공학 Co., 주식 회사.MISS cell V3.2.4MISS cell instrument
Na2HPO4SolarbioD7292인산염 완충 식염수(PBS 용액)의 구성 요소에 대한 실험 작업 성분 목록: 8 g/L NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 증류수
NaClGENERAL-REAGENTG81793J생리적 식염수 용액의 구성 요소
성분 목록 :
증류수
피펫eppendorf2.5 &mu에 9g / L NaCl; L, 10 &뮤; L, 100μ L, 1000μ L액체 취급
폴리테트라플루오로에틸렌 튜브Shenzhen WOER 열수축 재료 Co., Ltd.3401000141액적 배양용. 이 물질은 이미 마이크로 튜빙 및 액적 생성 미세 유체 칩
샘플 병Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.에MISS cell-bottle미생물 용액 샘플링
Single Cell Microliter-droplet Culture Omics System (MISS cell)뤄양 TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.MISS cell-G3f미생물 단클론 분리, 배양, 탐지 및 수집 수행
Superspeed CentrifugeThermo FisherSorvall Lynx 4000 염기서열분석을 위한 미생물 용액 준비
주사기Jiangsu Zhiyu Medical Instructment Co., Ltd10 mL증류수를 뽑아 가습기에 주입하십시오. 물방울 배양 챔버의
초저온 냉장고SANYO 초저온 MDF-U4086S 변형률 보존용(-80 ° 다)
. 포함되었습니다.

참고문헌

  1. Hurst, C. J. Isolation and cultivation of bacteria. The structure and function of aquatic microbial communities. , Springer International Publishing. Cham. 313-351 (2019).
  2. Xu, M. Q., Pan, F., Peng, L. H., Yang, Y. S. Advances in the isolation, cultivation, and identification of gut microbes. Mil Med Res. 11 (1), 34(2024).
  3. Lattermann, C., Büchs, J. Microscale and miniscale fermentation and screening. Curr Opin Biotechnol. 35, 1-6 (2015).
  4. Huang, Y., et al. High-throughput microbial culturomics using automation and machine learning. Nat Biotechnol. 41 (10), 1424-1433 (2023).
  5. Brehm-Stecher Byron, F., Johnson Eric, A. Single-cell microbiology: Tools, technologies, and applications. Microbiol Mol Biol Rev. 68 (3), 538-559 (2004).
  6. Jian, X., et al. Single-cell microliter-droplet screening system (miss cell): An integrated platform for automated high-throughput microbial monoclonal cultivation and picking. Biotechnol Bioeng. 120 (3), 778-792 (2023).
  7. Hu, B., et al. One cell at a time: Droplet-based microbial cultivation, screening and sequencing. Mar Life Sci Technol. 3 (2), 169-188 (2021).
  8. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. J Mol Biol. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  9. He, Z., Wu, H., Yan, X., Liu, W. Recent advances in droplet microfluidics for microbiology. Chinese Chemical Letters. 33 (4), 1729-1742 (2022).
  10. Kaminski, T. S., Garstecki, P. Controlled droplet microfluidic systems for multistep chemical and biological assays. Chem Soc Rev. 46 (20), 6210-6226 (2017).
  11. Sender, R., Fuchs, S., Milo, R. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell. 164 (3), 337-340 (2016).
  12. Simrén, M., et al. Intestinal microbiota in functional bowel disorders: A rome foundation report. Gut. 62 (1), 159-176 (2013).
  13. Periyannan Rajeswari, P. K., Joensson, H. N., Andersson-Svahn, H. Droplet size influences division of mammalian cell factories in droplet microfluidic cultivation. Electrophoresis. 38 (2), 305-310 (2017).
  14. Jian, X., et al. Microbial microdroplet culture system (mmc): An integrated platform for automated, high-throughput microbial cultivation and adaptive evolution. Biotechnol Bioeng. 117 (6), 1724-1737 (2020).
  15. Baret, J. -C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
  16. Kubie, L. S. The solubility of O2, CO2, and N2 in mineral oil and the transfer of carbon dioxide from oil to air. J Biol Chem. 72 (2), 545-548 (1927).
  17. Poon, C. Measuring the density and viscosity of culture media for optimized computational fluid dynamics analysis of in vitro devices. J Mech Behav Biomed Mater. 126, 105024(2022).
  18. Yao, J., Lin, F., Kim, H. S., Park, J. The effect of oil viscosity on droplet generation rate and droplet size in a t-junction microfluidic droplet generator. Micromachines. 10 (12), 808(2019).
  19. Venkateshwarlu, A., Bharti, R. P. Effects of capillary number and flow rates on the hydrodynamics of droplet generation in two-phase cross-flow microfluidic systems. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 129, 64-79 (2021).
  20. Nekouei, M., Vanapalli, S. A. Volume-of-fluid simulations in microfluidic t-junction devices: Influence of viscosity ratio on droplet size. Physics of Fluids. 29, 032007(2017).

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